CN100444722C

CN100444722C - 杜鹃兰的组织培养与快速繁殖方法

Info

Publication number: CN100444722C
Application number: CNB2006100509197A
Authority: CN
Inventors: 毛堂芬; 刘作易; 朱国胜; 黄永会
Original assignee: BIO-TECHNOLOGY INST GUIZHOU AGRICULTURAL ACADEMY
Current assignee: BIO-TECHNOLOGY INST GUIZHOU AGRICULTURAL ACADEMY
Priority date: 2006-01-18
Filing date: 2006-01-18
Publication date: 2008-12-24
Anticipated expiration: 2026-01-18
Also published as: CN1817110A

Abstract

本发明公开了一种杜鹃兰的组织培养与快速繁殖方法，该方法包括(1)采用杜鹃兰蒴果种子和假球茎上的芽眼作为外植体，其中蒴果种子进行无菌播种培养，萌发形成原球茎；假球茎芽眼经消毒后进行接种培养，获得原球茎；(2)通过原球茎在培养基里的增殖，将其增殖3～7倍；(3)将增殖所得的原球茎分化成苗并促其生根，获得完整的再生植株；(4)将再生植株栽种在蛭石苗床或营养钵生长、过渡。或将增殖的根状茎直接栽种在蛭石里生根发芽得到种苗。将种苗栽种到准备就序的土壤中，并进行栽培管理，得到人工栽培的杜鹃兰假球茎。采用本方法对杜鹃兰进行种苗繁殖，有效地解决了杜鹃兰繁殖困难和种苗缺乏的问题，可实现杜鹃兰的规模化、工厂化生产。

Description

杜鹃兰的组织培养与快速繁殖方法

技术领域

本发明涉及通过组织培养技术的植物再生方法，具体而言涉及杜鹃兰的组织培养和快速繁殖的方法。

背景技术

杜鹃兰(Cremastra appendiculata Makino)，又名毛慈姑、算盘七等，属兰科杜鹃兰属药用植物，因其假球茎含粘液及葡配甘露聚糖(由甘露糖与葡萄糖2∶1聚合而成)而入药，其味甘微辛，性寒，有小毒，具有消肿化痰、解毒散结的功效。杜鹃兰不仅是珍稀药用植物，而且是我国三级珍稀濒危野生保护植物。杜鹃兰的生长对生态环境要求较严，其种子非常细小，无胚乳，以种子繁殖成功率极低；以其假球茎繁殖，繁殖系数也很低。长期以来杜鹃兰主要依靠采集野生资源供药用，人们烂挖乱采，造成资源枯竭。然而药材市场对杜鹃兰需求量大，因此杜鹃兰的组织培养和快速繁殖已成为人们亟待解决的难题。

近年来，人们不断研究杜鹃兰的组培快繁方法，取得了一些进展。目前已经申请的发明专利技术方案有CN1623373号“杜鹃兰离体培养与快速繁殖生物技术方法”。该方法通过杜鹃兰离体培养和植株生长过程中必须的共生真菌的分离、培养与真菌提取物的制备，解决了杜鹃兰原球茎的诱导、增殖、根芽分化及植株生长的问题，是一种杜鹃兰人工繁殖的技术。但人们仍然在探索、研究更实用的组培快繁技术，实现杜鹃兰药材的规模化和工厂化生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种杜鹃兰的组培快繁方法，以解决杜鹃兰繁殖困难和种苗缺乏的问题，促进药用植物杜鹃兰的大量繁殖。

为达到上述目的，发明人提供的技术方案包括：

(1)采用杜鹃兰蒴果种子和假球茎上的芽眼作为外植体，其中蒴果经消毒后进行种子无菌播种培养，萌发形成原球茎；假球茎芽眼经消毒后进行接种培养，获得原球茎；

(2)通过原球茎在培养基里的增殖，将其增殖3～7倍；

(3)将增殖所得的原球茎分化成苗并促其生根，获得完整的再生植株，即组培苗；

(4)将所获得的再生植株经室温和蛭石苗床或营养钵炼苗，获得种苗；或将增殖的根状茎直接栽种在蛭石苗床或营养钵中生根发芽得到种苗；将所得的种苗栽种到事先准备就序的土壤中，并进行栽培管理，得到人工栽培的药用植物杜鹃兰假球茎。

在第一步中，外植体的选择、处理及原球茎的获得技术是：①用杜鹃兰蒴果种子作为外植体，须先用70％的酒精棉球擦拭蒴果表面进行消毒处理，再将蒴果蘸上95％酒精，燃烧灭菌；之后用无菌解剖刀剖开蒴果，将其中细小的种子均匀地撒播在附加0.5mg/L NAA(α-萘乙酸)的1/2MS固体培养基表面，培养基pH值为5.5～5.8，置于温度25±2℃，全黑暗条件下培养半年，种子萌发形成白色小原球茎。②用假球茎上的芽眼作为外植体，须先将其上的泥土洗干净，晾干，然后装入三角瓶。在无菌条件下，用70％酒精倒入三角瓶对假球茎进行消毒20s，接着用0.1％升汞液浸泡灭菌8min，再用无菌水清洗5次，每次2～3min；最后用无菌滤纸吸干水分，切取假球茎上的芽眼，接种于预先配制好的MS培养基上，培养基pH 5.5～5.8，置于温度25±2℃，光照时间12h/d，光照强度1500～2000 1x条件下，约10d开始萌发，形成白色小原球茎。

在第二步中，原球茎的增殖技术是：将获得的白色小原球茎转接到添加3.0～6.0mg/L6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)+NAA0.2mg/L+0.1％活性炭+2％白糖的B₅固体增殖培养基，其pH值为5.5～5.8，置于温度25±2℃，光照时间12h/d，光照强度1500～2000 1x条件下培养，白色小原球茎逐渐变成绿色，形成丛生形的原球茎，球茎表面长满白色的绒毛，同时部分茎节伸长形成根状茎；40～50d后转接继代培养在相同的增殖培养基上，同等条件下继续培养，增殖倍数达到3～7倍。原球茎在加有激素的培养基上继代培养3-4次后，将增殖的原球茎转接到不加激素的培养基上继续进行增殖培养。

在第三步中，根状茎分化成苗及生根技术是：将增殖得到的根状茎分切成粒径0.5～1.0cm大小，接种在附加2.0mg/L NAA+0.2％活性炭+2％白糖的MS固体分化培养基上，在光照条件下培养15～20d后，放置在温度相同的全黑暗条件下培养，根状茎基部产生增殖，其顶端及侧端分化出白色的芽，再放在光照条件下培养，白色的芽逐渐长成绿色的小苗。将生长约1.0cm的小苗移入1/2MS+0.5mg/L NAA+0.2％活性炭+2％白糖的培养基上培养，其pH值为5.5～5.8。20d后，芽基生长出有白色绒毛的辐射状小根，形成完整植株，即组培苗。

在第四步中，组培苗炼苗或根状茎直接成苗技术是：将根长1.0～2.0cm，苗高2.0cm以上的组培苗置于室温条件下2～3d，然后揭去封口膜炼苗2～3d；之后取出瓶苗，用清水冲洗干净附着在根部的培养基，栽种到准备好的基质蛭石中，用稀释1000倍的多菌灵溶液浇淋透，1周后再浇水，成活后喷施少许营养液。增殖的根状茎直接用清水冲洗干净粘附的培养基，栽种于准备好的基质中，1月后萌芽生根，获得种苗。

采用本发明方法对杜鹃兰进行组织培养和快速繁殖，有效地解决了杜鹃兰繁殖困难和种苗缺乏的问题，为实现杜鹃兰的规模化、工厂化生产提供了可靠的技术保证。与已有技术相比，本发明既可采用杜鹃兰蒴果种子为外植体萌发形成原球茎，也可采用假球茎上的芽眼作为外植体培养原球茎进行繁殖；而且将根状茎直接移栽在蛭石苗床或营养钵发芽生根成苗，具有简化培养程序、缩短培养时间，生产周期短，成本低，质量好的优点。

附图说明

附图为本发明的杜鹃兰的组织培养与快速繁殖方法工艺流程示意图。

具体实施方式

实施例1采用杜鹃兰蒴果种子作为外植体，在超净工作台上，先用70％的酒精棉球擦拭蒴果表面进行消毒处理，再将蒴果蘸上酒精，燃烧灭菌；后用无菌解剖刀剖开蒴果，将其中细小的种子均匀地撒播在附加0.5mg/L

NAA的1/2MS固体培养基表面，培养基pH值为5.5～5.8，置于温度25±2℃，全黑暗条件下培养半年，种子萌发形成白色小原球茎。将此小原球茎转移到添加3.0～6.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.1％活性炭+2％白糖的B₅固体增殖培养基，pH 5.5～5.8，置于温度25±2℃，光照时间12h/d，光照强度1500～2000 1x条件下，白色小原球茎逐渐变成绿色，形成丛生形的原球茎，球茎表面长满白色的绒毛，同时部分茎节伸长形成根状茎。40～50d后转接继代培养在相同的增殖培养基上，在同等条件下继续培养，增殖倍数达到3～7倍。将增殖得到的原球茎分切成粒径0.5～1.0cm大小，接种在附加2.0mg/L NAA+0.2％活性炭+2％白糖的MS固体分化培养基上，在光照条件下培养15～20d后，放置在温度相同的全黑暗条件下培养，根状茎基部产生增殖，其顶端及侧端分化出白色的芽，再放在光照条件下培养，白色的芽逐渐长成绿色的苗；将生长约1.0cm的组培苗移入1/2MS+0.5mg/LNAA+0.2％活性炭+2％白糖的培养基上培养，其pH值为5.5～5.8。20d后，芽基生长出有白色绒毛的辐射状小根，生根率100％。将根长1.0～2.0cm，苗高2.0cm以上的组培苗带瓶置于室温炼苗2～3d，然后揭去封口膜2～3d；之后取出瓶苗，用清水冲洗干净附着在根部的培养基，栽种到准备好的基质之中，用稀释1000倍的多菌灵溶液浇淋透，1周后再浇水，成活后喷施少许营养液。增殖的根状茎直接用清水冲洗干净粘附的培养基，栽种于准备好的基质中，1月后萌芽生根成苗。经过炼苗20～30d后，从营养钵中取出苗，将根部的蛭石除净，雨后栽种到准备好的土中，用黑色遮阳网遮荫；生长期追施有机复合肥2次，并进行浇水和除草等管理，得到人工栽培的药用植物杜鹃兰假球茎。

实施例2采用杜鹃兰假球茎上的芽眼作为外植体，先用清水将其上的泥土冲洗干净，晾干，然后装入三角瓶，在无菌条件下，用70％的酒精倒入三角瓶对假球茎进行消毒20s，接着用0.1％升汞液浸泡灭菌8min，再用无菌水清洗5次，每次3min；最后用无菌滤纸吸干水分，切取假球茎上的芽眼，接种于预先配制好的MS培养基，培养基pH值为5.5～5.8，置于温度25±2℃，光照时间12h/d，光照强度1500～2000 1x条件下，约10d开始萌发，形成白色小原球茎。将此原球茎在30d后转接到增殖培养基上培养，获得丛生形的原球茎，球茎表面长满白色的绒毛，部分茎节伸长形成根状茎；40～50d后转接继代培养在相同的增殖培养基上，在同等条件下继续培养，增殖倍数达到3～7倍。增殖后的培养方法同实施例1。

Claims

1一种杜鹃兰的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于该方法包括外植体的选择、处理及原球茎的获得，原球茎在培养基里的增殖，根状茎分化成苗及生根，组培苗炼苗或根状茎直接成苗4个步骤，具体技术是：

第一步，外植体的选择、处理及原球茎的获得，用杜鹃兰蒴果种子作为外植体，在超净工作台上，须先用酒精棉球擦拭蒴果表面进行消毒处理，再将蒴果蘸上酒精，燃烧灭菌，之后用无菌解剖刀剖开蒴果，将其中细小的种子均匀地撒播在附加0.5mg/L NAA的1/2MS固体培养基表面，置于温度25±2℃，全黑暗条件下培养半年，种子萌发形成白色小原球茎；或者用假球茎上的芽眼作为外植体，须先将其上的泥土洗干净，晾干，然后装入三角瓶，在无菌条件下，用酒精倒入三角瓶对假球茎进行消毒20s，接着用升汞液浸泡灭菌8min，再用无菌水清洗5次，每次3min，最后用无菌滤纸吸干水分，切取假球茎上的芽眼，接种于预先配制好的MS培养基上，置于温度25±2℃，光照时间12h/d，光照强度1500～2000 lx条件下，约10d开始萌发，形成白色小原球茎；

第二步，原球茎在培养基里的增殖，即将获得的白色小原球茎转接到添加6-BA 3.0～6.0mg/L+NAA 0.2mg/L+0.1％活性炭+2％白糖的B₅固体增殖培养基，置于25±2℃，光照时间12h/d，光照强度1500～2000 lx条件下培养，白色小原球茎形成绿色丛生形的原球茎，球茎表面长满白色绒毛，同时部分茎节伸长形成根状茎；40～50d后转接继代培养在相同的增殖培养基上，同等条件下继续培养，增殖倍数达到3～7倍；原球茎在加有激素的培养基上继代培养3-4次后，将增殖的原球茎转接到不加激素的培养基上继续进行增殖培养；

第三步，根状茎分化成苗及生根，是将增殖得到的根状茎分切成粒径0.5～1.0cm大小，接种在附加2.0mg/L NAA+0.2％活性炭+2％白糖的MS固体分化培养基上，在光照条件下培养15～20d后，放置在温度相同的全黑暗条件下培养，根状茎基部产生增殖，其顶端及侧端分化出白色的芽，再放在光照条件下培养，白色的芽逐渐长成绿色的小苗；将生长约1.0cm的小苗移入1/2MS+0.5mg/LNAA+0.2％活性炭+2％白糖的培养基上培养，其pH值为5.5～5.8；20d后，芽基生长出有白色绒毛的辐射状小根，形成完整植株，即组培苗；

第四步，组培苗炼苗或根状茎直接成苗，是将根长1.0～2.0cm，苗高2.0cm以上的组培苗带瓶置于室温炼苗2～3d，然后揭去封口膜2～3d；之后取出瓶苗，用清水冲洗干净附着在根部的培养基，栽种到准备好的基质中，用多菌灵溶液浇淋透，1周后再浇水，成活后喷施少许营养液；增殖的根状茎不通过分化成苗阶段，直接用清水冲洗干净粘附的培养基，栽种于准备好的基质中，1月后萌芽生根，获得种苗。