CN109819894A

CN109819894A - 一种冰球子种子萌发培养基配方及制备方法

Info

Publication number: CN109819894A
Application number: CN201910191389.5A
Authority: CN
Inventors: 查钦; 阮培均; 张翔宇; 王永; 邹涛; 柳敏; 周茂嫦; 李恒谦; 黄晓旭; 王彩云; 成忠均
Original assignee: BIJIE INSTITUTE OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
Current assignee: BIJIE INSTITUTE OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
Priority date: 2019-03-14
Filing date: 2019-03-14
Publication date: 2019-05-31

Abstract

本发明属于中药植物组织培养技术领域，具体涉及一种冰球子种子萌发培养基配方及制备方法。本发明所述的冰球子种子萌发培养基配方包括下述组分：1/2MS或1/4MS、0.5～2.5mg/L的6‑BA、0.1～0.3mg/L的NAA、0.1～0.25g/L的GA、40～50g/L的香蕉泥、3～15g/L的刺梨汁、2～15g/L的野葛根、1～15g/L的山楂、2～10g/L的猪苓、1～10g/L头花蓼、1～10g/L山银花。本发明的优点在于：使用刺梨汁作为培养基的制备材料之一，并在此基础上添加了其他的中药组分，能够促进种子的萌发，缩短冰球子种子的萌发时间，提高种子萌发率；与传统培养基相比，还能抑制杂菌在培养基上生长。

Description

一种冰球子种子萌发培养基配方及制备方法

技术领域

本发明涉及冰球子组织培养技术领域，尤其是涉及一种冰球子种子萌发培养基配方及制备方法。

背景技术

冰球子（Oreorchis patens (Lindl.) Lindl.）又称山慈姑、毛慈姑、泥宾子系多年生兰科草本植物独蒜兰的假球茎，具有消肿、散结、化痰、解毒等功效，广泛应用于抗肿瘤药物之中。尤其巨大的药用价值，在市场上供不应求。

冰球子种子细小，在自然条件下授粉率低，种子无胚乳，无法提供发芽所需的养分，极少萌发成苗。由于近年来过度开采，导致野生冰球子资源匮乏，随着环境条件的恶化，野生冰球子分布范围也日益缩小。通过分株繁殖和种子繁殖等传统的人工栽培方法存在周期长、效率低的缺点，不适宜用于规模化种植，无法满足市场需求。植物组织快繁技术成为冰球子获取种苗的最佳选择，其周期短，繁殖系数大，培养条件可控，不受气候条件限制。

为解决冰球子传统栽培方法繁殖率低、周期长的缺点，现提出了多种解决方案。例如：中国专利文献公开了一种冰球子无性种苗快速繁育方法【授权公告号：CN 102577877B】，其主要内容包括以下步骤：1）育苗场地布置2）苗床营养土的制备3）河沙消毒4）冰球子种子的选择5）种苗培育6）育苗后进行移栽。廖婷婷等对山慈菇快速繁殖体系的建立中，以山慈菇的组织芽快为外植体，采用单因素变量法，通过对培养基、大量元素、单一激素、激素组合等因素的研究，建立山慈菇快速繁殖体系，其最适组织芽块外植体生长的培养基为1/4MS+0.1mg/L NAA+2.0mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.5%活性炭+0.55％琼脂，PH为5.8。尤超等对不同培养基对山慈姑种子无菌萌发的影响研究中，以山慈菇种子为外植体，筛选出诱导山慈菇种子萌发的最适培养基为1/2MS+1.5mg/L IAA + 0.05%干酪素+2%蔗糖+0.75%活性炭+0.55%琼脂，PH为5.8。

上述方案虽然在一定程度上解决了现有技术的不足，在已公开的专利中，以冰球子假球茎为繁殖材料，与种子繁殖相比，其繁殖系数小，生长速度慢；在廖婷婷等的研究中，其组织芽块外植体生长的培养基不能共同促进冰球子种子萌发和幼苗生长，且繁殖系数小，也不能够抑制杂菌的生长；在尤超等研究中，其种子萌发率低，外植体培养基容易感染杂菌。到目前，还未报道关于能够促进冰球子种子的萌发，缩短种子萌发时间，提高种子萌发率并能抑制杂菌在培养基上生长的培养基。

发明内容

本发明的目的是提供一种冰球子种子萌发培养基配方及制备方法

为达上述目的，本发明包括下列技术方案：一种冰球子种子萌发培养基配方及制备方法，其本制备配方包括的组分为：1/2MS或1/4MS、0.5～2.5mg/L的6-BA、0.1～0.3mg/L的NAA、0.1～0.25g/L的GA、40～50g/L的香蕉泥、3～15g/L的刺梨汁、2～15g/L的野葛根、1～15g/L的山楂、2～10g/L的猪苓、1～10g/L头花蓼、1～10g/L山银花、6～10g/L的卡拉胶、25～30g/L的白砂糖。

1/2MS或1/4MS作为基础培养基、6-BA、NAA和GA促进种子萌发、香蕉泥和刺梨汁利于冰球子壮苗生根。野葛根、山楂、猪苓、头花蓼和山银花属于中药组分，能够促进种子的萌发和生长，有效抑制杂菌在培养基上的生长增殖，避免培养基生长，利于提高冰球子快速繁殖的效率。

在上述一种冰球子种子萌发培养基配方及制备方法中，配方的优化组分为：1/2MS、1.0mg/L的6-BA、0.2mg/L的NAA、0.15g/L的GA、45g/L的香蕉泥、10g/L的刺梨汁、5g/L的野葛根、4g/L的山楂、4g/L的猪苓、5g/L头花蓼、3g/L山银花、8g/L的卡拉胶、30g/L的白砂糖。

采用上述培养基配方制备一种冰球子种子萌发培养基的方法，本制备方法包括如下步骤：

1）中药提取液的制备：取制备配方中的各中药组分，混合粉碎为粗粉，放入容器内，加蒸馏水200-250mL，振摇浸提8-10h后，静置取上清液，过滤，记得中药提取液。

2）备用液和卡拉胶液的制备：称取0.5～2.5mg/L的6-BA、0.1～0.3mg/L的NAA、0.1～0.25g/L的GA、40～50g/L的香蕉泥、25～30g/L的白砂糖，加热并搅拌溶解后得备用液；称取6～10g/L的卡拉胶，加蒸馏水200～300mL，边加热边搅拌，直至煮沸溶解呈透明状，停止加热，及得卡拉胶液。

3）组分混合：量取60～80mL的1/2MS或1/4MS培养基母液，在培养基母液中加入中药提取液，搅拌均匀，再加入备用液，搅拌均匀，最后加入适量的卡拉胶液，搅拌均匀，加热水定容到1000mL；

在上述的一种冰球子种子萌发培养基配方的制备方法中，在步骤1）中，振摇浸提的提取温度为30～35℃。

在上述的一种冰球子种子萌发培养基配方的制备方法中，在步骤3）中，所述的PH值为5.8，最利于冰球子种子的萌发和幼苗的生长。

根据上述的制备方法及得一种冰球子种子萌发的培养基。

本发明一种冰球子种子萌发培养基配方及制备方法的有益效果在于：

第一，1/2MS或1/4MS作为基础培养基、6-BA、NAA和GA促进种子萌发、香蕉泥和刺梨汁利于冰球子壮苗生根。经多组合中药组份筛选确定：野葛根、山楂、猪苓、头花蓼和山银花中药组分，能够促进种子的萌发和生长，并有效抑制杂菌在培养基上的生长增殖，避免培养基杂菌生长，利于提高冰球子快速繁殖的效率。

第二，在本发明的制备方法中，采用低温振摇提取中药组分液，避免了中药组分易挥发成分的挥发、破坏，最大程度上保留了中药组分的有效成分及内在物质。能有效够促进种子的萌发和生长，并有效抑制杂菌在培养基上的生长增殖。

具体实施方式

实施例1

一种冰球子种子萌发培养基的制备配方包括下述组分：1/2MS或1/4MS、0.5～2.5mg/L的6-BA、0.1～0.3mg/L的NAA、0.1～0.25g/L的GA、40～50g/L的香蕉泥、3～15g/L的刺梨汁、2～15g/L的野葛根、1～15g/L的山楂、2～10g/L的猪苓、1～10g/L头花蓼、1～10g/L山银花、6～10g/L的卡拉胶、25～30g/L的白砂糖。

本发明的一种冰球子种子萌发培养基的方法，制备方法包括如下步骤：

在步骤1）中，振摇浸提的提取温度为30～35℃。在步骤3）中，所述的PH值为5.8，最利于冰球子种子的萌发和幼苗的生长。

对照实验1：采用本实施例的制备配方制得的一种冰球子种子萌发培养基作为实验组织培养基；另采用1/2MS作为对照组培养基。具体实验如下：

将其硕果用流水洗净后，先用0.1%升汞液消毒灭菌8 min，再用75%酒精消毒4 min，用无菌水冲洗5～8次。在无菌条件下，剖开硕果，将粉末状的种子分别轻轻抖在实验培养基和对照培养基上。将培养室内的温度控制在24～26℃，光照强度2000～2500lx，光照10～16h/d。种子萌发暗培养20天后移除暗培养，并观察，统计种子的发芽率，于75天后观察统计幼苗的生长情况，同时记录培养基杂菌污染情况。实验结果如表1所示。

表1 冰球子种子萌发和生长情况

由于实验组的生根率、苗平均高度、苗生长势均优于对照组，表明该实验组的培养基能够促进冰球子种子萌发和生长，抑制杂菌在培养基上生长，并有效降低了培养基的污染率。

实施例2

一种冰球子种子萌发培养基的制备配方包括下述组分：1/2MS、1.0mg/L的6-BA、0.2mg/L的NAA、0.15g/L的GA、45g/L的香蕉泥、10g/L的刺梨汁、5g/L的野葛根、4g/L的山楂、4g/L的猪苓、4g/L头花蓼、2g/L山银花、8g/L的卡拉胶、30g/L的白砂糖。

对照实验2：采用本实施例的制备配方制得的一种冰球子种子萌发培养基作为实验组织培养基；另采用组分为：1/4MS+0.1mg/L NAA+2.0mg/L 6-BA+3%蔗糖+ 0.5%活性炭+0.55％琼脂作为对照组培养基。实验操作如下：

将其硕果用流水洗净后，先用0.1%升汞液消毒灭菌8 min，再用75%酒精消毒4 min，用无菌水冲洗5～8次。在无菌条件下，剖开硕果，将粉末状的种子分别轻轻抖在实验培养基和对照培养基上。将培养室内的温度控制在24～26℃，光照强度2000～2500lx，光照10～16h/d。种子萌发暗培养20天后移除暗培养，并观察，统计种子的发芽率，于75天后观察统计幼苗的生长情况，同时记录培养基杂菌污染情况。实验结果如表2所示。

表2 冰球子种子萌发和生长情况

实施例3

一种冰球子种子萌发培养基的制备配方包括下述组分：1/2MS、2.0mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA、0.1g/L的GA、40g/L的香蕉泥、10g/L的刺梨汁、5g/L的野葛根、4g/L的山楂、4g/L的猪苓、4g/L头花蓼、2g/L山银花、8g/L的卡拉胶、30g/L的白砂糖。

对照实验2：采用本实施例的制备配方制得的一种冰球子种子萌发培养基作为实验组织培养基；另采用组分为：1/2MS+1.5mg/l IAA+0.05%干酪素+2%蔗糖+0.75%活性炭+0.55%琼脂作为对照组培养基。实验操作如下：

将其硕果用流水洗净后，先用0.1%升汞液消毒灭菌8 min，再用75%酒精消毒4 min，用无菌水冲洗5～8次。在无菌条件下，剖开硕果，将粉末状的种子分别轻轻抖在实验培养基和对照培养基上。将培养室内的温度控制在24～26℃，光照强度2000～2500lx，光照10～16h/d。种子萌发暗培养20天后移除暗培养，并观察，统计种子的发芽率，于75天后观察统计幼苗的生长情况，同时记录培养基杂菌污染情况。实验结果如表3所示。

表3 冰球子种子萌发和生长情况

本文中所述的具体实施例仅仅是对本发明实质内容做举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式代替，但并不会偏离本发明实质内容或超越权利要求书所定义的范围。

Claims

1.一种冰球子种子萌发培养基配方及制备方法，其特征在于，本培养基配方包括下述组分：1/2MS或1/4MS、0.5～2.5mg/L的6-BA、0.1～0.3mg/L的NAA、0.1～0.25g/L的GA、40～50g/L的香蕉泥、3～15g/L的刺梨汁、2～15g/L的野葛根、1～15g/L的山楂、2～10g/L的猪苓、1～10g/L头花蓼、1～10g/L山银花、6～10g/L的卡拉胶、25～30g/L的白砂糖。

2.根据权利要求1所述的一种冰球子种子萌发培养基配方及制备方法，其特征在于，本培养基配方优化组分为：1/2MS、1.0mg/L的6-BA、0.2mg/L的NAA、0.15g/L的GA、45g/L的香蕉泥、10g/L的刺梨汁、5g/L的野葛根、4g/L的山楂、4g/L的猪苓、5g/L头花蓼、3g/L山银花、8g/L的卡拉胶、30g/L的白砂糖。

3.根据权利要求1至2的其中之一一种冰球子种子萌发培养基配方及制备方法，其特征在于：所述冰球子种子萌发培养基的pH值为5.6～6.0。

4.根据权利要求1-3中的一种冰球子种子萌发培养基配方的制备方法，其特征在于，本制备方法包括下述步骤：

1）中药提取液的制备：取制备配方中的各中药组分，混合粉碎为粗粉，放入容器内，加蒸馏水200～250mL，振摇浸提8～10h后，静置取上清液，过滤，及得中药提取液；

2）备用液和卡拉胶液的制备：称取0.5～2.5mg/L的6-BA、0.1～0.3mg/L的NAA、0.1～0.25g/L的GA、40～50g/L的香蕉泥、25～30g/L的白砂糖，加热并搅拌溶解后得备用液；称取6～10g/L的卡拉胶，加蒸馏水200～300mL，边加热边搅拌，直至煮沸溶解呈透明状，停止加热，及得卡拉胶液；

3）组分混合液：量取60～80ml的1/2MS或1/4MS培养基母液，在培养基母液中加入中药提取液，搅拌均匀，再加入备用液，搅拌均匀，最后按比例加入卡拉胶液，搅拌均匀，加水定容到1000mL。

5.根据权利要求4所述的一种冰球子种子萌发培养基配方的制备方法，其特征在于：在步骤1）中，振摇浸提时的提取温度为30～35℃。

6.根据权利要求5所述的一种冰球子种子萌发培养基配方的制备方法，其特征在于：在步骤3）中，所述的组分混合液PH值为5.8。