CN103190347A - 一种茶壶枣组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种茶壶枣组织培养方法，包括如下步骤：剪取大田茶壶枣带芽茎尖，自来水洗净后，置于酒精中消毒，用升汞灭菌，无菌水冲洗干净后，接种于启动培养基，转接至分生培养基，然后转接至继代培养基，最后在生根培养基中完成整个组培体系的建立，在人工控制的光照、温度条件下无菌培养，移栽。按本发明实施例进行的茶壶枣的离体快速繁殖，从接种至生根仅需要70天，即可下地移栽至育苗床，诱导成活率高达97％，增值倍数为10倍，移栽生根率也高达95％。
Description
技术领域
本发明涉及植物的组织培养方法，具体涉及一种通过茶壶枣无菌短枝扦插方法获得茶壶枣组培苗的方法。
背景技术：
枣（Ziziphus jujubeMill）为鼠李科（Rhamnaceae）枣属（ZiziphusMill）植物，是原产于我国的特有经济树种。枣树适应性强，抗旱，耐盐碱、耐瘠薄，具有良好的水土保持作用。果实含有非常丰富的糖、Vc、cAMP以及蛋白质、脂肪、Vp、B族维生素和Fe、P、Ca、Zn等人类必需的物质，具有很高的营养价值和食疗价值。
枣树种类繁多，高度杂合，遗传背景复杂，具有花小、坐果率低、早期胚败育等特点，造成去雄和人工授粉困难，不易得到杂种后代，种质创新远远落后于其他果树，利用组织培养可以进行苗木的快繁、无病毒苗木的培育、种质资源的离体保存，同时也为生物技术育种奠定基础。随着现代生物技术的发展，给果树育种开辟了全新的道路，进行了体细胞变异的诱导和利用花粉和花药培养、植物的遗传转化及与植物遗传育种相关的其他分子生物学技术。在枣树生产不断发展的同时，国内外学者在花药培养和原生质体培养方面取得了一定的进展，也开展了枣不定芽再生体系的研究，在枣茎段、叶片、体细胞胚形成和胚挽救等方面取得了很大的进展。利用花药培养、原生质体融合及不定芽再生体系进行了种质创新和新品种选育，这为今后原生质体融合、基因工程等现代育种技术在枣品种改良中的应用奠定了技术基础。
茶壶枣原产于山东,通常在枣身肩部或近肩部长出一对对角排列的肉质突出物，因突出物酷似茶壶的壶嘴、壶把而得名，形状奇特，艳丽美观。果皮薄，紫红色，富光泽鲜艳，果肉绿白色，质地粗松略绵，汁液中多，味甜略酸，鲜食品质较优，是一种有极高的观赏价值食用为一体的优良经济植物。适合于园林、庭院、盆栽或点缀花坛、草坪的新型绿化树种。利用组织培养的方法,不仅可以建立茶壶枣的脱毒系,同时还可以加速茶壶枣苗木的繁育速度。然而常规的组织培养方法所获得的茶壶枣组培苗成活率低，难以大面积的推广使用。
发明内容：
本发明针对现有技术存在的所述不足，提供一种茶壶枣组织培养方法，通过对工艺流程和培养基的选择和优化，使得能够更加有效、方便的在短时间内获得大量茶壶枣组培苗，所获得的组培苗成活率高。
本发明实施例提供的茶壶枣组织培养方法，包括如下步骤：剪取大田茶壶枣带芽茎尖，自来水洗净后，至于酒精中消毒，用升汞灭菌，无菌水冲洗干净后，接种于启动培养基，转接至分生培养基，然后转接至继代培养基，最后在生根培养基中完成整个组培体系的建立。在人工控制的光照、温度条件下无菌培养，移栽。
其中，所述消毒酒精浓度为75%，消毒时间为30s，灭菌使用0.1%的氯化汞，灭菌时间为7min，无菌水冲洗6次。
其中，所述启动培养基配方为MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L+萘乙酸0.1mg/L+聚乙烯吡咯烷酮1g/L+蔗糖30g/L+倍立凝6g/L，pH=6，培养时间为30d。
其中，所述继代培养基配方为MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L+吲哚丁酸0.5mg/L+聚乙烯吡咯烷酮1g/L+蔗糖30g/L+倍立凝6g/L，pH=6，培养时间为35d。
其中，所述继代培养基配方为MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L+吲哚丁酸0.5mg/L+聚乙烯吡咯烷酮1g/L+蔗糖30g/L+倍立凝6g/L，pH=6，培养时间为35d。
其中，所述生根培养基配方为改良MS培养基+吲哚丁酸0.4mg/L+聚乙烯吡咯烷酮1g/L+蔗糖20g/L+倍立凝6g/L，pH=6，培养时间为35d。
其中，所述大田茶壶枣带芽茎段的采集地点为北京林业大学河北沧州枣树育种实践基地，时间为当年4月中下旬到5月中旬。
其中，所述人工控制的光照、温度条件为光照强度2000lx±100lx，光照时间14h/d，温度25±1℃。
优选的，本发明中的茶壶枣选自山东茶壶枣。
所述MS基本培养基为本领域常见的MS培养基，其实例包括但不限于（Murashige and Skoog，1962）所列举的配方：
在本发明的一个优选实施方式中，所述的改良MS培养基为
附图说明
图1为本发明实施例中的茶壶枣在分生培养基中培养15天后的照片；
图2为本发明实施例中的茶壶枣在继代培养基中培养25后的照片；
图3为本发明实施例中的茶壶枣在生根培养基中培养30天后的照片。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将在具体实施例进行详细描述。如果没有特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域普通技术人员熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本发明实施例提供的茶壶枣组织培养方法，包括如下步骤：
剪取大田茶壶枣带芽茎尖，自来水洗净后，至于酒精中消毒，用升汞灭菌，无菌水冲洗干净后，接种于启动培养基，转接至分生培养基，然后转接至继代培养基，最后在生根培养基中完成整个组培体系的建立。在人工控制的光照、温度条件下无菌培养，移栽。
其中，所述消毒酒精浓度为75%，消毒时间为30s，灭菌使用0.1%的氯化汞，灭菌时间为7min，无菌水冲洗6次。
其中，所述启动培养基配方为MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L+萘乙酸0.1mg/L+聚乙烯吡咯烷酮1g/L+蔗糖30g/L+倍立凝6g/L，pH=6，培养时间为30d。
其中，所述继代培养基配方为MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L+吲哚丁酸0.5mg/L+聚乙烯吡咯烷酮1g/L+蔗糖30g/L+倍立凝6g/L，pH=6，培养时间为35d。
其中，所述继代培养基配方为MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L+吲哚丁酸0.5mg/L+聚乙烯吡咯烷酮1g/L+蔗糖30g/L+倍立凝6g/L，pH=6，培养时间为35d。
其中，所述生根培养基配方为改良MS培养基+吲哚丁酸0.4mg/L+聚乙烯吡咯烷酮1g/L+蔗糖20g/L+倍立凝6g/L，pH=6，培养时间为35d。
其中，所述大田茶壶枣带芽茎段的采集地点为北京林业大学河北沧州枣树育种实践基地，采集时间为当年4月中下旬到5月中旬。
其中，所述人工控制的光照、温度条件为光照强度2000lx±100lx，光照时间14h/d，温度25±1℃。
优选的，本发明中的茶壶枣选自山东茶壶枣。
所述MS基本培养基为本领域常见的MS培养基，其实例包括但不限于（Murashige and Skoog，1962）所列举的配方：
在本发明的一个优选实施方式中，所述的改良MS培养基为
具体实施步骤如下：
1、5月初，在北京林业大学河北沧州枣树育种实践基地，当大田茶壶枣茎尖萌发长至3-5cm左右时，用剪刀在选取的较为粗壮带芽茎尖底部剪断，收集。
2、外植体置于用纱布封口的烧杯中，自来水下冲洗20min。转移到无菌操作台中的75%酒精内消毒30s后，使用0.1%的氯化汞灭菌7min，期间保持摇晃，然后无菌水冲洗6次以上，确保外植体表面没有升汞残留，剪掉茎段底部伤口长度约1mm。
3、配制培养基需先按照配方配制好母液，取定量的母液混匀，添加指定浓度的激素，称取蔗糖，混匀，定容1L，调节ph，添加倍立凝，煮沸，分装，进行121℃5分钟高压灭菌，下同。
4、将灭菌后的外植体接种到启动培养基中，即MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L+萘乙酸0.1mg/L+聚乙烯吡咯烷酮1g/L+蔗糖30g/L+倍立凝6g/L，pH=6。在光照强度2000lx±100lx，光照时间14h/d，温度26℃条件下培养30d。
5、将经过启动培养后的茎段底部褐化部分剪掉，剪成高约1cm的带叶茎段，转接到分生培养基（MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L+吲哚丁酸0.5mg/L+聚乙烯吡咯烷酮1g/L+蔗糖30g/L+倍立凝6g/L，pH=6）中，在光照强度2000lx±100lx，光照时间14h/d，温度26℃条件下培养。
6、经过一段时间的培养以后，可以明显的观察到茎段底部分生出不定芽，待分生芽长至0.3mm时，即可分离新长出来的不定芽，依次转接到继代培养基（MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L+吲哚丁酸0.5mg/L+聚乙烯吡咯烷酮1g/L+蔗糖30g/L+倍立凝6g/L，pH=6）中，在光照强度2000lx±100lx，光照时间14h/d，温度26℃条件下培养30d。约20d后此间可以获得大量长度约为4cm组培苗。如需长期保存品种苗木，则每30d更换一次培养基。
7、将得到的苗移到生根培养基（改良MS培养基+吲哚丁酸0.4mg/L+聚乙烯吡咯烷酮1g/L+蔗糖20g/L+倍立凝6g/L，pH=6）中，一个月后可以明显观察到茶壶枣组培苗有粗壮白根生出。
8、将已生根的组培苗，在温室内开瓶炼苗2.5天后，洗净根部的培养基，用10％的ABT生根粉药液蘸根30s后栽植到细河沙：蛭石：珍珠岩=1:1:1的基质中，浇足水，保持70％的湿度至组培苗成苗，待40天后，组培苗已经长出很多的毛细根系，长8cm左右，转移至营养钵中继续生长，等待出圃。
按此实施实例进行茶壶枣的离体快速繁殖，从接种至生根仅需要70天，即可下地移栽至育苗床，诱导成活率高达97％，增值倍数为10倍，移栽生根率也高达95％。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种茶壶枣组织培养方法，其特征在于，包括如下步骤：剪取大田茶壶枣带芽茎尖，自来水洗净后，置于酒精中消毒，用升汞灭菌，无菌水冲洗干净后，接种于启动培养基，转接至分生培养基，然后转接至继代培养基，最后在生根培养基中完成整个组培体系的建立，在人工控制的光照、温度条件下无菌培养，移栽。
2.根据权利要求1所述茶壶枣组织培养方法，其特征在于，所述消毒酒精浓度为70-80%，消毒时间为25-35s，灭菌使用0.05-0.15%的氯化汞，灭菌时间为5-9min，无菌水冲洗4次以上。
3.根据权利要求1或2所述茶壶枣组织培养方法，其特征在于，所述启动培养基配方为MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤1.0-3.0mg/L+萘乙酸0.05-0.15mg/L+聚乙烯吡咯烷酮0.8-1.2g/L+蔗糖20-40g/L+倍立凝4-8g/L，pH=5.5-6.5，培养时间为25-35天。
4.根据权利要求3所述的茶壶枣组织培养方法，其特征在于，所述分生培养基配方为MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤3.0-5.0mg/L+萘乙酸0.05-0.15mg/L+聚乙烯吡咯烷酮0.8-1.2g/L+蔗糖20-40g/L+倍立凝4-8g/L，pH=5.5-6.5，培养时间为30-40d。
5.根据权利要求4所述的茶壶枣组织培养方法，其特征在于，所述继代培养基配方为MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤1.5-2.5mg/L+吲哚丁酸0.4-0.6mg/L+聚乙烯吡咯烷酮0.8-1.2g/L+蔗糖20-40g/L+倍立凝4-8g/L，pH=5.5-6.5，培养时间为30-40d。
6.根据权利要求5所述的茶壶枣组织培养方法，其特征在于，所述生根培养基配方为改良MS培养基+吲哚丁酸0.3-0.5mg/L+聚乙烯吡咯烷酮0.8-1.2g/L+蔗糖15-25g/L+4-8g/L，pH=5.5-6.5，培养时间为30-40d。
7.根据权利要求1所述的茶壶枣组织培养方法，其特征在于，所述大田茶壶枣带芽茎段的采集时间为当年4月中下旬到5月中旬。
8.根据权利要求1所述的茶壶枣组织培养方法，其特征在于，所述人工控制的光照、温度条件为光照强度2000lx±100lx，光照时间14±2h/d，温度25±2℃。
9.根据权利要求6所述的茶壶枣组织培养方法，其特征在于，所述改良MS培养基的配方如下表所示：
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