CN103766222B - 甜叶菊组织培养方法及其培养基 - Google Patents
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Abstract
甜叶菊组织培养方法及其培养基本发明涉及甜叶菊的组织培养繁殖方法及其培养基，尤其是涉及以甜叶菊叶片为外植体直接成芽的组织培养快繁方法。甜叶菊组织培养方法，包括以下步骤：(1)外植体采集，(2)消毒接种，(3)增厚诱导培养，(4)出芽成苗，(5)转接生根，(6)炼苗移栽。本发明提供的甜叶菊组织培养方法，取材容易，可以迅速扩繁出大量种源，外植体组织培养没有愈伤组织细胞增殖分化这一培养阶段，缩短了培养时间，并且有极高的增殖率，易操作，可大规模生产，且培养过程便于遗传转化等研究的操作。本发明所提供的培养基，确保叶片在各个阶段能达到预期培养目标。
Description
技术领域
本发明涉及甜叶菊的组织培养繁殖方法及其培养基，尤其是涉及以甜叶菊叶片为外植体直接成芽的组织培养快繁方法及其培养基。
背景技术
菊科植物甜叶菊Stevinrebaudiann，Bertoni，以下称甜叶菊，是原产于南美洲巴拉圭的菊科甜叶菊属多年生草本植物，由于甜叶菊所含的甜菊糖苷有制血糖、降低血压、促进新陈代谢以及治疗糖尿病、肥胖症、调节胃酸、恢复神经疲劳的功效，并且物理、化学性质稳定，无发酵性特点，其制品有比较长的保质期，特别适合作为糖尿病、高血压等病患者食品的甜味剂、保健品添加剂等，具有广阔的市场前景和应用范围。
自我国于20世纪70年代年引种甜叶菊并成功扩大种植以来，已经有30余年的历史，但由于甜菊的繁育特性，传统的繁殖方式包括种子、扦插方式。但是用种子繁育的方法，成活率低；而扦插繁殖导致品质退化，并且这两种繁育方式时间长、需要大量以茎尖、带腋芽的茎段、种子等材料。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种新的繁育方式和培养基，采用叶片为外植体，通过组织培养技术，并在不经历愈伤组织培养的阶段直接出芽成苗，大大缩短培养时间，且外植体来源受限小，增殖率高，短期内可获得大量种苗。具体的技术方案为：
甜叶菊组织培养方法，包括以下步骤：
(1)外植体采集
对于室外栽培的植株，选取无病、虫损害的甜叶菊植株，采摘植株顶端第一、二对已经完全展开，但未老熟的叶片作为外植体；
对于无菌组培苗，可使用长势良好、健康的组培苗的所有叶片；
(2)消毒接种
采摘自室外栽培植株的叶片用流水冲洗30分钟，在超净工作台上用75％酒精处理6～8秒后再用0.1％升汞浸泡8分钟，倒去升汞溶液，用无菌水冲洗4～5次，每次不少于半分钟，然后用无菌纸吸干表面水分并避免相互重叠，并接种到增厚诱导培养基中；
组培苗叶片可不经消毒，在无菌条件下采摘后直接接种；
接种时将完整的叶片正面接触增厚诱导培养基表面，若接种时叶片还存有叶柄，则将叶片基部弯曲，叶柄插入增厚诱导培养基，并保持叶片接触培养基；
(3)增厚诱导培养
叶片接种到增厚诱导培养基上后，培养至7～9天后叶片出现肉质增厚，叶片肉质增厚特征表现为，叶片增厚，表面密布透明颗粒，叶片质地脆而易断；
(4)出芽成苗
将第(3)步所得的肉质增厚叶片转接进入出芽成苗诱导培养基，在无菌培养室内，先完全遮光暗培养1周，再光培养1～2周后，叶片开始在中脉两侧或叶尖长出紫红色的芽，每片叶片出芽个数约8～14个，每一个芽经继续培养后颜色转绿，并单独成一株再生苗，待苗生长至高3～5cm后进入下一步骤；
(5)转接生根
将3～5cm高的苗相互分开成单株，保证每株苗有叶片5～7枚，转接插入配置好的生根诱导培养基，生根培养约3周后，苗基部长出多条绿色根，并有明显白色根毛后，进行下一步骤；
(6)炼苗移栽
将生根的苗连同培养容器一同移出无菌培养室，在控制温度为正常室温的育苗室内放置2～3天后，揭开培养容器盖子或封口膜再放置2～3天，期间保持育苗室内湿度在80％以上，之后用清水洗净根上附着的培养基，移栽入喷洒过多菌灵500倍液的室外土壤中，并保持土壤湿润。
其中，所述的增厚诱导培养基包括：MS+苄基腺嘌呤6-BA0.1～1.0mg/L+萘乙酸NAA0.1～0.5mg/L+0.7％琼脂。
增厚诱导培养基优选成分包括：MS+苄基腺嘌呤6-BA0.4mg/L+萘乙酸NAA0.1mg/L+0.7％琼脂。
所述的出芽成苗诱导培养基包括：MS+萘乙酸NAA0.4～1.0mg/L+苄基腺嘌呤6-BA1.0～2.5mg/L+0.7％琼脂。
出芽成苗诱导培养基优选成分包括：MS+萘乙酸NAA0.5mg/L+苄基腺嘌呤6-BA2.0mg/L+0.7％琼脂。
所述的生根诱导培养基包括：1/4MS+吲哚丁酸IBA0.05～0.2mg/L+萘乙酸NAA0.05～0.2mg/L+0.5％琼脂。
生根培养基优选成分包括：1/4MS+吲哚丁酸IBA0.2mg/L+萘乙酸NAA0.2mg/L+0.5％琼脂。
增厚诱导培养基、出芽成苗诱导培养基、生根诱导培养均在121℃温度下灭菌20分钟，并在灭菌前调整pH值为5.6～5.8，培养温度控制为23±1℃，光照10～12小时/天，使用照度为1800～2000Lx的日光灯源。
本发明提供的甜叶菊组织培养方法，取材容易，可以迅速扩繁出大量种源，外植体组织培养没有愈伤组织细胞增殖分化这一培养阶段，缩短了培养时间，并且有极高的增值率，易操作，可大规模生产，且培养过程便于遗传转化等研究的操作。本发明所提供的培养基，确保叶片在各个阶段能达到预期培养目标。
具体实施方式
结合实施例和对比例说明本发明的具体实施方式和技术效果。
实施例1：
(1)无菌条件下取由甜叶菊茎段组织培养再生无菌苗的绿色叶片，将完整的叶片正面接触培养基，在超净工作台上接种到增厚诱导培养基；增厚诱导培养基的成分为MS+苄基腺嘌呤6-BA0.4mg/L+萘乙酸NAA0.1mg/L+0.7％琼脂；
(2)在无菌培养室内培养9天后，叶片出现肉质增厚，无菌条件下转接至出芽诱导培养基；出芽成苗诱导培养基成分为MS+萘乙酸NAA0.5mg/L+苄基腺嘌呤6-BA2.0mg/L+0.7％琼脂；
(3)在无菌培养室遮光暗培养1周后开始光培养，12天后叶片在中脉两侧叶缘萌发出现紫色芽，每外植体出芽数13±2个，继续培养后成苗，待苗高3～5厘米后转接诱导生根；
(4)再生苗相互分开成单株，保证每株有叶片5～7枚，无菌条件下转接插入生根培养基；生根诱导培养成分为1/4MS+吲哚丁酸IBA0.2mg/L+萘乙酸NAA0.2mg/L+0.5％琼脂；22天后每株生根16±2条，且18天时已经有明显的白色根毛，根较为粗壮；
(5)将生根的再生苗连同培养容器一同移出无菌培养室，在正常室温及相同光照条件下的室内放置2～3天，再除去培养容器盖子或封口膜，在相同条件下放置2～3天，期间保持室内湿度80％以上，之后移栽入喷施多菌灵500倍液的土壤中，移到室外，最终成活率为90％。
其中，无菌培养室内条件为控制温度为23±1℃，光照10小时/天，照度2000LX。
所有培养基附加蔗糖3％，调节pH为5.8，121℃灭菌20分钟。
实施例2：
(1)采摘自室外栽培植株的叶片，用流水冲洗30分钟，在超净工作台上用75％酒精处理6～8秒后再用0.1％升汞浸泡8分钟，倒去升汞溶液，用无菌水冲洗4～5次，每次不少于半分钟，后用无菌纸吸干表面水分并避免相互重叠，并尽快接种到增厚诱导培养基，增厚诱导培养基成分为MS+苄基腺嘌呤6-BA0.4mg/L+萘乙酸NAA0.1mg/L+0.7％琼脂；
(2)在无菌培养室内培养9天后出现肉质增厚，无菌条件下转接至出芽诱导培养基，出芽成苗诱导培养基成分为MS+萘乙酸NAA0.5mg/L+苄基腺嘌呤6-BA2.0mg/L+0.7％琼脂；
(3)在无菌培养室遮光暗培养1周后开始光培养，14天后叶片在中脉两侧叶缘萌发出现紫色芽，每外植体出芽数11±3个，继续培养后成苗，待苗高3～5厘米后转接诱导生根；
(4)再生苗相互分开成单株，保证每株有叶片5～7枚，无菌条件下转接插入生根培养基，生根诱导培养成分为1/4MS+吲哚丁酸IBA0.2mg/L+萘乙酸NAA0.2mg/L+0.5％琼脂；19天后每株生根15±2条，在22天是有明显的白色根毛，根较细；
(5)将生根的再生苗连同培养容器一同移出无菌培养室，在正常室温及相同光照条件下的室内放置2～3天，再除去培养容器盖子或封口膜，在相同条件下放置2～3天，期间保持室内湿度80％以上，之后移栽入喷施多菌灵500倍液的土壤中，移到室外，最终成活率为90％；
其中，所述的叶片接种时，应将完整的叶片正面接触培养基表面，不用切割，若接种时叶片基本还存有叶柄，则应将叶片基部弯曲，叶柄插入培养基，并保持叶片接触培养基。
无菌培养室内条件为控制温度为23±1℃，光照10小时/天，照度2000LX。
所有培养基附加蔗糖3％，调节pH为5.8，121℃灭菌20分钟。
实施例3：
(1)采摘自室外栽培植株的叶片，用流水冲洗30分钟，在超净工作台上用75％酒精处理6～8秒后再用0.1％升汞浸泡8分钟，倒去升汞溶液，用无菌水冲洗4～5次，每次不少于半分钟，后用无菌纸吸干表面水分并避免相互重叠，并尽快接种到增厚诱导培养基，增厚诱导培养基成分为MS+苄基腺嘌呤6-BA0.5mg/L+萘乙酸NAA0.1mg/L+0.7％琼脂；
(2)在无菌培养室内培养9天后出现肉质增厚，无菌条件下转接至出芽诱导培养基，出芽成苗诱导培养基成分为MS+萘乙酸NAA1.0mg/L+苄基腺嘌呤6-BA2.5mg/L+0.7％琼脂；
(3)在无菌培养室遮光暗培养1周后开始光培养，14天后叶片在中脉两侧叶缘萌发出现紫色芽，每外植体出芽数11±3个，继续培养后成苗，待苗高3～5厘米后转接诱导生根；
(4)再生苗相互分开成单株，保证每株有叶片5～7枚，无菌条件下转接插入生根培养基，生根诱导培养成分为1/4MS+吲哚丁酸IBA0.05mg/L+萘乙酸NAA0.05mg/L+0.5％琼脂；21天后每株生根15±2条，在23天是有明显的白色根毛，根较细。
(5)将生根的再生苗连同培养容器一同移出无菌培养室，在正常室温及相同光照条件下的室内放置2～3天，再除去培养容器盖子或封口膜，在相同条件下放置2～3天，期间保持室内湿度80％以上，之后移栽入喷施多菌灵500倍液的土壤中，移到室外，最终成活率为90％；
其中，所述的叶片接种时，应将完整的叶片正面接触培养基表面，不用切割，若接种时叶片基本还存有叶柄，则应将叶片基部弯曲，叶柄插入培养基，并保持叶片接触培养基。
无菌培养室内条件为控制温度为23±1℃，光照10小时/天，照度2000LX。
所有培养基附加蔗糖3％，调节pH为5.8，121℃灭菌20分钟。
对比例：
(1)采摘自室外栽培植株的叶片，用流水冲洗30分钟，在超净工作台上用75％酒精处理6～8秒后再用0.1％升汞浸泡8分钟，倒去升汞溶液，用无菌水冲洗4～5次，每次不少于半分钟，后用无菌纸吸干表面水分并避免相互重叠；
(2)完成消毒的叶片外植体尽快接种到增厚诱导对照培养基，增厚诱导对照培养基成分为MS培养基+0.7％琼脂中，在无菌培养室内培养7天后褐化干枯死亡，
(3)另用肉质增厚的叶片无菌条件下转接至出芽诱导对照培养基，成分为MS+0.7％琼脂；在无菌培养室遮光暗培养1周后褐化，干枯死亡；
(4)另取再生苗相互分开成单株，保证每株有叶片5～7枚，无菌条件下转接插入生根对照培养基，成分为1/4MS+0.5％琼脂，不能生根，约3周后除培养基消耗外无明显变化；
其中，叶片接种时，应将完整的叶片正面接触培养基表面，不用切割，若接种时叶片基本还存有叶柄，则应将叶片基部弯曲，叶柄插入培养基，并保持叶片接触培养基。
无菌培养室内条件为控制温度为23±1℃，光照10小时/天，照度2000LX。
所有培养基附加蔗糖3％，调节pH为5.8，121℃灭菌20分钟。
通过对比例和实施例对比，可见通过本发明提供的甜叶菊组织培养方法及其培养基，可以迅速、有效的利用甜叶菊叶片组织培养直接成芽进行繁殖。
Claims (2)
1.甜叶菊组织培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)外植体采集
对于室外栽培的植株，选取无病虫损害的甜叶菊植株，采摘植株顶端第一、二对已经完全展开，但未老熟的叶片作为外植体；
对于无菌组培苗，使用长势良好、健康的组培苗的所有叶片；
(2)消毒接种
采摘自室外栽培植株的叶片用流水冲洗30分钟，在超净工作台上用75％酒精处理6～8秒后再用0.1％升汞浸泡8分钟，倒去升汞溶液，用无菌水冲洗4～5次，每次不少于半分钟，然后用无菌纸吸干表面水分并避免相互重叠，并接种到增厚诱导培养基中；
组培苗叶片不经消毒，在无菌条件下采摘后直接接种；
接种时将完整的叶片正面接触增厚诱导培养基表面，若接种时叶片还存有叶柄，则将叶片基部弯曲，叶柄插入增厚诱导培养基，并保持叶片接触培养基；
(3)增厚诱导培养
叶片接种到增厚诱导培养基上后，培养至7～9天后叶片出现肉质增厚，叶片肉质增厚特征表现为，叶片增厚，表面密布透明颗粒，叶片质地脆而易断；
所述的增厚诱导培养基，包括，MS+苄基腺嘌呤6-BA0.1～1.0mg/L+萘乙酸NAA0.1～0.5mg/L+0.7％琼脂；
(4)出芽成苗
将第(3)步所得的肉质增厚叶片转接进入出芽成苗诱导培养基，在无菌培养室内，先完全遮光暗培养1周，再光培养1～2周后，叶片开始在中脉两侧或叶尖长出紫红色的芽，每片叶片出芽个数8～14个，每一个芽经继续培养后颜色转绿，并独成一株再生苗，待苗生长至高3～5cm后进入下一步骤；
所述的出芽成苗诱导培养基包括：MS+萘乙酸NAA0.4～1.0mg/L+苄基腺嘌呤6-BA1.0～2.5mg/L+0.7％琼脂；
(5)转接生根
将3～5cm高的苗相互分开成单株，保证每株苗有叶片5～7枚，转接插入配制好的生根诱导培养基，生根培养3周后，苗基部长出多条绿色根，并有明显白色根毛后，进行下一步骤；
所述的生根诱导培养基包括：1/4MS+吲哚丁酸IBA0.05～0.2mg/L+萘乙酸NAA0.05～0.2mg/L+0.5％琼脂；
(6)炼苗移栽
将生根的苗连同培养容器一同移出无菌培养室，在控制温度为正常室温的育苗室内放置2～3天后，揭开培养容器盖子或封口膜再放置2～3天，期间保持育苗室内湿度在80％以上，之后用清水洗净根上附着的培养基，移栽入喷洒过多菌灵500倍液的室外土壤中，并保持土壤湿润。
2.根据权利要求1所述的甜叶菊组织培养方法，其特征在于：所述的增厚诱导培养基包括，MS+苄基腺嘌呤6-BA0.4mg/L+萘乙酸NAA0.1mg/L+0.7％琼脂。
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