CN108575746A - 一种芍药离体再生体系建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种芍药离体再生体系建立方法，其特征在于，包括如下步骤：外植体获得‑愈伤组织制备‑不定芽分化‑继代增殖‑根诱导‑炼苗‑移栽，本申请系统地建立芍药品种杭白芍的离体再生快繁体系，为解决芍药种苗短缺的重要途径之一，对芍药南移和芍药的开发和推广利用都具有非常重要的意义，具有广阔的应用前景。

Description

一种芍药离体再生体系建立方法

技术领域

本发明涉及芍药组织培养的繁殖方法，属于草本观赏植物种苗繁殖的技术领域，具体涉及一种芍药离体再生体系建立方法。

背景技术

芍药（学名：Paeonia lactiflora Pall.），别名别离草、花中宰相，属五桠果目，芍药科芍药属芍药组多年生草本。块根由根颈下方生出，肉质，粗壮，呈纺锤形或长柱形，粗0.6～3.5cm。芍药花瓣呈倒卵形，花盘为浅杯状，花期5～6月，花一般着生于茎的顶端或近顶端叶腋处，原种花白色，花瓣5～13枚。园艺品种花色丰富，有白、粉、红、紫、黄、绿、黑和复色等，花径10～30厘米，花瓣可达上百枚。果实呈纺锤形，种子呈圆形、长圆形或尖圆形。芍药喜光照，耐旱。芍药植株在一年当中，随着气候节律的变化而产生的阶段性发育变化主要表现为生长期和休眠期的交替变化。其中以休眠期的春化阶段和生长期的光照阶段最为关健。芍药的春化阶段，要求在0℃低温下，经过40天左右才能完成．然后混合芽方可萌动生长．芍药属长日照植物，花芽要在长日照下发育开花，混合芽萌发后，若光照时间不足，或在短日照条件下通常只长叶不开花或开花异常。

芍药分布于我国东北、华北、陕西及甘肃南部等地区，在我国经济高度发达、生活水平相对较高、精神文化需求很大的江南地区，历来不是芍药栽培和园林应用的中心，至今能够被推广引用的品种非常稀少，存在着严重的热害、涝害、开花不良、病虫害严重和地下块根退化等问题，还存在花期短，长势逐年变弱的问题。

芍药目前在杭州的集中种植点仅有花港观鱼公园巧药圃、西溪湿地公园绿堤等，所使用的品种、手法、地点和形成特色景观的数量均远不及牡丹，造成该现状的原因也主要是由于江南冬季温度较高导致冷量积累不足从而影响萌发与开花，春季温度较高导致花茎徒长、垂头和花期过短，以及及夏季酷热潮湿引发严重日灼、热害和孽生病虫害等。

‘杭白芍’开花较早，花开很多，花粉量大，自然低温下‘杭白芍’打破芽休眠的最低需冷量为540CH和665CU，能够保证较快的萌芽率、较多茎数和单株平均开花数；芽休眠解除的最佳需冷量为795ＣＨ和906ＣＵ，可从更快巧破芽的休贱，保证枝繁叶茂、开花繁盛。在人工低温处理下的需冷量为672ＣＨ结合自然和人工化温的处理，打破‘杭白芍’芽休暇、保证顺利生长和开花的需冷量为672－795ＣＨ，是生长适应性较好的品种，值得在杭州等江南地区固林中推广使用，或优先用作培育优秀江南品科的亲本。

杭白芍虽然需求量巨大，如何快速、高效地将其进行扩繁，是摆在种植者面前急需解决的技术问题。

当前芍药最常用的繁殖方法是分株繁殖与播种繁殖，前者虽然能保持原品种的性状，但需要植株生长3～5年才能分一次，并且周期较长、繁殖系数较低，分株后的母株观赏价值明显下降；后者既不能保持原品种的性状，又需要经过4～5的童期才能开花，因此，两者均不适宜进行大规模的商业化生产。植物组织培养是植物快速繁殖的一种最为有效的方法，与传统繁殖方法相比，组织培养既能保持原有品种和优良性状，扩大其繁殖系数，又不受季节的影响，可以周年运转，大幅度地提高了繁殖的效率。CN102428872公开了一种通过种胚培养获得完整芍药植株的方法，但由于种胚并不能完全保持母本的性状，因此不能用于优良品种的扩繁。吴红娟等人发表的论文：观赏芍药‘大富贵’丛生芽诱导及生根技术、‘芍药不同品种启动培养比较及‘朱砂判’丛生芽诱导的研究’报道了以地下休眠芽为外植体诱导丛生芽的方法，该方法对于优良品种的扩繁存在以下不足：①一个植株所包含的地下休眠芽数量有限，以其为外植体的繁殖效率不高；②每株组培苗只能产生3～5个丛生芽，繁殖系数不高；③整个过程必须经历一个地下芽启动培养的过程，耗费大量的人力、物力，提高成本。胡映泉等人发表的论文‘芍药不定芽的诱导技术’(胡映泉,冯海华,时宝凌.芍药不定芽的诱导技术,山西林业科技,2003,增刊:23-24,33.)对芍药嫩茎进行组织培养，在MS+BA 3.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L培养基上可一步成芽，缩短了成芽时间，但该论文数据较为含糊，统计的时间也未作交代，最终芽的诱导率最高只有74％。孙晓梅等人发表的论文‘芍药愈伤组织诱导及不定芽分化的研究’(孙晓梅,程婉,刘萍,周文强,王丹,杨宏光.芍药愈伤组织诱导及不定芽分化的研究.沈阳农业大学学报,2014-02,45(1):24-27.)对芍药子叶、茎、叶片进行培养，以基部茎为最优的不定芽分化外植体，但分化率只有35％，且需经过愈伤诱导阶段。综上所述，在芍药组织培养过程中，现有技术均成功分化出不定芽，但是他们多以种胚、地下休眠芽、茎段等为外植体，不仅分化率低，而且继代次数多，实验过程繁琐，周期较长，并不能获得理想的效果。

综上，建立芍药品种杭白芍的离体再生快繁体系，为解决芍药种苗短缺的重要途径之一，对芍药南移和芍药的开发和推广利用都具有非常重要的意义。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是公开了一种芍药离体再生体系建立方法。

为了达到上述目的，本采用如下的技术方案：

（1）外植体的获得：3月下旬至4月初选取幼嫩的杭白芍叶片，用清水冲洗干净，然后用安利洗涤剂漂洗一次，摇床上振荡15-20min；流水冲洗3min后，于无菌操作台上用75％乙醇消毒10-20s，立即倒入0.1％的升汞，最后用无菌水洗涤2次，将消毒完毕的叶片切割为2cm长的小段。

（2）愈伤组织制备：取步骤（1）中处理得到的外植体小段，接种于诱导培养基中进行愈伤组织的诱导，培养温度为24-28℃，首先暗培养7-10d，然后进行光照培养25d；所述光照培养条件为：光照时间为14h/d，光照强度为1500lx；所述诱导培养基为MS+蔗糖30g/L+KT1mg/L+IBA0.02mg/L，pH值为5.4-6.0；

（3）不定芽分化：将步骤（2）中诱导得到的愈伤组织，在外植体上切下，接入分化培养基进行不定芽分化，培养温度为24-28℃；光照时间14h/d，光照强度2500lx；所述分化培养基为1/2MS+NAA0.6mg/L+CPPU 0.3mg/L，pH值为5.4-6.0；

（4）继代培养：将诱导得到的不定芽切割后，每芽带0.3cm左右茎段和2-3片叶片，接入继代增殖培养基中进行继代培养25d，培养温度为24-28℃，光照时间为14h/d，光照强度为2500lx；所述继代增殖培养基为1/2MS＋NAA0.5mg/L，pH值为5.4-6.0；

（5）根的诱导：将步骤（4）中继代增殖得到的试管苗接入生根培养基中进行生根培养，培养温度为24-28℃，光照时间为14h/d，光照强度为2000lx；所述生根培养基为1/2MS+2.0mg/L IBA，pH值为5.4-6.0；待不定根长满瓶底，植株整体生长稳健时，可准备移苗出瓶。

(6) 将培养瓶的瓶盖打开，炼苗2-3天，将根浸泡在生根制剂中，15min。

所述生根制剂为微生物促生根剂，其组成包括：

淡紫灰链霉菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、萘乙酸钠、活性炭、蔗糖；

所述淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)为CGMCC NO.2130；

所述解淀粉芽孢杆菌为（Bacillus amyloliquefaciens）ATCC23843；

所述短小芽孢杆菌为（Bacillus pumilus）ATCC7061；

所述生根制剂的具体组成为：

淡紫灰链霉菌发酵液：解淀粉芽孢杆发酵液：短小芽孢杆菌发酵液：萘乙酸钠：活性炭；蔗糖重量比为3:1:3:1:1:2

其制备方法为：首先将淡紫灰链霉菌、解淀粉芽孢杆、短小芽孢杆菌按照常规方式活化，然后培养至菌液中活菌数达到10⁷个/克获得发酵液，将上述发酵液按照质量比例3：1：3混合，按照重量配比添加萘乙酸钠、活性炭、蔗糖即得。

（7）炼苗后移栽入扦插基质中，所述扦插基质优选为：按照1:1的体积比例将珍珠岩和泥炭混匀，喷施稀释50倍的MS稀释液，每天喷水2次，保证湿度，避免阳光直射。

本发明克服了芍药组培快繁过程中污染率高、褐化率高、生根困难、移栽成活率低等问题。

1 外植体的选择与消毒处理，本申请发明人经过大量创造性劳动及多因子实验，全面改进现有技术中的操作参数，发现，按照常规的消毒方式，存在一定的污染率的问题，而采用本申请的操作过程中外植体部位和采集时间，不仅取得了理想的灭菌效果，还能够保证诱导培养所需的外植体数。

2组织培养方法其步骤都具有相似性，其结果却具有显著的不同，本领域公知组织培养方法一般分为暗培养和光培养两个阶段，暗培养一般是诱导愈伤组织，光培养诱导分化。暗培养要求避光，其实是防止迅速分裂的愈伤细胞老化，本申请发明人经过反复实验得出，芍药品种杭白芍先经过一段时间的暗培养，使外植体迅速分裂，然后光诱导培养，其萌发率最高，愈伤出芽更加迅速，缩短组培时间。

3 本领域芍药的组培工作一直效果不甚理想，如CN102124946，其采用两步消毒法，取得的成活率仅25%，而芍药可以被取做外植体的材料包括花、胚，叶等，本申请以能够充分适应南方气候的杭白芍叶片为外植体，充分研究其愈伤、不定芽、生根等生理习性，经过大量的摸索与试验获得本申请系统理论的步骤。

4本领域公知，对于植物组培领域研究如何利用植物组织分化再生植株，提高植物的繁殖数量，是科学家研究重要的技术重点也是技术难点，而激素种类及激素浓度使用范围，培养基类型更是重中之重，本申请发明人经过大量创造性劳动，筛选的到最佳的杭白芍诱导培养基、增殖培养基及生根培养基的成分及激素组合，不仅诱导、增殖效果明显，且出芽时间大大缩短，仅7+25d就能生长愈伤，再诱导25的即可出不定芽，且增殖、生根效果显著。

具体实施方式

实施例一

1 培养基筛选实施例

愈伤途径的离体再生体系建立过程中，愈伤组织分化的成功也即诱导培养基是再生体系的关键步骤。愈伤分化率直接影响着再生组培体系是否可行。愈伤分化培养基由基本培养基和激素种类及浓度搭配对愈伤分化的程度和分化率有着非常大的相关性。本发明尝试了不同基本培养基和不同激素浓度配比，对杭白芍叶片诱导程度的影响见表1。从表1可以看出，MS+蔗糖30g/L+KT 1mg/L+IBA0.02mg/L，杭白芍愈伤组织分化率最高，为最佳愈伤分化培养基。

表1

基础培养基种类	激素组合mg/L	愈伤分化时间（d）	愈伤分化率%
				MS	蔗糖30g/L+KT 1mg/L+IBA0.02mg/	32	87.5
MS	蔗糖30g/L	50	62.13
				MS	TDZ1 mg/L+椰汁5%+蔗糖30%	55	83.27
B5	蔗糖30g/L+KT 1mg/L+IBA0.02mg/	45	43.21
				B5	TDZ1 mg/L+椰汁5%+蔗糖30%	60	48.44

2 生根制剂筛选

本发明尝试了不同生根制剂对杭白芍试管苗生根的影响，表2

表2

本发明生根制剂为专门针对芍药品种杭白芍的营养制剂，其经过大量的调研及实验，淡紫灰链霉菌、解淀粉芽孢杆、短小芽孢杆菌形成一个良好的微生态系统，浸泡后带入基质中构建有利于植物生长，改善植物根际营养环境，其代谢还能加强土壤有机物的分解，各菌种之间合理配伍，共生协调，互不拮抗，萘乙酸钠促进不定根的形成和根的形成，促进插扦生根、促进枝叶茂盛、提高产量，改善品质的作用，提高作物的抗倒伏等抗逆能力。蔗糖不断供给营养，维持苗壮势头，极大的提高植株的适应性，提高整个成活率，活性炭通气性好、吸附能力强，利于微生物活动，增强生物性能，富含有机质、腐殖酸及其他营养成分。现有技术专利CN105123517，虽然也利用愈伤诱导出不定芽，然而，其仅局限于实验室组织培养，没有继续将其炼苗移栽到室外培养，生根粉ABT虽然也能取得88.7%的生根效果，然而其价格较为昂贵，不利于规模化生产。

实施例二

（1）外植体的获得：3月下旬至4月初选取幼嫩的杭白芍叶片，用清水冲洗干净，然后用安利洗涤剂漂洗一次，摇床上振荡15-20min；流水冲洗3min后，于无菌操作台上用75％乙醇消毒10-20s，立即倒入0.1％的升汞，最后用无菌水洗涤2次，将消毒完毕的叶片切割为2cm长的小段；

（2）愈伤组织制备：取步骤（1）中处理得到的外植体小段，接种于诱导培养基中进行愈伤组织的诱导，共接入叶片小段40个，培养温度为24-28℃，首先暗培养7-10d，然后进行光照培养25d；所述光照培养条件为：光照时间为14h/d，光照强度为1500lx；所述诱导培养基为MS+蔗糖30g/L+KT 1mg/L+IBA0.02mg/L，pH值为5.4-6.0；共有35个外植体两端长处绿色愈伤组织，其余外植体小段均已经褐化。

（3）不定芽分化：将步骤（2）中诱导得到的愈伤组织，在外植体上切下，接入分化培养基进行不定芽分化，培养温度为24-28℃；光照时间14h/d，光照强度2500lx；所述分化培养基为1/2MS+NAA0.6mg/L+CPPU 0.3mg/L，pH值为5.4-6.0；接入分化培养基的愈伤小块共106块，愈伤分化率达90.23%，每块愈伤可分化不定芽3-4个。

（4）继代培养：将诱导得到的不定芽切割后，每芽带0.3cm左右茎段和2-3片叶片，接入继代增殖培养基中进行继代培养25d，培养温度为24-28℃，光照时间为14h/d，光照强度为2500lx；所述继代增殖培养基为1/2MS＋NAA0.5mg/L，pH值为5.4-6.0，每茎段可增殖出不定芽6-7个。

（5）根的诱导：将步骤（4）中继代增殖得到的试管苗接入生根培养基中进行生根培养，培养温度为24-28℃，光照时间为14h/d，光照强度为2000lx；所述生根培养基为1/2MS+2.0mg/L IBA，pH值为5.4-6.0；待不定根长满瓶底，植株整体生长稳健时，可准备移苗出瓶。

(6) 将培养瓶的瓶盖打开，炼苗2-3天，将根浸泡在生根制剂中，15min。

所述生根制剂为微生物促生根剂，其组成包括：

淡紫灰链霉菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、萘乙酸钠、活性炭、蔗糖；

所述淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)为CGMCC NO.2130；

所述解淀粉芽孢杆菌为（Bacillus amyloliquefaciens）ATCC23843；

所述短小芽孢杆菌为（Bacillus pumilus）ATCC7061；

所述生根制剂的具体组成为：

淡紫灰链霉菌发酵液：解淀粉芽孢杆发酵液：短小芽孢杆菌发酵液：萘乙酸钠：活性炭；蔗糖重量比为3:1:3:1:1:2

其制备方法为：首先将淡紫灰链霉菌、解淀粉芽孢杆、短小芽孢杆菌按照常规方式活化，然后培养至菌液中活菌数达到10⁷个/克获得发酵液，将上述发酵液按照质量比例3：1：3混合，按照重量配比添加萘乙酸钠、活性炭、蔗糖即得。

（7）炼苗后移栽入扦插基质中，所述扦插基质优选为：按照1:1的体积比例将珍珠岩和泥炭混匀，喷施稀释50倍的MS稀释液，每天喷水2次，保证湿度，避免阳光直射，培养15d后，生根率达到98.4%，成活率达93.7%。

采用本发明杭白芍叶片离体再生建立方法，能够大量获得杭白芍实生苗，解决芍药快速繁殖的问题，通过对最佳外植体、诱导激素水平、生根菌剂的筛选，能够使得一个培养周期内，大量获得杭白芍实生苗，生根率达到98.4%，成活率也获得93.7%，增殖率和移栽成活率的提高大大填补了市场空白，具有广阔的应用前景。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种芍药离体再生体系建立方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：外植体获得-愈伤组织制备-不定芽分化-继代增殖-根诱导-炼苗-移栽。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：

（1）外植体的获得：3月下旬至4月初选取幼嫩的芍药叶片，用清水冲洗干净，然后用洗涤剂漂洗一次，摇床上振荡15-20min；流水冲洗3min后，于无菌操作台上用75％乙醇消毒10-20s，立即倒入0.1％的升汞，最后用无菌水洗涤2次，将消毒完毕的叶片切割为2cm长的小段；

（2）愈伤组织制备：取步骤（1）中处理得到的外植体小段，接种于诱导培养基中进行愈伤组织的诱导，首先暗培养7-10d，然后进行光照培养25d；所述光照培养条件为：光照时间为14h/d，光照强度为1500lx；所述诱导培养基为MS+蔗糖30g/L+KT 1mg/L+IBA 0.02mg/L；

（3）不定芽分化：将步骤（2）中诱导得到的愈伤组织，在外植体上切下，接入分化培养基进行不定芽分化，光照时间14h/d，光照强度2500lx；所述分化培养基为1/2MS+NAA0.6mg/L+CPPU 0.3mg/L；

（4）继代培养：将诱导得到的不定芽切割后，接入含有继代增殖培养基的试管中进行继代培养25d，所述继代增殖培养基为1/2MS＋NAA0.5mg/L；

（5）根诱导：将步骤（4）中继代增殖得到的试管苗接入含有生根培养基的瓶中进行生根培养，所述生根培养基为1/2MS+ IBA 2.0mg/L；待不定根长满瓶底，植株整体生长稳健时，准备移苗出瓶；

(6) 炼苗：将培养瓶的瓶盖打开，炼苗2-3天，然后将根浸泡在生根制剂中，15min；

（7）移栽。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，诱导培养基、分化培养基、继代增殖培养基、生根培养基pH值为5.4-6.0。

4.根据权利要求2-3所述的方法，其特征在于所述生根制剂为微生物促生根剂，其组成包括：

淡紫灰链霉菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、萘乙酸钠、活性炭、蔗糖。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在所述生根制剂的具体组成为：

淡紫灰链霉菌发酵液：解淀粉芽孢杆发酵液：短小芽孢杆菌发酵液：萘乙酸钠：活性炭；蔗糖的重量比为3:1:3:1:1:2。

6.根据权利要求4-5所述的方法，其特征在于：

所述淡紫灰链霉菌为CGMCC NO.2130；

所述解淀粉芽孢杆菌为ATCC23843；

所述短小芽孢杆菌为ATCC7061。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述生根制剂制备方法为：首先将淡紫灰链霉菌、解淀粉芽孢杆、短小芽孢杆菌按照常规方式活化，然后培养至活菌数为10⁷个/克的发酵液，将上述发酵液按照质量比例3:1:3混合，按照重量配比添加萘乙酸钠、活性炭、蔗糖即得。

8.根据权利要求1-7所述方法，其特征在于，所述芍药为杭白芍品种。

9.权利要求1-8所述方法用于获得芍药离体再生体系的用途。

10.权利要求1-9所述方法获得的杭白芍外植体。