CN102119664B

CN102119664B - 采用植物组织培养葡萄风信子的方法

Info

Publication number: CN102119664B
Application number: CN2011100241339A
Authority: CN
Inventors: 刘浩
Original assignee: JIANGSU JIUJIU ENVIRONMENT TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: JIANGSU JIUJIU ENVIRONMENT TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2011-01-21
Filing date: 2011-01-21
Publication date: 2012-02-08
Anticipated expiration: 2031-01-21
Also published as: CN102119664A

Abstract

本发明涉及一种采用植物组织培养葡萄风信子的方法，包括以下步骤：(1)制备培养基：培养基A：MS+2，4-D+6-BA、培养基B：MS+NAA+6-BA、培养基C：MS+IBA+6-BA、培养基D：MS+IAA、培养基E：MS+IBA；(2)外植体消毒；(3)外植体接种在培养基A上进行诱导培养得到愈伤组织；(4)增殖培养：将愈伤组织转接到培养基B上培养；(5)不定芽分化：将经增殖培养的愈伤组织转接到培养基C上，得到分化的不定芽；(6)生根培养：将不定芽转入培养基D上培养，得到组培苗；(7)继代培养：将生根的组培苗转接到培养基E上；(8)炼苗，将组培苗移栽至营养杯中，再转栽到大棚中。本发明解决了葡萄风信子繁殖率低并带有病菌，使品种严重退化、鳞茎萎缩，不利于其品质延续和开发的问题。

Description

采用植物组织培养葡萄风信子的方法

技术领域

本发明涉及一种葡萄风信子的培养方法，尤其是一种采用植物组织培养葡萄风信子的方法，属于植物组织培养技术领域。

背景技术

葡萄风信子(Muscari botryoides Mill)是百合科蓝壶花属，又名蓝壶花、葡萄百合、葡萄水仙。葡萄风信子为多年生草本球根花卉，植株矮小，叶线状披针形，丛生，长10～30cm，宽0.5～1.5cm，穗状花序，1～3枝自叶丛中抽出，直立圆筒状，花茎高10～30cm，着花20～40朵。花色有蓝色、蓝紫色、白色、淡蓝、淡粉色和黄色，秀丽高雅。花期早，自然花期3月中旬到4月上旬，开放时间长，群体开花时间可达20～30天。在园林中，常用来布置多年生混合花境、花坛镶边或点缀山石，是良好的林下地被花卉，亦可作盆栽观赏，别具情趣，是具有较高观赏价值的纯化花卉，适于盆栽观赏与切花。

葡萄风信子的传统繁殖方法以分植鳞茎为主，繁殖率低并带有病菌，使品种严重退化，鳞茎萎缩，不利于其品质的延续和开发。利用组织培养技术在短时间内既能大规模的扩大植株的繁殖量，使其亲本的优良性状得以保存，并且不受自然环境条件的限制。组织培养技术已经在水仙、百合、风信子等球茎植物上得到很好的应用，故研究植物组织培养生产葡萄风信子是很有现实意义的。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种采用植物组织培养葡萄风信子的方法，解决了葡萄风信子繁殖率低并带有病菌，使品种严重退化、鳞茎萎缩，不利于其品质延续和开发的问题。

按照本发明提供的技术方案，所述采用植物组织培养葡萄风信子的方法，特征是，包括以下步骤：

(1)制备培养基：选择MS培养基作为基本培养基，2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、3-吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)和3-吲哚丁酸(IBA)作为调控的生长激素分别制备五种培养基：

培养基A：MS+2，4-D 0.5～1.0mg/L+6-BA 1.0～2.0mg/L，

培养基B：MS+NAA 0.5～1.0mg/L+6-BA 1.0～2.0mg/L，

培养基C：MS+IBA 0.5～1.0mg/L+6-BA 1.0～2.0mg/L，

培养基D：MS+IAA 0.2～1.0mg/L，

培养基E：MS+IBA 0.5～1.0mg/L；

培养基A、B、C和D中均附加25～30g/L的蔗糖和4～5g/L的琼脂，培养基E中附加25～30g/L的蔗糖和1～2g/L的琼脂，用1～2mol/L的NaOH溶液和HCL溶液调pH至5.8～6.0，并将培养基A、B、C、D和E在高压蒸汽灭菌锅中在121～125℃下灭菌15～20min，高压蒸汽灭菌锅中的压力为0.1～0.15MPa；

(2)外植体消毒：选用葡萄风信子鳞茎作为外植体，用自来水冲洗1～2h后，在无菌操作台上用浓度为1％～2％的84消毒液消毒0.5～2min，用无菌水冲洗2～3次，再用浓度为0.1％～0.2％的升汞消毒8～12min，最后用无菌水冲洗4～5次，备用；

(3)外植体诱导培养：将消毒后的外植体切成1～1.5cm²的片状外植体后，接种在培养基A上，接种瓶内每瓶平放3～5片的片状外植体，在培养室内进行诱导培养；20～30天后，在片状外植体的切口处产生淡黄色愈伤组织；

(4)增殖培养：将诱导培养出的愈伤组织转接到培养基B上培养30～40d，使愈伤组织稳定的繁殖下去，保持进一步分化的能力；

(5)不定芽分化：将经增殖培养的愈伤组织转接到培养基C上，30～40d后可得到分化的不定芽；

(6)生根培养：将不定芽转入培养基D上继续培养，培养30～40d得到株高为2～3cm的组培苗；

(7)继代培养：将生根的组培苗转接到培养基E上，培养7～10d后，组培苗的根须达到4～5cm；

(8)移栽：把接种瓶瓶口打开在培养室内散射光下炼苗5～7d，光照周期为24h·d^-1或16h·d^-1，光照强度为2000～2400Lux，培养室温度为25±2℃；取出接种瓶内的组培苗，用自来水洗净，再用蒸馏水稀释成500～600倍的多菌灵浸泡组培苗的根部20～30min，移栽至以蛭石、珍珠岩和营养土为混合基质的营养杯中；将营养杯放到人工气候箱中，光周期为16h·d^-1，光照强度为2000～2400Lux，白天23～25℃，晚上18～20℃，保持湿度在40％～60％；移栽后用1/12～1/10MS培养基母液浇灌，罩上塑料杯保湿，10～15d后去掉塑料杯，隔两周浇一次1/12～1/10MS培养基母液，30～40d后转栽到大棚中，成活率达95％～97％。

其中的d为天，

步骤(3)到步骤(7)中，培养条件为：光周期为24h·d^-1或16h·d^-1，光照强度为2000～2400Lux，培养温度为25±2℃。

步骤(8)中，所述混合基质中蛭石∶珍珠岩∶营养土的质量比为1.5～2∶1.5～2∶1～1.5，所述混合基质在压力0.1～0.15MPa、温度121～125℃的条件下灭菌15～20min。

所述的1/12～1/10MS培养基母液的成分与MS培养基相同，将MS培养基母液稀释10～12倍。

本发明利用植物细胞全能性以及细胞极性和再生特性，将其从植物中分离出来并给予一定的培养条件，是这些已分化的细胞脱分化，然后再在一定的条件下再分化，最后形成完整的植株。因此组织培养就是细胞脱分化和再分化的过程。利用组织培养技术进行葡萄风信子的无性快速繁殖具有许多优点，首先取材较少，培养经济，使用很少的外植体就能培养出大量的愈伤组织；其次可人为控制培养条件，不受自然条件的影响，跳出了植物生长环境、地域以及季节时间的限制；生长周期短，繁殖率高，能在较短的时间繁殖出大量的组培苗，缩短了葡萄风信子的生长周期；保证了葡萄风信子的品质，葡萄风信子的传统繁殖方法以分植鳞茎为主，繁殖率低并带有病菌，使品种严重退化，鳞茎萎缩，而组织培养主要采用无性繁殖，避免了品种中的病毒通过有性遗传给下一代；管理方便，便于自动化控制。本发明利用组织培养技术在短时间内既能大规模的扩大植株的繁殖量，并且使其亲本的优良性状得以保存。组织培养技术已经在水仙、百合、风信子等球茎植物上得到很好的应用，固研究植物组织培养生产葡萄风信子是很有现实意义的。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例一：一种采用植物组织培养葡萄风信子的方法，包括以下步骤：

(1)制备培养基：选择MS培养基作为基本培养基，2，4-D、IAA、NAA、6-BA和IBA作为调控的生长激素分别制备五种培养基：培养基A：MS+2，4-D0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L、培养基B：MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L、培养基C：MS+IBA0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L、培养基D：MS+IAA0.2mg/L、培养基E：MS+IBA0.5mg/L；培养基A、B、C和D中均附加25g/L的蔗糖和5g/L的琼脂，培养基E中附加25g/L的蔗糖和2g/L的琼脂，用1mol/L的NaOH溶液和HCL溶液调pH至5.8，并将培养基A、B、C、D和E在高压蒸汽灭菌锅中在121℃下灭菌15min，高压蒸汽灭菌锅中的压力为0.1MPa；

(2)外植体消毒：选用葡萄风信子鳞茎作为外植体，用自来水冲洗1h后，在无菌操作台上用浓度为1％的84消毒液消毒0.5min，用无菌水冲洗2次，再用浓度为0.1％的升汞消毒8min，最后用无菌水冲洗4次，备用；

(3)外植体诱导培养：将消毒后的外植体切成1cm2的片状外植体后，接种在培养基A上，接种瓶内每瓶平放3片的片状外植体，在培养室内进行诱导培养，培养条件为：光周期为24h·d^-1，光照强度为2000Lux，培养温度为25±2℃；20天后，在片状外植体的切口处产生淡黄色愈伤组织；

(4)增殖培养：将诱导培养出的愈伤组织转接到培养基B上培养30d，使愈伤组织稳定的繁殖下去，保持进一步分化的能力；培养条件为：光周期为24h·d^-1，光照强度为2000Lux，培养温度为25±2℃；

(5)不定芽分化：将经增殖培养的愈伤组织转接到培养基C上，30d后可得到分化的不定芽；培养条件为：光周期为24h·d^-1，光照强度为2000Lux，培养温度为25±2℃；

(6)生根培养：将不定芽转入培养基D上继续培养，培养30d得到株高为2cm的组培苗；培养条件为：光周期为24h·d^-1，光照强度为2000Lux，培养温度为25±2℃；

(7)继代培养：将生根的组培苗转接到培养基E上，培养7d后，组培苗的根须达到4cm；培养条件为：光周期为24h·d^-1，光照强度为2000Lux，培养温度为25±2℃；

(8)移栽：把接种瓶瓶口打开在培养室内散射光下炼苗5d，光照周期为24h·d^-1，光照强度为2000Lux，培养室温度为25±2℃；取出接种瓶内的组培苗，用自来水洗净，再用水稀释成500倍的多菌灵浸泡组培苗的根部20min，移栽至以蛭石、珍珠岩和营养土为混合基质的营养杯中；将营养杯放到人工气候箱中，光周期为16h·d^-1，光照强度为2000Lux，白天23℃，晚上18℃，保持湿度在40％；移栽后用1/12MS培养基母液浇灌，罩上塑料杯保湿，10d后去掉塑料杯，隔两周浇一次1/12MS培养基母液，30d后转栽到大棚中，成活率达95％；所述混合基质中蛭石∶珍珠岩∶营养土的质量比为1.5∶1.5∶1，所述混合基质在压力0.1MPa、121℃的温度下灭菌15min

实施例二：一种采用植物组织培养葡萄风信子的方法，包括以下步骤：

(1)制备培养基：选择MS培养基作为基本培养基，2，4-D、IAA、NAA、6-BA和IBA作为调控的生长激素分别制备五种培养基：培养基A：MS+2，4-D1.0mg/L+6-BA 2.0mg/L、培养基B：MS+NAA 1.0mg/L+6-BA 2.0mg/L、培养基C：MS+IBA 1.0mg/L+6-BA2.0mg/L、培养基D：MS+IAA 1.0mg/L、培养基E：MS+IBA1.0mg/L；培养基A、B、C和D中均附加30g/L的蔗糖和5g/L的琼脂，培养基E中附加30g/L的蔗糖和2g/L的琼脂，用2mol/L的NaOH溶液和HCL溶液调pH至6.0，并将培养基A、B、C、D和E在高压蒸汽灭菌锅中在125℃下灭菌20min，高压蒸汽灭菌锅中的压力为0.15MPa；

(2)外植体消毒：选用葡萄风信子鳞茎作为外植体，用自来水冲洗2h后，在无菌操作台上用浓度为2％的84消毒液消毒2min，用无菌水冲洗3次，再用浓度为0.2％的升汞消毒12min，最后用无菌水冲洗5次，备用；

(3)外植体诱导培养：将消毒后的外植体切成1.5cm2的片状外植体后，接种在培养基A上，接种瓶内每瓶平放5片的片状外植体，在培养室内进行诱导培养，培养条件为：光周期为16h·d^-1，光照强度为2400Lux，培养温度为25±2℃；30天后，在片状外植体的切口处产生淡黄色愈伤组织；

(4)增殖培养：将诱导培养出的愈伤组织转接到培养基B上培养40d，使愈伤组织稳定的繁殖下去，保持进一步分化的能力；培养条件为：光周期为16h·d^-1，光照强度为2400Lux，培养温度为25±2℃；

(5)不定芽分化：将经增殖培养的愈伤组织转接到培养基C上，40d后可得到分化的不定芽；培养条件为：光周期为16h·d^-1，光照强度为2400Lux，培养温度为25±2℃；

(6)生根培养：将不定芽转入培养基D上继续培养，培养40d得到株高为3cm的组培苗；培养条件为：光周期为16h·d^-1，光照强度为2400Lux，培养温度为25±2℃；

(7)继代培养：将生根的组培苗转接到培养基E上，培养10d后，组培苗的根须达到5cm；培养条件为：光周期为16h·d^-1，光照强度为2400Lux，培养温度为25±2℃；

(8)移栽：把接种瓶瓶口打开在培养室内散射光下炼苗7d，光照周期为16h·d^-1，光照强度为2400Lux，培养室温度为25±2℃；取出接种瓶内的组培苗，用自来水洗净，再用水稀释成600倍的多菌灵浸泡组培苗的根部30min，移栽至以蛭石、珍珠岩和营养土为混合基质的营养杯中；将营养杯放到人工气候箱中，光周期为16h·d^-1，光照强度为2400Lux，白天25℃，晚上20℃，保持湿度在60％；移栽后用1/10MS培养基母液浇灌，罩上塑料杯保湿，15d后去掉塑料杯，隔两周浇一次1/10MS培养基母液，40d后转栽到大棚中，成活率达97％；所述混合基质中蛭石∶珍珠岩∶营养土的质量比为2∶2∶1.5，所述混合基质在压力0.15MPa、125℃的温度下灭菌20min。

实施例三：一种采用植物组织培养葡萄风信子的方法，包括以下步骤：

(1)制备培养基：选择MS培养基作为基本培养基，2，4-D、IAA、NAA、6-BA和IBA作为调控的生长激素分别制备五种培养基：培养基A：MS+2，4-D0.6mg/L+6-BA 1.2mg/L、培养基B：MS+NAA 0.6mg/L+6-BA 1.2mg/L、培养基C：MS+IBA0.6mg/L+6-BA 1.2mg/L、培养基D：MS+IAA0.4mg/L、培养基E：MS+IBA0.6mg/L；培养基A、B、C和D中均附加26g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，培养基E中附加26g/L的蔗糖和1.5g/L的琼脂，用1.5mol/L的NaOH溶液和HCL溶液调pH至5.9，并将培养基A、B、C、D和E在高压蒸汽灭菌锅中在122℃下灭菌16min，高压蒸汽灭菌锅中的压力为0.12MPa；

(2)外植体消毒：选用葡萄风信子鳞茎作为外植体，用自来水冲洗1.2h后，在无菌操作台上用浓度为1.5％的84消毒液消毒1min，用无菌水冲洗2次，再用浓度为0.15％的升汞消毒10min，最后用无菌水冲洗4次，备用；

(3)外植体诱导培养：将消毒后的外植体切成1.2cm2的片状外植体后，接种在培养基A上，接种瓶内每瓶平放4片的片状外植体，在培养室内进行诱导培养，培养条件为：光周期为24h·d^-1，光照强度为2200Lux，培养温度为25±2℃；25天后，在片状外植体的切口处产生淡黄色愈伤组织；

(4)增殖培养：将诱导培养出的愈伤组织转接到培养基B上培养35d，使愈伤组织稳定的繁殖下去，保持进一步分化的能力；培养条件为：光周期为24h·d^-1，光照强度为2300Lux，培养温度为25±2℃；

(5)不定芽分化：将经增殖培养的愈伤组织转接到培养基C上，35d后可得到分化的不定芽；培养条件为：光周期为24h·d^-1，光照强度为2300Lux，培养温度为25±2℃；

(6)生根培养：将不定芽转入培养基D上继续培养，培养35d得到株高为2.5cm的组培苗；培养条件为：光周期为24h·d^-1，光照强度为2300Lux，培养温度为25±2℃；

(7)继代培养：将生根的组培苗转接到培养基E上，培养8d后，组培苗的根须达到4.5cm；培养条件为：光周期为24h·d^-1，光照强度为2300Lux，培养温度为25±2℃；

(8)移栽：把接种瓶瓶口打开在培养室内散射光下炼苗6d，光照周期为24h·d^-1，光照强度为2300Lux，培养室温度为25±2℃；取出接种瓶内的组培苗，用自来水洗净，再用水稀释成550倍的多菌灵浸泡组培苗的根部25min，移栽至以蛭石、珍珠岩和营养土为混合基质的营养杯中；将营养杯放到人工气候箱中，光周期为16h·d^-1，光照强度为2300Lux，白天24℃，晚上19℃，保持湿度在50％；移栽后用1/11MS培养基母液浇灌，罩上塑料杯保湿，12d后去掉塑料杯，隔两周浇一次1/11MS培养基母液，35d后转栽到大棚中，成活率达96％；所述混合基质中蛭石∶珍珠岩∶营养土的质量比为1.6∶1.6∶1.2，所述混合基质在压力0.12MPa、122℃的温度下灭菌16min。

实施例四：一种采用植物组织培养葡萄风信子的方法，包括以下步骤：

(1)制备培养基：选择MS培养基作为基本培养基，2，4-D、IAA、NAA、6-BA和IBA作为调控的生长激素分别制备五种培养基：培养基A：MS+2，4-D0.8mg/L+6-BA 1.6mg/L、培养基B：MS+NAA 0.8mg/L+6-BA 1.6mg/L、培养基C：MS+IBA0.8mg/L+6-BA 1.6mg/L、培养基D：MS+IAA0.6mg/L、培养基E：MS+IBA0.8mg/L；培养基A、B、C和D中均附加28g/L的蔗糖和4.6g/L的琼脂，培养基E中附加28g/L的蔗糖和1.6g/L的琼脂，用1.5mol/L的NaOH溶液和HCL溶液调pH至6.0，并将培养基A、B、C、D和E在高压蒸汽灭菌锅中在124℃下灭菌18min，高压蒸汽灭菌锅中的压力为0.14MPa；

(2)外植体消毒：选用葡萄风信子鳞茎作为外植体，用自来水冲洗1.6h后，在无菌操作台上用浓度为1.6％的84消毒液消毒1.2min，用无菌水冲洗3次，再用浓度为0.16％的升汞消毒10min，最后用无菌水冲洗5次，备用；

(3)外植体诱导培养：将消毒后的外植体切成1.2cm2的片状外植体后，接种在培养基A上，接种瓶内每瓶平放4片的片状外植体，在培养室内进行诱导培养，培养条件为：光周期为16h·d^-1，光照强度为2200Lux，培养温度为25±2℃；26天后，在片状外植体的切口处产生淡黄色愈伤组织；

(4)增殖培养：将诱导培养出的愈伤组织转接到培养基B上培养38d，使愈伤组织稳定的繁殖下去，保持进一步分化的能力；培养条件为：光周期为16h·d^-1，光照强度为2200Lux，培养温度为25±2℃；

(5)不定芽分化：将经增殖培养的愈伤组织转接到培养基C上，36d后可得到分化的不定芽；培养条件为：光周期为16h·d^-1，光照强度为2200Lux，培养温度为25±2℃；

(6)生根培养：将不定芽转入培养基D上继续培养，培养36d得到株高为2.4cm的组培苗；培养条件为：光周期为16h·d^-1，光照强度为2200Lux，培养温度为25±2℃；

(7)继代培养：将生根的组培苗转接到培养基E上，培养8d后，组培苗的根须达到4.6cm；培养条件为：光周期为16h·d^-1，光照强度为2200Lux，培养温度为25±2℃；

(8)移栽：把接种瓶瓶口打开在培养室内散射光下炼苗6d，光照周期为16h·d^-1，光照强度为2200Lux，培养室温度为25±2℃；取出接种瓶内的组培苗，用自来水洗净，再用水稀释成560倍的多菌灵浸泡组培苗的根部28min，移栽至以蛭石、珍珠岩和营养土为混合基质的营养杯中；将营养杯放到人工气候箱中，光周期为16h·d^-1，光照强度为2200Lux，白天25℃，晚上20℃，保持湿度在56％；移栽后用1/11MS培养基母液浇灌，罩上塑料杯保湿，14d后去掉塑料杯，隔两周浇一次1/11MS培养基母液，36d后转栽到大棚中，成活率达96％；所述混合基质中蛭石∶珍珠岩∶营养土的质量比为2∶1.5∶1，所述混合基质在压力0.14MPa、124℃的温度下灭菌18min。

对本发明的实施例移栽后的葡萄风信子组培苗进行生物量的测试，为了不影响其生长，只对其叶片的增长进行测量，叶片的增长情况见表1。本发明得到的葡萄风信子组培苗繁殖速度快，培养基质的选择最佳，因此生物量的增长迅速，品质得到完好的保存。

表1

Claims

1.一种采用植物组织培养葡萄风信子的方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)制备培养基：选择MS培养基作为基本培养基，2，4-D、IAA、NAA、6-BA和IBA作为调控的生长激素分别制备五种培养基：

培养基A：MS+2，4-D 0.5～1.0mg/L+6-BA 1.0～2.0mg/L，

培养基B：MS+NAA 0.5～1.0mg/L+6-BA 1.0～2.0mg/L，

培养基C：MS+IBA 0.5～1.0mg/L+6-BA 1.0～2.0mg/L，

培养基D：MS+IAA 0.2～1.0mg/L，

培养基E：MS+IBA 0.5～1.0mg/L；

2.如权利要求1所述的采用植物组织培养葡萄风信子的方法，其特征是，步骤(3)到步骤(7)中，培养条件为：光周期为24h·d^-1或16h·d^-1，光照强度为2000～2400Lux，培养温度为25±2℃。

3.如权利要求1所述的采用植物组织培养葡萄风信子的方法，其特征是，步骤(8)中，所述混合基质中蛭石∶珍珠岩∶营养土的质量比为1.5～2∶1.5～2∶1～1.5，所述混合基质在压力0.1～0.15MPa、温度121～125℃的条件下灭菌15～20min。

4.如权利要求1所述的采用植物组织培养葡萄风信子的方法，其特征是，所述的1/12～1/10MS培养基母液的成分与MS培养基相同，将MS培养基母液稀释10～12倍。