CN105145363B - 一种显著提高杉木组培生产出苗率的方法 - Google Patents
一种显著提高杉木组培生产出苗率的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种显著提高杉木组培生产出苗率的方法。本发明方法，包括以下步骤：(1)将杉木单芽接种到增殖诱导培养基进行增殖诱导，丛生芽萌发后去掉原单芽顶端继代培养获得丛生继代苗；(2)将丛生继代苗转接到壮苗培养基进行驯化培养，获得驯化丛苗；(3)将驯化丛苗剪单芽转接生根诱导培养基进行生根诱导得到生根苗；(4)将生根苗移栽到表层砂质黄壤土。利用该方法，杉木无性系组培苗增殖倍数可达到6‑8倍，单瓶驯化继代苗可出50‑70个生根苗，生根率达到100％，移栽成活率达到98％以上；可以显著提高杉木组培苗生产的出苗率，节约成本、提高生产效益，而且生根苗移栽种植后侧芽分化减少，顶端优势明显。
Description
技术领域
本发明属于植物无性系组织培养领域，具体涉及一种显著提高杉木组培生产出苗率的方法。
背景技术
杉木(Cunninghamia lanceolata)是我国南方最重要的速生丰产树种，具有速生、丰产、材性好、用途广等优良特性，在我国人工林中具有重要的地位，尤其是近年来，速生桉树大规模种植产生的弊端日益突显之后，速生杉木种植量更是与日俱增，大有赶超速生桉树的潜力。由于杉木是异花授粉树种，用种子繁殖，个体分化大，难以保持杉木母本的性状；而采用常规的扦插、压条或者嫁接等无性繁殖方法，繁育速度慢，育苗出圃率低，难以满足日益增长的市场需求。组织培养方法是一种快速无性繁殖技术，选择杉木优良无性系材料，采用组织培养方法，既可以保持母本的优良性状，又可以有效的节约生产成本，还可以提高育苗速度，满足市场需求。目前，虽已有部分杉木组织培养研究，但基本停留在繁殖、生根、或是控制污染等某一方面的研究，育苗周期长、生根率低、成活率差等问题仍未完善，也极少提到组培苗壮苗环节。
在杉木组培生产技术研究转化为生产应用中，影响工厂化生产效益的关键因素是组培瓶苗的出苗率，而出苗率受组培苗的生长增殖倍数、生长周期、生长分化的同步性、生根率、移栽成活率等影响，其中增殖倍数和壮苗培养环节是直接影响出苗率的关键因素。木本植物不同于草本，经过增殖诱导的丛芽，生长分化不齐，需经过特定的壮苗培养，经过壮苗后的瓶苗分化整齐度越高，出苗率越高，生产成本越低。瓶苗的整齐度受壮苗配方和壮苗培养环境的影响，因此壮苗所选择的培养基配方，培养环境既要保障苗木的增殖生长，又要能促进苗木的同步分化，还要根据不同的时间，控制苗木的生长以便避免季节对苗木移栽成活率的影响。
发明内容
本发明针对现有技术中生产上杉木组培增殖倍数低、苗木弱、分化不整齐等导致出苗率低，生根率差、移栽成活率低的问题，提供一种显著提高杉木组培生产出苗率的方法。该方法能在实际生产上能提高杉木组培增殖倍数、并通过壮苗培养提高瓶苗分化生长的整齐度，促进出苗率和生根率，改进现有的增殖、壮苗、生根、移栽等技术，提高杉木组培苗的出瓶率，生根率，移栽生活率，降低生产成本，从而完善杉木组培苗的产业化生产与应用。
本发明的显著提高杉木组培生产出苗率的方法，包括以下步骤：
a.增殖培养：将杉木无菌单芽接种到增殖诱导培养基上进行增殖诱导培养，当单芽基部萌发出2-5芽点时，去掉原单芽顶端后转接到新鲜的增殖诱导培养基上，在相同条件下继续培养，由此形成丛生继代苗；所述的增殖诱导培养基的配方，每升含有：0-3mg的6-BA(6-苄氨基嘌呤)、0-1mg的NAA(萘乙酸)、30g的白砂糖和3-3.5g的琼脂粉，余量为MS培养基，pH值为5.8-5.9；培养条件为：温度25±2℃，湿度20％-40％，光照强度2000-3000Lx，光照时长12小时/天；
b.壮苗培养：将丛生继代苗转接到壮苗培养基上进行壮苗培养，当茎段半木质化时即形成了利于生根的驯化丛苗；所述的壮苗培养基配方，每升含有：0-0.5mg的6-BA，0-0.5mg的NAA、20-30g的白砂糖、3-3.5g的琼脂粉和0-1g的活性炭，余量为1/2MS培养基，pH值为5.8-5.9；培养条件为：温度27±2℃，湿度20％-40％，光照强度3000-5000Lx，光照时长13-16小时/天；
c.生根培养：剪取驯化丛苗转入生根诱导培养基进行生根诱导，由此获得生根苗；所述的生根诱导培养基的配方，每升含有：0-3mg的IBA(吲哚丁酸)、0-2mg的NAA、15g的白砂糖和3-3.5g的琼脂粉，余量为1/2MS，pH值为5.8-5.9；培养的条件为：温度为27±2℃，湿度20％-40％，光照强度2000-3000Lx，光照时长14小时/天；
d.炼苗移栽：将生根苗炼苗，待根系生长至粗壮、发白时，即可移栽。
优选，所述的步骤a的增殖诱导培养基的配方，每升含有：1.0mg的6BA、0.1mg的NAA、30g的白砂糖、3.2g的琼脂粉和余量的MS培养基，pH值为5.85；
所述的步骤b的壮苗培养基的配方，每升含有：30g的白砂糖、3.2g的琼脂粉、0.5g的活性炭和余量的1/2MS培养基，pH值为5.85；
所述的步骤c的生根诱导培养基的配方，每升含有：1.0mg的IBA、0.2mg的NAA、15g的白砂糖、3.2g的琼脂粉和余量的1/2MS培养基，pH值为5.85。
所述的步骤b的壮苗培养基，优选使用650ml的兰花组培瓶分装，100-110ml/瓶，用含有直径0.8-1cm透气膜的螺纹盖封瓶口，在121℃和1.1kg.cm2条件下，高压蒸汽灭菌15min。
所述的步骤d的生根苗炼苗优选是在炼苗棚中炼苗7-15天，待根系生长至0.5～2cm长，粗壮、发白时，将生根苗置于清水中漂洗，洗去根部的培养基后，在800-1000倍的消毒液中浸泡10-30min，然后置于保水保湿保温的环境中，48小时内移栽种植完；移栽基质采用表层砂质黄壤土。
MS培养基为国际通用的培养基，其成份和配置方法见Murashige T,Skoog F(1962)(A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissuecultures.Physiol Plant 15:473–497)。1/2MS培养基是指将MS培养基中大量元素减半，其余成份不变。
本发明的显著提高杉木组培苗生产出苗率的方法，包括杉木丛生芽的增殖诱导、壮苗培养、生根培养、移栽等步骤。选择从优良无性系筛选出来的杉木嫩芽作为试验材料，经70％-75％酒精、0.1％-0.5％升汞的常规灭菌消毒后，得到杉木无菌单芽，将其接到增殖诱导培养基上，经过诱导获得丛生芽后，转移到壮苗培养基培养，经过壮苗培养，可获得大量粗壮、整齐、本木质化、可用于诱导生根的驯化丛状芽，将驯化丛状芽剪单株接在生根诱导培养基上，待根长度约0.2-2cm时移入炼苗棚炼苗7-15天后，移栽到营养杯育苗。
本发明方法是经过生产实践的，能提高杉木组培增殖倍数，通过壮苗环节提高组培出苗的方法，主要是组培增殖配方和壮苗配方以及培养环境在生产实践上的应用，促进继代瓶苗的分化生长的整齐度，从而达到提高瓶苗出苗率和移栽成活率的方法，完善杉木组培苗的生产应用，达到降低生产成本，提高生产效率的目的，使得杉木组培真正应用于生产，服务于林业，为实现杉木组培苗产业化开辟一条新路。
相对于现有的技术，本发明具有的有点和有益效果如下：
1.本发明提供一种显著提高杉木组培苗生产出苗的方法，主要从影响生产出苗的两个重要因素-增殖倍数和壮苗培养出发，利用壮苗培养克服新增殖杉木丛生芽分化生长时长势不均，良莠不齐的问题，且通过壮苗培养减少外源细胞分裂素对生根苗的影响，降低生根诱导中植株内细胞分类素的含量，提高植物生长素的作用进而提高苗木的生根率，同时降低苗木移栽后激素的滞后影响作用，促使移栽苗分支少，顶端优势明显，进一步提高了移栽苗的质量。
2.本发明以杉木优良无性系单芽为材料，经过增殖诱导获得丛生芽，经过简单的去顶端继代方式，显著提高增殖倍数，达到6-8倍，经过壮苗培养，使丛芽的长势整齐，叶子展开、深绿，叶面光亮，丛芽利用率高，单瓶可剪出生根植株50-70株；使用本方法既能缓解增殖芽水肿、玻璃化的导致利用率不高的问题，又能显著提高增殖倍数，可以在短时间内批量工厂化生产遗传稳定性高、健壮、整齐、生根率100％，移栽成活率98％以上的继代丛苗，达到显著提高组培生产出苗的目的。
3.本发明的显著提高杉木组培苗生产出苗的方法，培养基配方成分更少，操作更加简单，成本低，生产效益明显。尤其是提出采用650ml兰花组培瓶作为培养容器，这既能满足容器的采光、透气的需要，又能满足苗木在培养容器内对生长空间的需要，同时在大批量生产的培养基配制、灭菌、接苗以及培养等各个环节中，使用兰花组培瓶相对比其他容器降低3-6倍的生产成本，且增殖倍数不受影响，这显著提高了工厂化的生产效益。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
下列实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生产厂商的使用说明。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。
实施例1
1、芽增殖诱导培养
将长约1.5-2.5cm的杉木无菌单芽接种到增殖诱导培养基上进行增殖诱导，当基部萌发出2-5芽点时转接到新鲜的增殖诱导培养基上，转接时去掉原单芽顶端，以促进新芽的生长，由此形成丛生继代苗。
所述的增殖诱导培养基配方为，每升含有：1.0mg的6BA、0.1mg的NAA、30g的白砂糖、3.2g的琼脂粉，余量为MS培养基，调节其灭菌前的pH值为5.85(配制方法是将上述成份混合均匀后，调pH值，然后灭菌备用，下同)；培养温度25±2℃，湿度20％-40％，光照时间12小时/天，光照强度2500Lx，培养35天。
2、壮苗培养
将丛生继代苗转接到壮苗培养基上进行生根前的复壮，壮苗培养主要以促进丛生继代苗的丛状芽生长为主，当丛状芽长势整齐、植株健壮，叶子展开、叶面深绿，茎段基本半木质化时即形成了利于生根的驯化丛苗。
所述的壮苗培养基配方为，每升含有：30g的白砂糖、3.2g的琼脂粉，0.5g的活性炭和余量的1/2MS培养基，调节其灭菌前的pH值为5.85(配制方法是将上述成份混合均匀后，调pH值，下同)；壮苗培养基用650ml的兰花组培瓶分装，100ml/瓶，用含有直径0.8-1.0cm透气膜的螺纹盖封瓶口，在121℃和1.1kg.cm2条件下，高压蒸汽灭菌15min，接种继代丛芽后在温度27±2℃，湿度在20％-40％，光照时间16小时/天，光照强度3000Lx的培养室内培养30天。
3、生根诱导培养
取驯化丛苗，剪取粗壮、翠绿、活性强、1.5cm高度以上的驯化丛苗转入生根诱导培养基进行生根诱导，由此获得生根苗。
所述的生根诱导培养基的配方为，每升含有：1.0mg的IBA、0.2mg的NAA、15g的白砂糖、3.2g的琼脂粉和余量的1/2MS培养基，pH值为5.85(配制方法是将上述成份混合均匀后，调pH值，然后灭菌备用，下同)；培养室温度27±2℃，湿度在20％-40％，光照时间14小时/天，光照强度2500Lx，培养20天。
4、炼苗、移栽
生根苗于炼苗棚中炼苗10天，待根系0.5-2cm长，粗壮、发白时即可进行移栽。生根苗移栽前，先将生根苗植株置于清水中漂洗，洗去根部的培养基后，在800倍稀释的多菌灵或是甲基托布津的消毒液中浸泡10min，然后置于保水保湿保温的泡沫箱，48小时内移栽种植完。移栽基质采用表层砂质黄壤土。
本实施例的芽增殖诱导培养步骤中，经过简单的去单芽顶端继代方式，显著提高增殖倍数，达到8倍；经过壮苗培养，丛芽的长势整齐，叶子展开、深绿，叶面光亮，丛芽利用率大大提高，单瓶可剪出生根植株50-70株；丛苗生根率达100％，移栽成活率达98％。而且移栽苗分支少，顶端优势明显。通过采用650ml兰花组培瓶作为培养容器，能更好的满足苗木在培养容器内对生长空间的需要，而且在大批量生产的培养基配制、灭菌、接苗以及培养等各个环节中，使用兰花组培瓶相对比其他容器降低6倍的生产成本。
实施例2
1、芽增殖诱导培养
将长约1.5-2.5cm的杉木无菌单芽接种到增殖诱导培养基上进行增殖诱导，当基部萌发出2-5芽点时转接到新鲜的增殖诱导培养基上，转接时去掉原单芽顶端，以促进新芽的生长，由此形成丛生继代苗。
所述的增殖诱导培养基的配方为，每升含有：0.5mg的6BA、0.05mg的NAA、30g的白砂糖、3.2g的琼脂粉和余量的MS培养基，调节其灭菌前的pH值为5.85；培养温度25±2℃，湿度20％-40％，光照时间12小时/天，光照强度2500Lx，培养35天。
2、壮苗培养
将丛生继代苗转接到壮苗培养基上进行生根前的复壮，壮苗培养主要以促进丛生继代苗的丛状芽生长为主，当丛状芽长势整齐、植株健壮，叶子展开、叶面深绿，茎段基本半木质化时即形成了利于生根的驯化丛苗。
所述的壮苗培养基的配方为，每升含有：0.5mg的6BA、20g的白砂糖、3.0g的琼脂粉和余量的1/2MS培养基，调节其灭菌前的pH值为5.8；壮苗培养基用650ml的兰花组培瓶分装，100ml/瓶，用含有直径0.8-1.0cm透气膜的螺纹盖封瓶口，在121℃和1.1kg.cm2条件下，高压蒸汽灭菌15min，接种继代丛芽后在温度27±2℃，湿度20％-40％，光照强度3000Lx，光照时长13小时的培养室内培养25天。
3、生根诱导培养
取驯化丛苗，剪取粗壮、翠绿、活性强、1.5cm高度以上的驯化丛苗转入生根诱导培养基进行生根诱导，由此获得生根苗。
所述的生根诱导培养基的配方为，每升含有：2mg的NAA、15g的白砂糖和3.0g的琼脂粉，余量的1/2MS培养基，pH值为5.8；培养室温度27±2℃，湿度在20％-40％，光照时间14小时/天，光照强度3000Lx，培养20天。
4、炼苗、移栽
生根苗在炼苗棚炼苗15天，待根系0.5-2cm长，粗壮、发白时即可进行移栽。生根瓶苗移栽前，先将生根植株置于清水中漂洗，洗去根部的培养基后，在1000倍稀释的多菌灵消毒液中浸泡30min，然后置于保水保湿保温的泡沫箱，48小时内移栽种植完。移栽基质采用表层砂质黄壤土。
本实施例的芽增殖诱导培养步骤中，增殖倍数达到6倍；壮苗培养后，单瓶可剪出生根植株50-70株；丛苗生根率达100％，移栽成活率达99％。而且移栽苗分支少，顶端优势明显。生产成本降低3倍。
实施例3
1、芽增殖诱导培养
将长约1.5-2.5cm的杉木无菌单芽接种到增殖诱导培养基上进行增殖诱导，当基部萌发出2-5芽点时转接到新鲜的增殖诱导培养基上，转接时去掉原单芽顶端，以促进新芽的生长，由此形成丛生继代苗。
所述的增殖诱导培养基的配方，每升含有：3.0mg的6BA、30g的白砂糖、3.5g的琼脂粉和余量的MS培养基，调节其灭菌前的pH值为5.8；培养温度25±2℃，湿度20％-40％，光照时间12小时/天，光照强度3000Lx，培养35天。
2、壮苗培养
将丛生继代苗转接到壮苗培养基上进行生根前的复壮，壮苗培养主要以促进丛生继代苗的丛状芽生长为主，当丛状芽长势整齐、植株健壮，叶子展开、叶面深绿，茎段基本半木质化时即形成了利于生根的驯化丛苗。
所述的壮苗培养基的配方，每升含有：20g的白砂糖、3.2g的琼脂粉，0.2g的活性炭，和余量的1/2MS培养基，调节其灭菌前的pH值为5.85；壮苗培养基用650ml的兰花组培瓶分装，100ml/瓶，用含有直径0.8-1.0cm透气膜的螺纹盖封瓶口，在121℃和1.1kg.cm2条件下，高压蒸汽灭菌15min，接种继代丛芽后在温度27±2℃，湿度20％-40％，自然光照强度5000Lx，光照时长14小时/天的培养室内培养25天。
3、生根诱导培养
取驯化丛苗，剪取粗壮、翠绿、活性强、1.5cm高度以上的驯化丛苗转入生根诱导培养基进行生根诱导，由此获得生根苗。
所述的生根诱导培养基的配方为，每升含有：3.0mg的IBA、15g的白砂糖和3.5g的琼脂粉，余量的1/2MS培养基，pH值为5.9；培养室温度27±2℃，湿度在20％-40％，光照时间14小时/天，光照强度2000Lx，培养25天。
4、炼苗、移栽
生根苗在炼苗棚中炼苗7天，待根系0.5-2cm长，粗壮、发白时即可进行移栽。生根苗移栽前，先将生根苗置于清水中漂洗，洗去根部的培养基后，在900倍稀释的甲基托布津消毒液中浸泡20min，然后置于保水保湿保温的泡沫箱，48小时内移栽种植完。移栽基质采用表层砂质黄壤土。
本实施例的芽增殖诱导培养步骤中，增殖倍数达到8倍；壮苗培养后，单瓶可剪出生根植株50～70株；丛苗生根率达100％，移栽成活率达98％。而且移栽苗分支少，顶端优势明显。生产成本降低4倍。
实施例4
1、芽增殖诱导培养
将长约1.5-2.5cm的杉木无菌单芽接种到增殖诱导培养基上进行增殖诱导，当基部萌发出2-5芽点时转接到新鲜的增殖诱导培养基上，转接时去掉原单芽顶端，以促进新芽的生长，由此形成丛生继代苗。
所述的增殖诱导培养基的配方为，每升含有：1mg的NAA、30g的白砂糖、3.0g的琼脂粉，余量的MS培养基，调节其灭菌前的pH值为5.9；培养温度25±2℃，湿度20％-40％以下，光照时间12小时/天，光照强度2000Lx，培养40天。
2、壮苗培养
将丛生继代苗转接到壮苗培养基上进行生根前的复壮，壮苗培养主要以促进丛生继代苗的丛状芽生长为主，当丛状芽长势整齐、植株健壮，叶子展开、叶面深绿，茎段基本半木质化时即形成了利于生根的驯化丛苗。
所述的壮苗培养基的配方为，每升含有：0.5mg的NAA、20g的白砂糖、3.5g的琼脂粉，1g的活性炭和余量的1/2MS培养基，调节其灭菌前的pH值为5.9；壮苗培养基用650ml的兰花组培瓶分装，100ml/瓶，用含有直径0.8-1.0cm透气膜的螺纹盖封瓶口，在121℃和1.1kg.cm2条件下，高压蒸汽灭菌15min，接种继代丛芽后在温度27±2℃，湿度20％-40％，光照强度2000Lx，光照时长16小时的培养室内培养30天。
3、生根诱导培养
取驯化丛苗，剪取粗壮、翠绿、活性强、1.5cm高度以上的驯化丛苗转入生根诱导培养基进行生根诱导，由此获得生根苗。
所述的生根诱导培养基的配方为，每升含有：3.0mg的IBA、15g的白砂糖和3.5g的琼脂粉，余量的1/2MS培养基，pH值为5.9；培养室温度27±2℃，湿度在20％-40％，光照时间14小时/天，光照强度2000Lx，培养25天。
4、炼苗、移栽
生根苗于炼苗瓶中炼苗15天，待根系0.2-2cm长，粗壮、发白时即可进行移栽。生根苗移栽前，先将生根苗置于清水中漂洗，洗去根部的培养基后，在800倍稀释的多菌灵消毒液中浸泡10min，然后置于保水保湿保温的泡沫箱，48小时内移栽种植完。移栽基质采用表层砂质黄壤土。
本实施例的芽增殖诱导培养步骤中，增殖倍数达到6倍；壮苗培养后，单瓶可剪出生根植株50-70株；丛苗生根率达100％，移栽成活率达99％。而且移栽苗分支少，顶端优势明显。生产成本降低4倍。
Claims (3)
1.一种显著提高杉木组培生产出苗率的方法，包括以下步骤：
a.增殖培养：将杉木无菌单芽接种到增殖诱导培养基上进行增殖诱导培养，当单芽基部萌发出2-5芽点时，去掉原单芽顶端后转接到新鲜的增殖诱导培养基上，在相同条件下继续培养，由此形成丛生继代苗；所述的增殖诱导培养基的配方，每升含有：1.0mg的6BA、0.1mg的NAA、30g的白砂糖、3.2g的琼脂粉和余量的MS培养基，pH值为5.85；培养条件为：温度25±2℃，湿度20％-40％，光照强度2000-3000Lx，光照时长12小时/天；
b.壮苗培养：将丛生继代苗转接到壮苗培养基上进行壮苗培养，当茎段半木质化时即形成了利于生根的驯化丛苗；所述的壮苗培养基配方，每升含有：30g的白砂糖、3.2g的琼脂粉、0.5g的活性炭和余量的1/2MS培养基，pH值为5.85；培养条件为：温度27±2℃，湿度20％-40％，光照强度3000-5000Lx，光照时长13-16小时/天；
c.生根培养：剪取驯化丛苗转入生根诱导培养基进行生根诱导，由此获得生根苗；所述的生根诱导培养基的配方，每升含有：1.0mg的IBA、0.2mg的NAA、15g的白砂糖、3.2g的琼脂粉和余量的1/2MS培养基，pH值为5.85；培养的条件为：温度为27±2℃，湿度20％-40％，光照强度2000-3000Lx，光照时长14小时/天；
d.炼苗移栽：将生根苗炼苗，待根系生长至粗壮、发白时，即可移栽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤b的壮苗培养基是使用650ml的兰花组培瓶分装，100-110ml/瓶，用含有直径0.8-1cm透气膜的螺纹盖封瓶口，在121℃和1.1kg.cm2条件下，高压蒸汽灭菌15min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤d的生根苗炼苗是在炼苗棚中炼苗7-15天，待根系生长至0.5～2cm长，粗壮、发白时，将生根苗置于清水中漂洗，洗去根部的培养基后，在800-1000倍的消毒液中浸泡10-30min，然后置于保水保湿保温的环境中，48小时内移栽种植完；移栽基质采用表层砂质黄壤土。
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