CN101637123B - 南岭莪术的组织培养快速繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种南岭莪术的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：(1)不定芽诱导培养：取南岭莪术的顶芽或根状茎上的吸芽为外植体，接种至诱导培养基中进行培养至不定芽形成；(2)继代增殖培养：将步骤(1)中形成的不定芽转接入新的诱导培养基中进行继代增殖培养，得到继代增殖的丛生芽；(3)生根培养：将步骤(2)所得的丛生芽分离并接种至培养基中进行壮苗和生根培养，得到具有不定根的试管苗；(4)试管苗移栽：将步骤(3)中的试管苗移栽至培养基质中炼苗培育后，用于移栽上盆。以南岭莪术的顶芽或根状茎上的吸芽作为外植体进行组织培养繁殖南岭莪术，不受季节变化的影响，可以随时进行繁殖。

Description

南岭莪术的组织培养快速繁殖方法

技术领域

本发明涉及一种植物的组织培养方法，尤其涉及一种南岭莪术的组织培养快速繁殖方法。

背景技术

南岭莪术(Curcuma nanlinensis)，一种很少见的植物品种，属于姜科姜黄属，多年生球根草本花卉。株高30-60厘米，植株丛生，叶片长椭圆形，亮绿色。株形挺拔整齐，生机盎然，喜光又耐阴，是极好的室内盆栽观叶植物，亦适合庭园栽培观赏。花期4-10月，圆柱形的穗状花序从根茎抽出，紫红色的苞片在花序上排列紧密，形如宝塔状，且艳丽而持续时间长，可作花境、花坛布置。此外，南岭莪术也是切花的优雅花材，瓶插寿命可达15-20天，极具观赏性。

花卉是具有很强时令性、新颖性、奇特性、文化性的产品，新品种不仅是最主要的生产资料，而且也是决定花卉产品竞争力的基本要素。南岭莪术株形好，花叶兼美，在观赏方面具有巨大的潜在价值。在追求花卉品种新、奇、特的今天，南岭莪术在观赏性方面将具有广阔的应用前景。

然而，目前南岭莪术通常采用根茎繁殖，即分切地下茎进行繁殖，每年春季3-4月种植，5-7月开花，10月以后叶片枯萎凋落，地下茎会停止生长进入休眠，直至第二年春季地下茎再次萌发。因此地下茎的这种休眠特性决定了其生长会受到季节限制，不能满足花卉周年生产的需要。而且一个成熟的地下茎一年只能产生新芽3-5个，繁殖倍数只有3-5倍，繁殖系数低，繁殖速度慢，生产成本高，且一年一生，导致生产规模难以扩大，难以使南岭莪术在花卉市场占据一席之地。

发明内容

本发明的目的是提供一种南岭莪术的组织培养快速繁殖方法。该方法能够加快南岭莪术的繁殖速度，有利于扩大生产规模。

本发明的目的是通过以下技术措施来实现的：一种南岭莪术的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：

(1)不定芽诱导培养：取南岭莪术的顶芽或根状茎上的吸芽为外植体，接种至诱导培养基中进行培养至不定芽形成；

(2)继代增殖培养：将步骤(1)中形成的不定芽转接入新的诱导培养基中进行继代增殖培养，得到继代增殖的丛生芽；

(3)生根培养：将步骤(2)所得的丛生芽分离并接种至培养基中进行壮苗和生根培养，得到具有不定根的试管苗；

(4)试管苗移栽：将步骤(3)中的试管苗移栽至培养基质中炼苗培育后，用于移栽上盆。

本发明以南岭莪术的顶芽或根状茎上的吸芽为外植体，经不定芽诱导培养和继代增殖培养后由原来的一个芽形成具有多个芽的丛生芽，所得的丛生芽可再分切成小团转接到新鲜的培养基上继续进行继代增殖培养，如此周而复始，不断重复可获得大量的芽，等到需要出瓶移栽时才切成单个的芽至生根培养基中，使其伸长叶片并长出根，从而得到一株株试管苗，然后出瓶移栽到培养基质中炼苗培育成健壮的幼苗，使其先适应外界环境，然后成活的幼苗可用于移栽上盆。

本发明可作以下改进：所述步骤(1)中取南岭莪术的顶芽或具有吸芽的根状茎放入0.1％的多菌灵溶液中浸泡杀菌8～12分钟，然后在28～30℃温度下培养至顶芽或根状茎上的吸芽萌发形成具有一定长度的新芽，再接种至诱导培养基中进行不定芽培养。

本发明还可作以下改进：在所述步骤(1)中前述的顶芽或根状茎上的吸芽萌发形成具有一定长度的新芽后，切下新芽去除叶片后的芽体作为外植体先进行消毒处理，然后再接种至诱导培养基中进行不定芽培养。此时芽尖和叶片基部间的间隙伸长，有利于对芽进行消毒，去除附着在顶芽和吸芽上的细菌，降低芽在后续培养过程中的腐烂率，提高成活率。

本发明中可采用光培养使顶芽或根状茎上的吸芽萌发形成新芽，也可以采用黑暗培养使顶芽或根状茎上的吸芽萌发形成新芽。所述的光培养是在光照的条件下进行培养；所述的黑暗培养是在避光的条件下进行培养。在实际的操作中，需要加快南岭莪术的顶芽或吸芽萌发新芽的速度，可优选黑暗培养以促使顶芽或根状茎上的吸芽萌发形成新芽，而培养的时间优选10～15天，此时顶芽或根状茎上的吸芽已萌发形成5～7cm的新芽，芽尖和叶片基部间的间隙大小已满足彻底消毒的要求。若培养时间少于10天，芽尖和叶片基部间没有足够大的间隙，则不利于彻底消毒去除细菌；而培养时间超过15天，生产周期长，增加生产成本。

作为本发明的一种优选实施方式：在前述的本发明步骤(1)中所述的新芽去除叶片后作为外植体的芽体长度是0.5～1cm。因为若芽体太短，消毒剂比较容易对芽体造成伤害，影响芽体在后续培养中成活率；若芽体太长，则会加大消毒面积，容易导致消毒不彻底，增加污染率。

作为本发明的一个实施方式，前述的消毒处理步骤是：将芽体用75％酒精浸泡20～30秒，取出用无菌水清洗后，再置于0.1％的升汞溶液消毒10～15分钟，然后取出用无菌水清洗干净。

在所述步骤(2)和(3)中，为了不浪费培养基中的营养，在不定芽培养和丛生芽培养时可以充分利用诱导培养基中的营养后才进行转接，而经发明人长期研究发现，在不定芽长至3～5cm时，培养基中的营养成分刚好被利用完全。因此，本发明还可作以下改进：在步骤(2)中将不定芽培养至3～5cm时，转接入新的诱导培养基中进行继代增殖培养。

在步骤(3)中将丛生芽培养至3～5cm时，转接至培养基中进行壮苗和生根培养。

本发明所述步骤(1)和(2)中的诱导培养基可以是添加了植物生长调节剂的培养基，包括生根剂和细胞分裂素，其中常用的有2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、6-苄基嘌呤(6-BA)等。

作为本发明的一个优选实施方式，所述的诱导培养基采用含有0.3-0.8毫克/升噻苯隆和0.01-0.05毫克/升萘乙酸的培养基，使用该诱导培养基，一个继代增殖周期1个芽可增殖形成15～20个芽。

本发明步骤(2)的继代增殖培养周期至少需要30天。如果继代增殖周期少于30天，培养基中营养成分还没有充分利用，造成资源浪费。考虑到生产效率及成本，优选的继代增殖培养周期为30～40天，因为此时培养基中的营养已基本被利用完全，丛生芽的芽高度达到了3～5cm。

本发明步骤(4)中所述的试管苗选择叶长5cm以上具有不定根的试管苗，这样的试管苗长得较壮，出瓶后成活率高；最好选择叶长在6cm以上，不定根长度在2cm以上的试管苗。

本发明步骤(4)中试管苗在培养基质中的炼苗培育时间为至少一个月，在培育期间注意浇水、遮阴、保温，使试管苗培育炼苗成健壮的幼苗。南岭莪术性喜温暖、湿润和日照充足的环境，保持土壤湿润，特别是刚种植时要浇透水；夏季以遮荫度30％为宜，其它季节可全日照；生长适温为22～32℃，夜温20～22℃。

在本发明步骤(4)中所述的培养基质可以选用沙、椰糠和珍珠岩中的一种或两种或三种的混合。当选用沙、椰糠和珍珠岩三种的混合，它们之间的优选比例为1∶1～3∶1～2。

本发明中的培养基选用组织培养常用的MS基本培养基。

由于南岭莪术是热带花卉，因此，本发明步骤(1)至步骤(4)中的培养的温度在25-30℃范围内，而光照条件采用常用的组织培养光照条件既可：光照强度1500～2000lx，光照周期12～14小时/天。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

(1)繁殖不受季节限制：以南岭莪术的顶芽或根状茎上的吸芽作为外植体进行组织培养繁殖南岭莪术，不受季节变化的影响，可以随时进行繁殖。

(2)繁殖速度快、品质好：本发明以南岭莪术的顶芽或根状茎上的吸芽作为外植体进行组织培养，可以在3个半月左右出苗。而且苗的生根率为100％，种苗品质好，具有苗壮，稳定性高，抗性强、生长良好等优势。

(3)繁殖系数高：本发明的繁殖系数高，尤其是使用含噻苯隆的培养基进行继代增殖培养，经一个继代增殖培养周期1个芽可增殖形成15～20个芽，可见其繁殖系数高，繁殖倍数为15～20，是直接采用地下茎繁殖的繁殖系数5倍左右，因此可实现扩大生产规模。

(4)经济效益高：本发明操作简单，且成本低，能够得到高品质的苗，且苗的成活率高，并且可以在任何时候采用本发明对南岭莪术进行繁殖，适合大规模的产业化应用，满足花卉周年生产的需要，为观赏花市场提供了一种新的观赏花品种，充分发挥南岭莪术在观赏方面的价值，为企业提高了市场竞争力，获得较高的经济效益。

具体实施方式

下述实施例只是用于对本发明的内容进行阐述，而不是限制，因此在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

实施例1

南岭莪术的组织培养快速繁殖方法：

(1)培养新芽：取南岭莪术带有吸芽的根状茎，去除根和叶，用自来水冲洗干净后，放入0.1％的多菌灵溶液中浸泡10分钟，取出用湿润的沙包埋，在28±2℃下黑暗培养15天，根状茎上的吸芽形成7cm的新芽，切去新芽上的叶片，保留长0.5cm的芽体作为外植体，用75％酒精浸泡20-30秒，再用0.1％升汞溶液消毒15分钟，无菌水冲洗6-8遍。

(2)不定芽诱导培养：把步骤(1)消毒的芽接种到含有0.3毫克/升噻苯隆和0.01毫克/升萘乙酸的MS培养基的培养瓶中，培养条件为：温度28±2℃，光照强度2000Lx，光照周期12小时/天，经30天培养诱导出芽高5cm的不定芽。

(3)继代增殖培养：将步骤(2)中的不定芽转接入新的含有0.3毫克/升噻苯隆和0.01毫克/升萘乙酸的MS培养基中进行继代增殖培养得到丛生芽，以30天为一个继代增殖周期，由一个芽增殖形成15个丛生芽，而且丛生芽高5cm。将得到的丛生芽分切成小团继续进行继代增殖培养，获得大量的芽。培养条件为：温度28±2℃，光照强度2000Lx，光照周期12小时/天。

(4)生根培养：将步骤(3)中丛生芽分切单个芽后，出瓶转接到常规MS培养基上进行壮苗和生根培养，该MS培养基含蔗糖30克/升，pH5.8，琼脂0.6％。经过1个月的培养，南岭莪术的芽长出的叶生长到6厘米以上，同时有大量白色的不定根发生，生根率可达100％，根长达2厘米以上。

(5)试管苗移栽：将步骤(4)叶长达6厘米以上的试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由沙、椰糠、珍珠岩按1∶1∶1的比例混合成的培养基质中炼苗培育成健壮的幼苗后，移栽后约30天后可上盆栽培。移栽培养期间注意浇水、遮荫、保温，南岭莪术性喜温暖、湿润和日照充足的环境。保持土壤湿润，特别是刚种植时要浇透水；夏季以遮荫度30％为宜，其它季节可全日照；生长适温为22～32℃，夜温20～22℃，成活率可达100％。

实施例2

与实施例1不同的是：

步骤(1)培养新芽：南岭莪术的吸芽用自来水冲洗干净后，放入0.1％的多菌灵溶液中浸泡10分钟，取出用湿润的沙包埋，在27±2℃下黑暗培养10天，根状茎上的吸芽形成5cm的新芽，切去新芽上的叶片，保留长1cm的芽体作为外植体，用75％酒精浸泡20秒，再用0.1％升汞溶液消毒10分钟，无菌水冲洗6-8遍。

步骤(2)不定芽诱导培养：把步骤(1)消毒的芽接种到含有0.6毫克/升噻苯隆和0.01毫克/升萘乙酸的MS培养基的培养瓶中，培养条件为：温度27±2℃，光照强度1500Lx，光照周期14小时/天，经30天左右的培养诱导出芽高4cm的不定芽。

步骤(3)继代增殖培养：将步骤(2)中的不定芽转接入新的含有0.6毫克/升噻苯隆和0.01毫克/升萘乙酸的MS培养基中进行继代增殖培养得到丛生芽，以30天为一个继代增殖周期，由一个芽增殖形成20个丛生芽，而且丛生芽高4cm。将得到的丛生芽分切成小团继续进行继代增殖培养，获得大量的芽。培养条件为：温度27±2℃，光照强度1500Lx，光照周期14小时/天。

步骤(5)试管苗移栽中试管苗移栽至沙、椰糠、珍珠岩按1∶3∶2的比例混合成的培养基质中炼苗培育成健壮的幼苗后，移栽后30天后可上盆栽培。

实施例3

与实施例1不同的是：

步骤(1)培养新芽：取南岭莪术的顶芽用自来水冲洗干净后，放入0.1％的多菌灵溶液中浸泡10分钟，取出用湿润的沙包埋，在28±2℃下黑暗培养10天，顶芽形成6cm的新芽，切去新芽上的叶片，保留长1cm的芽体作为外植体，用75％酒精浸泡25秒，再用0.1％升汞溶液消毒12分钟，无菌水冲洗6-8遍。

步骤(2)不定芽诱导培养：把步骤(1)消毒的芽接种到含有噻苯隆0.8毫克/升和0.05毫克/升萘乙酸的MS培养基的培养瓶中，培养条件为：温度26±2℃，光照强度1800Lx，光照周期13小时/天，经30天左右的培养诱导出芽高3cm的不定芽。

步骤(3)继代增殖培养：将步骤(2)中的不定芽转接入新的含有噻苯隆0.8毫克/升和0.05毫克/升萘乙酸的MS培养基中进行继代增殖培养得到丛生芽，以30天为一个继代增殖周期，由一个芽增殖形成18个丛生芽，而且丛生芽高3cm。将得到的丛生芽分切成小团继续进行继代增殖培养，获得大量的芽。培养条件为：温度26±2℃，光照强度1800Lx，光照周期13小时/天。

步骤(5)试管苗移栽中试管苗移栽至沙、椰糠、珍珠岩按1∶2∶1的比例混合成的培养基质中炼苗培育成健壮的幼苗。

实施例4

与实施例3不同的是：

步骤(2)不定芽诱导培养：把步骤(1)消毒的芽接种到含有噻苯隆0.5毫克/升和0.04毫克/升萘乙酸的MS培养基的培养瓶中，培养条件为：温度25℃，光照强度1800Lx，光照周期12小时/天，经30天左右的培养诱导出芽高4.5cm的不定芽。

步骤(3)继代增殖培养：将步骤(2)中的不定芽转接入新的含有噻苯隆0.5毫克/升和0.04毫克/升萘乙酸的MS培养基中进行继代增殖培养，以30天为一个继代增殖周期，由一个芽增殖形成19个丛生芽，而且丛生芽高4.5cm。将得到的丛生芽分切成小团继续进行继代增殖培养，获得大量的芽。培养条件为：温度25℃，光照强度1800Lx，光照周期12小时/天。

步骤(5)试管苗移栽中试管苗移栽至沙、椰糠、珍珠岩按1∶2∶1的比例混合成的培养基质中炼苗培育成健壮的幼苗。

实施例5

与实施例4不同的是：

步骤(2)不定芽诱导培养：把步骤(1)消毒的芽接种到含有噻苯隆0.4毫克/升和0.03毫克/升萘乙酸的MS培养基的培养瓶中，培养条件为：温度25℃，光照强度1700Lx，光照周期14小时/天，经30天左右的培养诱导出芽高5cm的不定芽。

步骤(3)继代增殖培养：将步骤(2)中的不定芽转接入新的含有噻苯隆0.4毫克/升和0.03毫克/升萘乙酸的MS培养基中进行继代增殖培养得到丛生芽，以30天为一个继代增殖周期，由一个芽增殖形成20个丛生芽，而且丛生芽高5cm。将得到的丛生芽分切成小团继续进行继代增殖培养，获得大量的芽。培养条件为：温度25℃，光照强度1700Lx，光照周期14小时/天。

步骤(5)试管苗移栽中试管苗移栽至沙、椰糠、珍珠岩按1∶3∶1的比例混合成的培养基质中炼苗培育成健壮的幼苗。

实施例6

与实施例4不同的是：所述步骤(2)中使用的培养基为含6-BA 5毫克/升和0.2毫克/升萘乙酸的MS培养基。不定芽诱导和继代增殖培养的培养条件为：温度25℃，光照强度1700Lx，光照周期14小时/天。经30天的一个继代增殖周期，由一个芽增殖形成6个丛生芽。

步骤(4)中试管苗移栽至沙、椰糠、珍珠岩按1∶3∶1的比例混合成的培养基质中炼苗培育成健壮的幼苗。

实施例7

南岭莪术的组织培养快速繁殖方法：

(1)吸芽消毒处理：取南岭莪术根状茎上的吸芽用75％酒精浸泡20-30秒，再用0.1％升汞溶液消毒13分钟，无菌水冲洗6-8遍。

(2)不定芽诱导培养：把步骤(1)消毒的叶芽接种到含有0.5毫克/升噻苯隆和0.01毫克/升萘乙酸的MS培养基的培养瓶中，培养30天即可诱导出芽高5cm不定芽，培养条件为：温度28±2℃，光照强度2000Lx，光照周期12小时/天。

(3)继代增殖培养：将步骤(2)中的不定芽转接入新的含有0.5毫克/升噻苯隆和0.01毫克/升萘乙酸的MS培养基中进行继代增殖培养得到丛生芽，以40天为一个继代增殖周期，由一个芽增殖形成16个丛生芽，芽高5cm。将得到的丛生芽分切成小团继续进行继代增殖培养，获得大量的芽。培养条件为：温度28±2℃，光照强度2000Lx，光照周期12小时/天。

(4)生根培养：等到由步骤(3)中的丛生芽分切出瓶转接到装有常规MS培养基的瓶中进行壮苗和生根培养，该MS培养基含蔗糖30克/升，pH5.8，琼脂0.6％。经过1个月的培养，南岭莪术的芽长出的叶生长到6厘米以上，同时有大量白色的不定根发生，生根率可达100％，根长达2厘米以上。

(5)试管苗移栽：将步骤(4)叶长达6厘米以上的试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由沙、椰糠、珍珠岩按1∶1∶1的比例混合成的培养基质中炼苗培育成健壮的幼苗，移栽后约30天后可上盆栽培。移栽培养期间注意浇水、遮荫、保温，南岭莪术性喜温暖、湿润和日照充足的环境。保持土壤湿润，特别是刚种植时要浇透水；夏季以遮荫度30％为宜，其它季节可全日照；生长适温为22～32℃，夜温20～22℃。成活率可达100％。

Claims (6)

1.一种南岭莪术的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)不定芽诱导培养：取南岭莪术的顶芽或具有吸芽的根状茎为外植体，放入0.1％的多菌灵溶液中浸泡杀菌8～12分钟，然后在28～30℃温度下黑暗培养10～15天，至顶芽或根状茎上的吸芽萌发形成5～7cm的新芽，切下新芽去除叶片后的芽体作为外植体先进行消毒处理，然后再接种至诱导培养基中进行培养至不定芽形成；

(2)继代增殖培养：将步骤(1)中形成的不定芽转接入新的含有0.3-0.8毫克/升噻苯隆和0.01-0.05毫克/升萘乙酸的诱导培养基中进行继代增殖培养，得到继代增殖的丛生芽；

(3)生根培养：将步骤(2)所得的丛生芽分离并接种至培养基中进行壮苗和生根培养，得到具有不定根的试管苗；

(4)试管苗移栽：将步骤(3)中的试管苗移栽至培养基质中炼苗培育后，用于移栽上盆。

2.根据权利要求1所述的南岭莪术的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，在所述步骤(2)中将不定芽培养至3～5cm时，转接入新的诱导培养基中进行继代增殖培养。

3.根据权利要求1或2所述的南岭莪术的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，在所述步骤(3)中将丛生芽培养至3～5cm时，转接至培养基中进行壮苗和生根培养。

4.根据权利要求3所述的南岭莪术的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述步骤(2)的继代增殖培养周期至少需要30天。

5.根据权利要求4所述的南岭莪术的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述步骤(4)中试管苗在培养基质中的炼苗培育时间为至少一个月，在培育期间注意浇水、遮阴、保温，使试管苗培育炼苗成健壮的幼苗。

6.根据权利要求5所述的南岭莪术的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述的培养基质是沙、椰糠和珍珠岩中的一种或两种或三种的混合。