CN101897297B - 一种萱草组织培养两步成苗的快繁方法 - Google Patents

Abstract

一种萱草组织培养两步成苗的快繁方法，该方法是：先将作为外植体的萱草幼嫩花梗进行消毒处理，然后将其切割成1～1.5cm后接种到诱导及分化培养基上；2.5～3个月后选择苗高4～6cm、4片叶子以上的无菌苗转接到生根培养基上进行生根培养；当组培苗每株生根3条以上、不定根长达2～4cm时，打开瓶盖，在室内炼苗3～4天后，将组培苗从培养瓶中取出，洗去培养基，将其移栽至灭菌的栽培基质中；它能在短时间内大量繁殖出优质的萱草组培苗，从而满足大规模生产的需求，并减少了配制培养基和转瓶的步骤，因此简单易行、生产成本降低。

Description

一种萱草组织培养两步成苗的快繁方法

技术领域

本发明涉及的是一种萱草的组织培养两步成苗的简易快繁方法，特别是涉及到以幼嫩花梗为外植体的萱草组织培养。 

背景技术

萱草(Hemerocallis.sp)是百合科多年生的草本植物，该植物“观为花，食为菜，用为药”，具有用途广泛、适应性强、栽培容易、管理简单、收益快、效益高、经济寿命长等特点。所有这些，对于美化环境，增进人民体质，开发山区经济，增加出口等均具有重要意义，市场对其需求不断增加。在自然界，该属植物可采用播种、分株等方式进行繁殖，由于该植物杂种性强，种子繁殖难以保持优良性状，而且部分品种结实率低或种子萌芽率低，因此生产中很少采用有性繁殖的方式。分株繁殖较为常用，且植株容易存活，但因其萌蘖能力不强、增殖速度慢，一般1株萱草每年仅可繁殖1～5株，因而难以适应市场商品化生产的需求。 

植物组织培养作为上世纪发展起来的一门新技术，已一跃成为一种大规模批量工厂化生产种苗的新方法，并在花卉生产上得到越来越广泛的应用。采用该技术繁殖萱草，可大幅提高种苗的质量和产量，是解决优良品种大量繁殖的最有效途径，不仅可以克服常规繁殖方法的不足，提高繁殖系数，加快其繁殖速度，还可打破季节局限，实现工厂化育苗，满足市场的需求。目前，萱草的组培育苗主要通过“愈伤组织的诱导、产生不定芽→芽的增殖→组培苗生根”三个阶段来完成，并根据不同阶段配制相应培养基进行转瓶，步骤较为繁琐，生产成本较高。因此，如何简化培养步骤，降低生产成本成为促进萱草组培苗生产的当务之急。 

发明内容

本发明的目的是针对现有组织培养技术中存在的问题，提供一种以幼嫩花梗为外植体的、用“丛生芽的诱导→组培苗生根”两步法实现萱草的组织培养快繁方法，该方法可以大量快速地繁殖出品质优良的萱草组培苗。 

为达到上述目的，本发明采用的解决方案是：先将作为外植体的萱草幼嫩花梗进行消毒处理，然后将其切割成1～1.5cm后接种到诱导及分化培养基上；2.5～3个月后选择苗高4～6cm、4片叶子以上的无菌苗转接到生根培养基上进行生根培养；当组培苗每株生根3 条以上、不定根长达2～4cm时，打开瓶盖，在室内炼苗3～4天后，将组培苗从培养瓶中取出，洗去培养基，将其移栽至灭菌的栽培基质中； 

上述诱导及分化培养基为：以MS为基本培养基，每升添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)2～10mg、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0～2mg、α-萘乙酸(NAA)0.2～1mg、琼脂4.5g和蔗糖30g，pH值调节至5.8； 

上述生根培养基为：以1/2MS为基本培养基，每升添加NAA 0.1～2.0mg、琼脂4.5g和蔗糖15～30g，pH值调节至5.8； 

上述诱导及分化培养条件为：温度25±1℃，光照时间为12小时/天，光照强度在愈伤组织阶段为1000lx，待诱导出后幼苗为2000lx； 

上述生根培养条件为：温度25±1℃，光照时间为12小时/天，光照强度为2200lx。 

上述解决方案中可采用的外植体消毒处理的灭菌剂有70～75％乙醇、次氯酸钠溶液、氯化汞溶液等，本发明优选的方法是先用加入少量洗衣粉的水浸泡5分钟后，用流水冲洗2～3小时；在无菌条件下(在水平超净工作台上)，将花梗在75％的酒精中浸泡10秒后，在0.1％的升汞溶液中浸泡15分钟，用无菌水仔细冲洗8次。 

上述解决方案中的最佳诱导及分化培养基为：以MS为基本培养基，每升添加6-BA 4mg、2，4-D 1mg、NAA 0.5mg。采用这种激素配比的培养基配方，经过2.5～3个月的培养，不定芽的增殖率最高，可以达到5.2，而且芽生长迅速、健壮； 

上述解决方案中的最佳生根培养基为：以1/2MS为基本培养基，每升添加NAA 1.0mg、琼脂4.5g和蔗糖15g。采用这种配比的培养基进行生根培养时，生根率较高，且根系粗壮； 

上述解决方案中将组培苗移栽至灭菌的培养基质中(等比例的壤土、粗沙和蛭石混匀)，并适当遮光，并保持温度在18～22℃，相对湿度为80～85％，保持一周左右后逐渐去掉遮阴设施、降低空气湿度，待幼苗适应环境后即可进入大田管理，植株成活率可达90％。本发明通过合理调节激素的种类配比和浓度，得到了健壮的萱草组培苗，经过3～4个月的培养，其增殖率达5.2。移栽至大田后，生长良好，达到生产要求。 

因此，本发明具有的优点是：能在短时间内大量繁殖出优质的萱草组培苗，从而满足大规模生产的需求。另外实施本发明方法，减少了配制培养基和转瓶的步骤，因此简单易行、生产成本降低。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。 

本发明所述的以幼嫩花梗为外植体的萱草组织培养两步成苗的快繁方法，它是先将作为外植体的萱草幼嫩花梗进行消毒处理，然后将其切割成1～1.5cm后接种到诱导及分化培养基上；2.5～3个月后选择苗高4～6cm、4片叶子以上的无菌苗转接到生根培养基上进行生根培养；当组培苗每株生根3条以上、不定根长达2～4cm时，打开瓶盖，在室内炼苗3～4天后，将组培苗从培养瓶中取出，洗去培养基，将其移栽至灭菌的栽培基质中； 

上述诱导及分化培养基为：以MS为基本培养基，每升添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)2～10mg、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0～2mg、α-萘乙酸(NAA)0.2～1mg、琼脂4.5g和蔗糖30g，pH值调节至5.8； 

上述生根培养基为：以1/2MS为基本培养基，每升添加NAA 0.1～2.0mg、琼脂4.5g和蔗糖15～30g，pH值调节至5.8； 

上述诱导及分化培养条件为：温度25±1℃，光照时间为12小时/天，光照强度在愈伤组织阶段为1000lx，待诱导出后幼苗为2000lx； 

上述生根培养条件为：温度25±1℃，光照时间为12小时/天，光照强度为2200lx。 

上述解决方案中可采用的外植体消毒处理的灭菌剂有70～75％乙醇、次氯酸钠溶液、氯化汞溶液等，本发明优选的方法是先用加入少量洗衣粉的水浸泡5分钟后，用流水冲洗2～3小时；在无菌条件下(在水平超净工作台上)，将花梗在75％的酒精中浸泡10秒后，在0.1％的升汞溶液中浸泡15分钟，用无菌水仔细冲洗8次。 

上述解决方案中的最佳诱导及分化培养基为：以MS为基本培养基，每升添加6-BA 4mg、2，4-D 1mg、NAA 0.5mg。采用这种激素配比的培养基配方，经过2.5～3个月的培养，不定芽的增殖率最高，可以达到5.2，而且芽生长迅速、健壮； 

上述解决方案中的最佳生根培养基为：以1/2MS为基本培养基，每升添加NAA 1.0mg、琼脂4.5g和蔗糖15g。采用这种配比的培养基进行生根培养时，生根率较高，且根系粗壮； 

上述解决方案中将组培苗移栽至灭菌的培养基质中(等比例的壤土、粗沙和蛭石混匀)，并适当遮光，并保持温度在18～22℃，相对湿度为80～85％，保持一周左右后逐渐去掉遮阴设施、降低空气湿度，待幼苗适应环境后即可进入大田管理，植株成活率可达90％。 

实施例1， 

(一)培养基的准备， 

(1)配制： 

①诱导及分化培养基：以MS为基本培养基，每升添加6-BA 4mg、2，4-D 1mg、NAA 0.5mg、琼脂4.5g和蔗糖30g，pH值调节至5.8； 

②生根培养基：以1/2MS为基本培养基，每升添加NAA 1.0mg、琼脂4.5g和蔗糖15g，pH值调节至5.8； 

(2)分装：将配制后的培养基加热至透明，趁热分装于干净的培养瓶中，每瓶约70ml； 

(3)灭菌：培养基分装后尽快将培养瓶口密封，并及时放入高压灭菌锅内进行消毒灭菌。灭菌条件为：121℃、0.1MPa下灭菌20分钟。灭好的培养基从高压锅中取出后，放在平整的台面上，让其自然冷却凝固。 

(二)外植体的灭菌：选择生长健壮、无病虫害的幼嫩萱草花梗为外植体材料，用加入少量洗衣粉的水浸泡5分钟后，用流水冲洗2～3小时；在无菌条件下(在水平超净工作台上)，将花梗在75％的酒精中浸泡10秒后，用0.1％的升汞溶液中浸泡15分钟，用无菌水仔细冲洗8次后备用。 

(三)接种：将灭菌后的花梗在无菌条件下切成1～1.5cm左右的小段，接种于诱导及分化培养基上，每瓶接种1～2个材料。 

(四)培养：将接种后的培养瓶放入培养室进行幼苗的诱导，条件为：温度25±1℃，光照时间为12小时/天，光照强度在愈伤组织阶段为1000lx，待诱导出幼苗后为2000lx。接种后15天，统计污染率为12.8％，诱导率为81％。培养2.5～3个月后，增殖率可以达到5.2。 

(五)生根：选择苗高4～6cm、4片叶子以上的组培苗，转入生根培养基中培养，温度25±1℃，光照时间为12小时/天，光照强度为2200lx，培养0.5～1个月后，生根率达到89％，平均每株生根3.2条，根系生长粗壮。 

(六)移栽：待组培苗每株生根3条以上、不定根长达2～4cm时，进入炼苗阶段。可在培养室中逐步打开培养瓶盖，并增强光照，此过程需要3～4天。待组培苗适应外界较低的空气湿度条件后，洗净附着在根部的培养基，移至灭菌的培养基质中(等比例的壤土、粗沙和蛭石混匀)，并适当遮光，保持温度在18～22℃，相对湿度为80～85％，保持一周左右后逐渐去掉遮阴设施、降低空气湿度，待幼苗适应环境后即可进入大田管理。植株成活率可达90％。 

实施例2， 

外植体灭菌时将花梗在75％的酒精中浸泡10秒后，在0.1％的升汞溶液中浸泡10分钟，其它步骤同实施例1。采用该灭菌方法，15天后外植体的污染率为33％，高于实施例1。 

实施例3， 

外植体灭菌时将花梗在75％的酒精中浸泡10秒后，在0.1％的升汞溶液中浸泡20分钟，其它步骤同实施例1。采用该灭菌方法，15天后外植体的污染率为2.4％，低于实施例1。但诱导率为25％，且后期增殖率为1.3，均低于实施例1，且组培苗生长瘦弱，生根困难。 

实施例4， 

诱导及分化培养基：以MS为基本培养基，每升添加6-BA 2mg、2，4-D 1mg、NAA 0.5mg，其它步骤同实施例1；诱导率为53％，培养2.5～3个月后，增殖率可以达到3.4。 

实施例5， 

诱导及分化培养基：以MS为基本培养基，每升添加6-BA 4mg、NAA 0.5mg，其它步骤同实施例1；诱导率为48％，培养2.5～3个月后，增殖率可以达到2.7。 

实施例6， 

诱导及分化培养基：以MS为基本培养基，每升添加6-BA 4mg、2，4-D 1mg、NAA 1mg，其它步骤同实施例1；诱导率为79％，培养2.5～3个月后，增殖率可以达到5.1。诱导率和增殖率与实施例1差别不大，且组培苗生长健壮，但成本略高于实施例1。 

实施例7， 

生根培养基：以1/2MS为基本培养基，每升添加NAA 1.0mg、蔗糖30g，其它步骤同实施例1。采用该配方诱导组培苗生根，0.5～1个月后，生根率达83％，每株平均生根2.8条，根系生长较粗壮。 

实施例8， 

生根培养基：以1/2MS为基本培养基，每升添加NAA 2.0mg、蔗糖30g，其它步骤同实施例1。采用该配方诱导组培苗生根，0.5～1个月后，生根率达88％，每株平均生根3.9条，根系生长较细弱，移栽后成活率低。 

实施例9 

生根培养基：以1/2MS为基本培养基，每升添加NAA 2.0mg、蔗糖15g，其它步骤同实施例1。采用该配方诱导组培苗生根，0.5～1个月后，生根率达75％，每株平均生根2.2条，根系生长情况一般。 

Claims (5)

1.一种萱草组织培养两步成苗的快繁方法，其特征在于该方法是：先将作为外植体的萱草幼嫩花梗进行消毒处理，然后将其切割成1～1.5cm后接种到诱导及分化培养基上；2.5～3个月后选择苗高4～6cm、4片叶子以上的无菌苗转接到生根培养基上进行生根培养；当组培苗每株生根3条以上、不定根长达2～4cm时，打开瓶盖，在室内炼苗3～4天后，将组培苗从培养瓶中取出，洗去培养基，将其移栽至灭菌的栽培基质中；

上述诱导及分化培养基为：以MS为基本培养基，每升添加6-BA 2～4mg、2，4-D 0～1mg、NAA0.5～1mg、琼脂4.5g和蔗糖30g，pH值调节至5.8；

上述生根培养基为：以1/2MS为基本培养基，每升添加NAA1.0～2.0mg、琼脂4.5g和蔗糖15～30g，pH值调节至5.8；

上述诱导及分化培养条件为：温度25±1℃，光照时间为12小时/天，光照强度在愈伤组织阶段为1000lx，待诱导出幼苗后为2000lx；

上述生根培养条件为：温度25±1℃，光照时间为12小时/天，光照强度为2200lx。

2.根据权利要求1所述的萱草组织培养两步成苗的快繁方法，其特征在于该方法采用的外植体消毒处理是：先用加入少量洗衣粉的水浸泡5分钟后，用流水冲洗2～3小时；在无菌条件下，将花梗在75％的酒精中浸泡10秒后，用0.1％的升汞溶液浸泡15分钟，无菌水仔细冲洗8次。

3.根据权利要求1所述的萱草组织培养两步成苗的快繁方法，其特征在于所述的诱导及分化培养基为：以MS为基本培养基，每升添加6-BA4mg、2，4-D 1mg、NAA0.5mg。

4.根据权利要求1所述的萱草组织培养两步成苗的快繁方法，其特征在于所述的生根培养基为以1/2MS为基本培养基，每升添加NAA 1.0mg、琼脂4.5g和蔗糖15g。

5.根据权利要求1所述的萱草组织培养两步成苗的快繁方法，其特征在于生根后的组培苗移栽至灭菌的培养基质中，并适当遮光，保持温度在18～22℃，相对湿度为80～85％，保持一周左右后逐渐去掉遮阴设施、降低空气湿度，待幼苗适应环境后即可进入大田管理，植株成活率达90％。