CN108040879B - 一种黄花补血草生根诱导培养基和黄花补血草繁育方法 - Google Patents

一种黄花补血草生根诱导培养基和黄花补血草繁育方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种黄花补血草生根诱导培养基,属于组织培养技术领域,以1/2LS培养基为基础培养基,包括以下浓度的组分:玉米素2.0~5.0mg/L、α‑萘乙酸0.5~1.5mg/L、活性炭3.0~5.0g/L、蔗糖10~20g/L和琼脂6.0~7.0g/L;所述生根诱导培养基的pH值为5.0~6.5。本发明提供的黄花补血草生根诱导培养基,不但能够快速形成根系,而且根苗生长健壮,生根率可达90~95%。

Description

一种黄花补血草生根诱导培养基和黄花补血草繁育方法
技术领域
本发明涉及组织培养技术领域,尤其涉及一种黄花补血草生根诱导培养基和黄花补血草繁育方法。
背景技术
黄花补血草,为兰雪科补血草属多年生草本植物,耐盐碱、贫瘠、干旱,多生长与滩地、戈壁、石质山坡、流动沙丘等干旱荒漠地区,主要分布于呼伦贝尔沙地、浑善达克沙地、毛乌素沙地、乌兰布和沙漠、腾格里沙漠及甘肃河西走廊等地;在年降雨量300mm以上的地区不需浇水可正常生长,是草坪用水量的1/10;土壤pH 9以下、含盐量0.4%以内可正常生长开花;尤为奇特的是其膜质花萼在6~9月无风季节,保持不落,是干旱荒漠地区为数不多的野生花卉之一,花色艳美,繁密华贵,保持时间极长,可做插花中的配材和衬花,也可用来制作干花,其韵味独特,是插花艺术中不可多得的花材,开发利用前景广泛。另外,它还是药用植物,花萼可入药,具有止痛、消炎、补血之功效;又是防风固沙的优良植物,在生态环境建设方面也具有很好的生态效益,其开发利用前景广泛。
近年来,国内外学者对黄花补血草的研究主要集中在植物栽培驯化、育苗技术、抗旱性及生理生态等方面,已有利用黄花补血草种子进行培养获得无性繁殖系的报道,如以MS或1/2MS为基本培养基,附加不同浓度的6-BA、2,4-D,IBA、NAA或其中的两种激素进行组合,但生根诱导率均较低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黄花补血草生根诱导培养基,不但能够快速形成根系,而且根苗生长健壮,生根率可达90~95%。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案,
本发明提供了一种黄花补血草生根诱导培养基,以1/2LS为基础培养基,包括以下浓度的组分:玉米素2.0~5.0mg/L、α-萘乙酸0.5~1.5mg/L、活性炭3.0~5.0g/L、蔗糖10~20g/L和琼脂6.0~7.0g/L;所述生根培养基的pH值为5.0~6.5。
本发明还提供了一种黄花补血草繁育方法,包括以下步骤::
1)将黄花补血草无菌苗的叶片置于愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养,得到诱导培养物;
2)将所述步骤1)得到的诱导培养物置于不定芽增殖培养基上进行不定芽增殖培养,得到增殖培养物;
3)将所述步骤2)得到的增殖培养物置于上述技术方案所述的生根培养基上进行生根培养,得到黄花补血草。
优选的,所述步骤1)黄花补血草无菌苗的培养方法,包括以下步骤:
a.将黄花补血草种子用水浸泡5~15h,再用水冲洗,得到冲洗种子;
b.将所述步骤a得到的冲洗种子依次经次氯酸钠溶液处理和无菌水冲洗,得到次氯酸钠溶液处理种子;
c.将所述步骤b得到的次氯酸钠溶液处理种子依次经乙醇溶液处理和无菌水冲洗,得到乙醇溶液处理种子;
d.将所述步骤c得到的乙醇溶液处理种子依次经氯化汞溶液处理和无菌水冲洗,得到消毒种子;
e.将所述步骤d得到的消毒种子置于无菌苗培养基上进行无菌苗培养,得到黄花补血草无菌苗。
优选的,所述步骤e中无菌苗培养基以LS培养基为基础培养基,包括以下浓度的组分:蔗糖25~35g/L和琼脂6.0~7.0g/L;所述无菌苗培养基的pH值为5.0~6.5;
所述无菌苗培养的条件包括:暗培养1~2d后再进行光照培养,所述光照培养的温度为20~28℃,所述光照培养的光照强度为1500~1800lx,所述光照培养的光照时间为10~14h/d,所述光照培养的时间为10~15d。
优选的,所述黄花补血草无菌苗的叶片单片的面积为(0.3~0.7)cm×(0.3~0.7)cm。
优选的,所述步骤1)愈伤组织诱导培养的条件包括:暗培养2~4d后再进行光照培养,所述光照培养的温度为22~26℃,所述光照培养的光照强度为1800~2200lx,所述光照培养的光照时间为10~14h/d;所述光照培养的时间为25~30d。
优选的,所述步骤2)不定芽增殖培养基以LS培养基为基础培养基,包括以下浓度的组分:玉米素0.5~1.5mg/L、二氯苯氧乙酸0.1~0.5mg/L、蔗糖25~35g/L和琼脂6.0~7.0g/L;所述不定芽增殖培养基的pH值为5.0~6.5。
优选的,所述步骤2)述不定芽增殖培养的条件包括:所述不定芽增殖培养为光照培养,所述不定芽增殖培养的条件包括:所述不定芽增殖培养的温度为22~26℃,所述不定芽增殖培养的光照强度为2000~2200lx,所述不定芽增殖培养的光照时间为10~16h/d,所述不定芽增殖培养的时间为21~28d。
优选的,所述步骤1)愈伤组织诱导培养基以LS培养基为基础培养基,包括以下浓度的组分:玉米素0.1~0.5mg/L、吲哚丁酸0.5~1.5mg/L、蔗糖25~35g/L和琼脂6.0~7.0g/L;所述愈伤组织诱导培养基的pH值为5.0~6.5。
优选的,所述步骤3)生根培养的条件包括:暗培养3~5d后再进行光照培养,所述光照培养的温度为23~27℃,所述光照培养的光照强度为2000~2200lx,所述光照培养的光照时间为12~16h/d,所述光照培养的时间为21~28d。
本发明提供了一种黄花补血草生根诱导培养基,本发明通过愈伤组织诱导、分化培养、生根培养条件的设置,在保持黄花补血草本身优良性状的基础上,解决了黄花补血草组培培养繁殖生根率低问题;且具有繁殖周期短、繁殖快,育苗成本低的优点;本发明在黄花补血草生根培养阶段采用将基础培养基中无机盐质量浓度减半、并减少培养基中蔗糖含量的方法,在培养基中加入较大含量的活性炭,为根系生长提供一个较黑暗的基部环境,使其生根率大大提高,为黄花补血草种质资源保护及优质苗木的生产、研究提供了技术保障。
本发明实施例的结果显示:本发明提供的黄花补血草生根诱导培养基,不但能够快速形成根系,而且根苗生长健壮,生根率可达90~95%。
具体实施方式
本发明提供了一种黄花补血草生根诱导培养基,以1/2LS培养基为基础培养基,包括以下浓度的组分:玉米素2.0~5.0mg/L、α-萘乙酸0.5~1.5mg/L、活性炭3.0~5.0g/L、蔗糖10~20g/L和琼脂6.0~7.0g/L;所述生根培养基的pH值为5.0~6.5。
本发明提供的黄花补血草生根诱导培养基,以1/2LS培养基为基础培养基,优选包括以下浓度的组分:玉米素2.2~3.0mg/L、α-萘乙酸0.8~1.2mg/L、活性炭3.1~4.0g/L、蔗糖10~20g/L和琼脂6.0~7.0g/L;更优选为玉米素2.5mg/L、α-萘乙酸1.0mg/L、活性炭3.2g/L、蔗糖15g/L和琼脂4g/L。
本发明对所述pH值调节的方法没有特殊的限定,采用本领域技术人员熟知的pH值调节剂进行调节即可,如采用质量浓度为4%的氢氧化钠溶液或质量浓度为8.3%的盐酸溶液进行调节。
本发明还提供了一种黄花补血草繁育方法,包括以下步骤:
1)将黄花补血草无菌苗的叶片置于愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养,得到诱导培养物;
2)将所述步骤1)得到的诱导培养物置于不定芽增殖培养基上进行不定芽增殖培养,得到增殖培养物;
3)将所述步骤2)得到的增殖培养物置于上述技术方案所述的生根培养基上进行生根培养,得到黄花补血草。
本发明将黄花补血草无菌苗的叶片置于愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养,得到诱导培养物。
在本发明中,所述步骤1)黄花补血草无菌苗的培养方法优选包括以下步骤:
a.将黄花补血草种子用水浸泡5~15h,再用水冲洗,得到冲洗种子;
b.将所述步骤a得到的冲洗种子依次经次氯酸钠溶液处理和无菌水冲洗,得到次氯酸钠溶液处理种子;
c.将所述步骤b得到的次氯酸钠溶液处理种子依次经乙醇溶液处理和无菌水冲洗,得到乙醇溶液处理种子;
d.将所述步骤c得到的乙醇溶液处理种子依次经氯化汞溶液处理和无菌水冲洗,得到消毒种子;
e.将所述步骤d得到的消毒种子置于无菌苗培养基上进行无菌苗培养,得到黄花补血草无菌苗。
本发明将黄花补血草种子优选用水浸泡5~15h,更优选为8~12h,最优选为10h。在本发明中,所述浸泡使种子在浸泡过程中充分吸胀吸水,使种子在培养基中培养无菌苗时提前萌发,因为培养基中所含的水分有限。
本发明将得到的冲洗种子依次经次氯酸钠溶液处理和无菌水冲洗,得到次氯酸钠溶液处理种子。在本发明中,所述次氯酸钠溶液的质量百分含量优选为15~25%,更优选为17~22%,最优选为20%;所述次氯酸钠溶液处理的时间优选为5~15min,更优选为7~12min,最优选为10min。本发明优选将冲洗种子浸泡于次氯酸钠溶液中进行处理。本发明优选重复无菌水冲洗的过程,所述重复的次数优选为3次。
本发明将得到的次氯酸钠溶液处理种子依次经乙醇溶液处理和无菌水冲洗,得到乙醇溶液处理种子。在本发明中,所述乙醇溶液的体积百分含量优选为65~75%,更优选为68~72%,更优选为70%;所述乙醇溶液处理的时间优选为20~60s,更优选为30~50s,最优选为35s。本发明优选将次氯酸钠溶液处理种子浸泡于乙醇溶液中进行处理。本发明优选重复无菌水冲洗的过程,所述重复的次数优选为4次。
本发明将得到的乙醇溶液处理种子依次经氯化汞溶液处理和无菌水冲洗,得到消毒种子。在本发明中,所述氯化汞溶液的质量百分含量优选为0.05~0.15%,更优选为0.1%;所述氯化汞溶液处理的时间优选为1~5min,更优选为2~4min,最优选为3min。本发明优选将乙醇溶液处理种子浸泡于氯化汞溶液中进行处理。本发明优选重复无菌水冲洗的过程,所述重复的次数优选为5次。
本发明将得到的消毒种子置于无菌苗培养基上进行无菌苗培养,得到黄花补血草无菌苗。在本发明中,所述无菌苗培养基以LS培养基为基础培养基,优选包括以下浓度的组分:蔗糖25~35g/L和琼脂6.0~7.0g/L,更优选包括蔗糖28~32g/L和琼脂6.2~6.8g/L,最优选包括蔗糖30g/L和琼脂6.5g/L;所述无菌苗培养基的pH值优选为5.0~6.5,更优选5.4~6.0,最优选为5.8。本发明对pH值调节的方法没有特殊的限定,采用本领域技术人员熟知的pH值调节剂进行调节即可,如采用质量浓度为4%的氢氧化钠溶液或质量浓度为8.3%的盐酸溶液进行调节。
在本发明中,所述无菌苗培养的条件包括:所述无菌苗培养优选在暗培养1~2d后再进行光照培养,所述光照培养的温度优选为20~28℃,更优选为22~26℃,最优选为24℃;所述光照培养的光照强度优选为1500~1800lx,更优选为1600~1700lx;所述光照培养的光照时间优选为10~14h/d,更优选为12h/d;所述光照培养的时间优选为10~15d,更优选为11~14d,最优选为12~13d。
在本发明中,所述黄花补血草无菌苗的叶片优选为去掉黄花补血草叶片四周边缘部分,所述黄花补血草无菌苗的叶片单片的面积优选为(0.3~0.7)cm×(0.3~0.7)cm,更优选为(0.4~0.6)cm×(0.4~0.6)cm,最优选为0.5cm×0.5cm。
本发明将黄花补血草无菌苗的叶片置于愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养,得到诱导培养物。
在本发明中,所述黄花补血草无菌苗的叶片在愈伤组织诱导培养基上的密度优选为0.15~0.35片/cm2,更优选为0.2~0.3片/cm2,最优选为0.24片/cm2
在本发明中,所述愈伤组织诱导培养基,以LS培养基为基础培养基,优选包括以下浓度的组分:玉米素0.1~0.5mg/L、吲哚丁酸0.5~1.5mg/L、蔗糖25~35g/L和琼脂6.0~7.0g/L;所述愈伤组织诱导培养基的pH值为5.0~6.5;更优选为玉米素0.2~0.4mg/L、吲哚丁酸0.8~1.2mg/L、蔗糖28~32g/L和琼脂6.2~6.8g/L;最优选为玉米素0.3mg/L、吲哚丁酸1.0mg/L、蔗糖30g/L和琼脂6.5g/L。
在本发明中,所述愈伤组织诱导培养的条件优选包括:暗培养2~4d后再进行光照培养,所述光照培养的温度优选为22~26℃,更优选为23~25℃,最优选为24℃;所述光照培养的光照强度优选为1800~2200lx,更优选为1900~2100lx,最优选为2000lx;所述光照培养的光照时间优选为10~14h/d,更优选为11~13h/d;所述光照培养的时间优选为25~30d,更优选为26~29d,最优选为27~28d。
本发明将得到的诱导培养物置于不定芽增殖培养基上进行不定芽增殖培养,得到增殖培养物。
在本发明中,所述不定芽增殖培养基以LS培养基为基础培养基,优选包括以下浓度的组分:玉米素0.5~1.5mg/L、二氯苯氧乙酸0.1~0.5mg/L、蔗糖25~35g/L和琼脂6.0~7.0g/L;更优选包括玉米素0.7~1.2mg/L、二氯苯氧乙酸0.2~0.4mg/L、蔗糖28~32g/L和琼脂6.2~6.8g/L;最优选包括玉米素1.0mg/L、二氯苯氧乙酸0.3mg/L、蔗糖30g/L和琼脂6.5g/L;所述不定芽增殖培养基的pH值优选为5.0~6.5,更优选为5.4~6.0,最优选为5.8。本发明对所述pH值调节的方法没有特殊的限定,采用本领域技术人员熟知的pH值调节剂进行调节即可,如采用质量浓度为4%的氢氧化钠溶液或质量浓度为8.3%的盐酸溶液进行调节。
在本发明中,所述诱导培养物在不定芽增殖培养基上的密度优选为0.15~0.35块/cm2,更优选为0.2~0.3块/cm2,最优选为0.24块/cm2
在本发明中,所述不定芽增殖培养为光照培养,所述不定芽增殖培养的条件优选包括:所述不定芽增殖培养的温度优选为22~26℃,更优选为23~25℃,最优选为24℃;所述不定芽增殖培养的光照强度优选为2000~2200lx,更优选为2100lx;所述不定芽增殖培养的光照时间优选为10~16h/d,更优选为11~15h/d,最优选为12~14h/d;所述不定芽增殖培养的时间优选为21~28d,更优选为23~26d,最优选为25d。
本发明将得到增殖培养物置于上述技术方案所述的生根培养基上进行生根培养,得到黄花补血草。
在本发明中,所述增殖培养物在生根培养基上的密度优选为0.1~0.25个/cm2,更优选为1.4~0.2个/cm2,最优选为0.17个/cm2
在本发明中,所述生根诱导培养基,以1/2LS培养基为基础培养基,包括以下浓度的组分:玉米素2.0~5.0mg/L、α-萘乙酸0.5~1.5mg/L、活性炭3.0~5.0g/L、蔗糖10~20g/L和琼脂6.0~7.0g/L;所述生根培养基的pH值为5.0~6.5;优选包括以下浓度的组分:玉米素2.2~3.0mg/L、α-萘乙酸0.8~1.2mg/L、活性炭3.1~4.0g/L、蔗糖10~20g/L和琼脂6.0~7.0g/L;更优选为玉米素2.5mg/L、α-萘乙酸1.0mg/L、活性炭3.2g/L、蔗糖15g/L和琼脂4g/L。
在本发明中,所述生根培养的条件优选包括:暗培养3~5d后再进行光照培养,所述光照培养的温度优选为23~27℃,更优选为24~26℃,最优选为25℃;所述光照培养的光照强度优选为2000~2200lx,更优选为2100lx;所述光照培养的光照时间为12~16h/d,更优选为13~15h/d,最优选为14h/d;所述光照培养的时间25~30d。
在本发明中,所述愈伤组织诱导培养、不定芽增殖培养和生根培养优选在容积为450ml的玻璃瓶中进行,所述玻璃瓶优选圆柱形,所述玻璃瓶的瓶口优选采用塑料瓶盖进行封口。
下面结合实施例对本发明提供的一种黄花补血草生根诱导培养基和黄花补血草繁育方法进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一、主要步骤
1、种子消毒处理:
挑选当年采收的饱满、大小一致的黄花补血草的种子若干,放置在带有密封盖的容器中,该容器容积约为20ml,用力摇动10min后用水浸泡10h,之后用移液器将液体吸除,用清水冲洗1次,得到冲洗种子。
冲洗种子消毒首先采用15%的次氯酸钠浸泡10min,之后用无菌水冲洗3次;再采用70%的乙醇浸泡40s,无菌水冲洗3次;再采用0.1%氯化汞浸泡3min,用无菌水冲洗5次,得到消毒种子;采用上述试剂浸泡及无菌水冲洗期间加盖后不断摇动塑料管,以便使种子消毒处理更加彻底、充分,最后用镊子将处理好的种子夹出,放在铺有滤纸的培养皿中待用。
2、无菌苗培养:
(1)方法及配方:将消毒种子接种到LS基本培养基上,培养基中附加蔗糖30g/L和琼脂6.5g/L,培养基的pH值为6.2,每瓶培养基接种10粒种子,培养瓶的规格为450ml,圆柱形,由于之前种子消毒处理前进行浸泡,种子接种后3d即可萌发,待发芽后无菌苗长至5cm即可剪取用愈伤组织诱导,种子萌发率为100%。
(2)培养条件:接种后置于人工培养箱中暗培养1d,之后置于温度24℃、光照强度1500lx、光照时间12h/d的培养室进行培养10d,得到黄花补血草无菌苗。
3、愈伤组织诱导
(1)方法及配方:剪切掉黄花补血草无菌苗四周边缘的叶片,留下的面积为0.5cm×0.5cm作为诱导愈伤组织的材料,平铺接种至三角瓶中,之后用镊子轻轻按压,以便外植体和培养基充分接触,每瓶培养基接种7片叶片。所用培养基配方为LS+玉米素0.3mg/L+吲哚丁酸1.0mg/L,培养基中附加蔗糖30g/L和琼脂6.5g/L,培养基的pH值为5.8,在此培养基中叶片愈伤组织诱导率为99.51%。
(2)培养条件:接种后置于人工培养箱中暗培养3d,之后置于温度24±2℃、光照强度2000lx、光照时间12h/d的培养室进行培养25d,得到诱导培养物。
4、不定芽增殖
(1)方法及配方:用已灭菌的手术刀片切取诱导培养物作为进行不定芽诱导的材料,平铺接种于不定芽增殖培养基上,之后轻轻按压,以便使接种的诱导培养物与培养基充分接触,每瓶培养基接种7块诱导培养物。所用培养基配方为LS+玉米素1.0mg/L+二氯苯氧乙酸0.4mg/L,培养基中附加蔗糖30g/L和琼脂6.0g/L,培养基的pH值为5.8,在此培养基中不定芽增殖率为91.35%。
(2)培养条件:接种后置于温度24±2℃、光照强度2000lx、光照时间12h/d的培养室进行培养25d,得到增殖培养物。
5、生根培养
(1)方法及配方:剪取不定芽分化培养基中生长25d,带有2个茎结、并具有茎尖的5个茎段转接入附加不同浓度玉米素、α-萘乙酸、活性炭的培养基上进行生根培养,培养基与激素组合配方为1/2LS+玉米素2.5mg/L+α-萘乙酸1.0mg/L+活性炭3.0g/L,培养基中附加蔗糖15g/L和琼脂6.0g/L,培养基的pH值为5.8,在此培养基中不定芽生根率为94.16%。由于接种初期进行了暗培养,不定芽最早10d开始生根,且主根粗壮、须根较多,根苗颜色嫩绿、生长旺盛,有利于出瓶炼苗移栽。
(2)培养条件:接种后置于人工培养箱中暗培养4d,之后置于温度25℃、光照强度2000lx、光照时间14h/d的培养室进行培养30d,得到黄花补血草。
实施例2
一、主要步骤
1、种子消毒处理:
挑选当年采收的饱满、大小一致的黄花补血草的种子若干,放置在带有密封盖的容器中,该容器容积约为20ml,用力摇动10min后用水浸泡11h,之后用移液器将液体吸除,用清水冲洗1次,得到冲洗种子。
冲洗种子消毒首先采用20%的次氯酸钠浸泡7min,之后用无菌水冲洗3次;再采用75%的乙醇浸泡25s,无菌水冲洗4次;再采用0.15%氯化汞浸泡2min,用无菌水冲洗5次,得到消毒种子;采用上述试剂浸泡及无菌水冲洗期间加盖后不断摇动塑料管,以便使种子消毒处理更加彻底、充分,最后用镊子将处理好的种子夹出,放在铺有滤纸的培养皿中待用。
2、无菌苗培养:
(1)方法及配方:将消毒种子接种到LS基本培养基上,培养基中附加蔗糖25g/L和琼脂6.3g/L,培养基的pH值为6.0,每瓶培养基接种10粒种子,由于之前种子消毒处理前进行浸泡,种子接种后3d即可萌发,待发芽后无菌苗长至5cm即可剪取用愈伤组织诱导,种子萌发率为100%。
(2)培养条件:接种后置于人工培养箱中暗培养2d,之后置于温度28℃、光照强度1700lx、光照时间11h/d的培养室进行培养12d,得到黄花补血草无菌苗。
3、愈伤组织诱导
(1)方法及配方:剪切掉黄花补血草无菌苗四周边缘的叶片,留下的面积为0.5cm×0.5cm作为诱导愈伤组织的材料,平铺接种至三角瓶中,之后用镊子轻轻按压,以便外植体和培养基充分接触,每瓶培养基接种7片叶片。所用培养基配方为LS+玉米素0.5mg/L+吲哚丁酸1.5mg/L,培养基中附加蔗糖25g/L和琼脂6.5g/L,培养基的pH值为5.8,在此培养基中叶片愈伤组织诱导率为96.16%。
(2)培养条件:接种后置于人工培养箱中暗培养4d,之后置于温度26℃、光照强度2100lx、光照时间14h/d的培养室进行培养30d,得到诱导培养物。
4、不定芽增殖
(1)方法及配方:用已灭菌的手术刀片切取诱导培养物作为进行不定芽诱导的材料,平铺接种于不定芽增殖培养基上,之后轻轻按压,以便使接种的诱导培养物与培养基充分接触,每瓶培养基接种7块诱导培养物。所用培养基配方为LS+玉米素1.5mg/L+二氯苯氧乙酸0.5mg/L,培养基中附加蔗糖30g/L和琼脂6.0g/L,培养基的pH值为5.8,在此培养基中不定芽增殖率为92.66%。
(2)培养条件:接种后置于温度25℃、光照强度2200lx、光照时间11h/d的培养室进行培养28d,得到增殖培养物。
5、生根培养
(1)方法及配方:剪取不定芽分化培养基中生长28d,带有2个茎结、并具有茎尖的5个茎段转接入附加不同浓度玉米素、α-萘乙酸、活性炭的培养基上进行生根培养,培养基与激素组合配方为1/2LS+玉米素3.0mg/L+α-萘乙酸1.2mg/L+活性炭4.5g/L,培养基中附加蔗糖10g/L和琼脂6.0g/L,培养基的pH值为5.8,在此培养基中不定芽生根率为96.03%。由于接种初期进行了暗培养,不定芽最早7d开始生根,且主根粗壮、须根较多,根苗颜色嫩绿、生长旺盛,有利于出瓶炼苗移栽。
(2)培养条件:接种后置于人工培养箱中暗培养3d,之后置于温度25℃、光照强度2200lx、光照时间13h/d的培养室进行培养28d,得到黄花补血草。
由以上实施例可知,本发明提供的黄花补血草生根诱导培养基,不但能够快速形成根系,而且根苗生长健壮,生根率可达90~95%。
对比例1
基本培养基不同,其它条件均与实施例1相同时的培养结果。
表1不同培养基中黄花补血草生长情况
分别采用MS、N6、LS培养基,其它条件均与本发明相同时的培养结果如表1所示。三种培养基中无菌苗的种子萌发率均达到90%以上,其中LS培养基培养时,种子全部萌发;在愈伤组织诱导、不定芽分化培养时,三种基本培养基培养结果差异较大,大小差异在20%以内;但进行黄花补血草生根培养时,三种培养基结果差异很大,LS培养基中生根率高达94.23%,N6培养基中生根率为74.27%,而采用MS为基本培养基时,生根率仅为67.02%。
对照例2
发明中的基本培养基为LS培养基、培养方式不同时的培养结果。
表2不同培养方式下黄花补血草快繁情况
如表2所示,采用两种不同的方式进行培养时,种子接种后结合暗培养,3d即可萌发,而常规方式培养时,种子最早9d萌发,差异较大,而两种培养方式下种子萌发率差异较小;在愈伤组织诱导培养时,两种培养方式间愈伤组织诱导率差异较小,大小差异保持在5%左右,且诱导时间也有差异;但生根培养时,两种培养方式差异很大,暗培养与光照培养相结合时7d可生根,生根率高达94.19%,而常规培养时最早13d开始生根,生根率仅为78.18%。
对比例3
不同培养基配方中黄花补血草生根诱导培养情况对比。
现有研究中大多采用MS或1/2MS作为基本培养基,或添加生长激素、附加活性炭进行生根诱导,表3为不同基础培养基或添加植物激素、活性炭时黄花补血草生根诱导情况。结果表明,单独使用MS、1/2MS、LS或1/2LS基本培养基时,根系发育较晚,最早为1/2LS基本培养基处理时14d开始长出根系,生根诱导率最大为55.19%,其中生根率大小为1/2MS>MS、1/2LS>LS;以1/2MS为基本培养基,附加不同植物激素及活性炭时,添加吲哚丁酸时的生根率大于添加α-萘乙酸时的生根率,在此基础上附加活性炭时的生根率>不加活性炭时的生根率,最大生根率为1/2MS培养基中添加吲哚丁酸1.5~5.0mg/L及活性炭3.0~5.0g/L的处理,生根率为68.49%,最早11d左右开始生根;以1/2LS作为基本培养基,附加不同浓度的玉米素、α-萘乙酸及活性炭时,不但能够快速形成根系,最早7d开始生根,而且根苗生长健壮,生根率最大可达94.11%。
表3不同培养基配方黄花补血草生根诱导培养对比
由以上实施例可以得出,本发明提供的黄花补血草生根诱导培养基,不但能够快速形成根系,而且根苗生长健壮,生根率可达90~95%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种黄花补血草生根诱导培养基,以1/2LS为基础培养基,包括以下浓度的组分:玉米素2.0~5.0mg/L、α-萘乙酸0.5~1.5mg/L、活性炭3.0~5.0g/L、蔗糖10~20g/L和琼脂6.0~7.0g/L;所述生根培养基的pH值为5.0~6.5。
2.一种黄花补血草繁育方法,包括以下步骤:
1)将黄花补血草无菌苗的叶片置于愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养,得到诱导培养物;
2)将所述步骤1)得到的诱导培养物置于不定芽增殖培养基上进行不定芽增殖培养,得到增殖培养物;
3)将所述步骤2)得到的增殖培养物置于权利要求1所述的生根培养基上进行生根培养,得到黄花补血草。
3.根据权利要求2所述的繁育方法,其特征在于,所述步骤1)黄花补血草无菌苗的培养方法,包括以下步骤:
a.将黄花补血草种子用水浸泡5~15h,再用水冲洗,得到冲洗种子;
b.将所述步骤a得到的冲洗种子依次经次氯酸钠溶液处理和无菌水冲洗,得到次氯酸钠溶液处理种子;
c.将所述步骤b得到的次氯酸钠溶液处理种子依次经乙醇溶液处理和无菌水冲洗,得到乙醇溶液处理种子;
d.将所述步骤c得到的乙醇溶液处理种子依次经氯化汞溶液处理和无菌水冲洗,得到消毒种子;
e.将所述步骤d得到的消毒种子置于无菌苗培养基上进行无菌苗培养,得到黄花补血草无菌苗。
4.根据权利要求3所述的繁育方法,其特征在于,所述步骤e中无菌苗培养基以LS培养基为基础培养基,包括以下浓度的组分:蔗糖25~35g/L和琼脂6.0~7.0g/L,所述无菌苗培养基的pH值为5.0~6.5;
所述无菌苗培养的条件包括:暗培养1~2d后再进行光照培养,所述光照培养的温度为20~28℃,所述光照培养的光照强度为1500~1800lx,所述光照培养的光照时间为10~14h/d,所述光照培养的时间为10~15d。
5.根据权利要求2所述的繁育方法,其特征在于,所述黄花补血草无菌苗的叶片单片的面积为(0.3~0.7)cm×(0.3~0.7)cm。
6.根据权利要求2所述的繁育方法,其特征在于,所述步骤1)愈伤组织诱导培养的条件包括:暗培养2~4d后再进行光照培养,所述光照培养的温度为22~26℃,所述光照培养的光照强度为1800~2200lx,所述光照培养的光照时间为10~14h/d,所述光照培养的时间为25~30d。
7.根据权利要求2所述的繁育方法,其特征在于,所述步骤2)不定芽增殖培养基以LS培养基为基础培养基,包括以下浓度的组分:玉米素0.5~1.5mg/L、二氯苯氧乙酸0.1~0.5mg/L、蔗糖25~35g/L和琼脂6.0~7.0g/L;所述不定芽增殖培养基的pH值为5.0~6.5。
8.根据权利要求2或7所述的繁育方法,其特征在于,所述步骤2)不定芽增殖培养为光照培养,所述不定芽增殖培养的条件包括:所述不定芽增殖培养的温度为22~26℃,所述不定芽增殖培养的光照强度为2000~2200lx,所述不定芽增殖培养的光照时间为10~16h/d,所述不定芽增殖培养的时间为21~28d。
9.根据权利要求2所述的繁育方法,其特征在于,所述步骤1)愈伤组织诱导培养基,以LS培养基为基础培养基,包括以下浓度的组分:玉米素0.1~0.5mg/L、吲哚丁酸0.5~1.5mg/L、蔗糖25~35g/L和琼脂6.0~7.0g/L;所述愈伤组织诱导培养基的pH值为5.0~6.5。
10.根据权利要求2所述的繁育方法,其特征在于,所述步骤3)生根培养的条件包括:暗培养3~5d后再进行光照培养,所述光照培养的温度为23~27℃,所述光照培养的光照强度为2000~2200lx,所述光照培养的光照时间为12~16h/d,所述光照培养的时间25~30d。
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