CN101480166B - 一种杉木组织培养生根方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种杉木组织培养生根方法，切取杉木增殖继代小苗，接种于杉木生根培养基进行组织培养生根，杉木生根培养基由改良MS培养基、ABT1#0.4～0.8mg/L、IBA 0.1～0.5mg/L和根太阳稀释液2～6mL/L组成。采用上述杉木生根培养基后，杉木的生根时间缩短至16～22天，经22天培养后，最高生根率达到96％，苗木生长速度快，使得杉木的育苗成本降低，实现杉木产业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种杉木组织培养生根方法，具体地涉及使用改良MS培养基和激素组成的杉木生根培养基进行组织培养生根的方法。
背景技术
杉木(Cunninghamia lanceolata(lamb.)Hook)为杉科植物，是一种适应性广、材质优良的经济林树种。由于杉木是异花授粉树种，用种子繁殖，个体分化大，难以保持杉木母体的性状。而常规的扦插、压条或嫁接等无性繁殖方法，繁育速度缓慢，难以满足日益增长的市场需求。为此，杉木要在短期内获得大量优良无性系苗木，只有通过植物组织培养技术解决问题。组织培养方法是一种快速无性繁殖技术，选择杉木优良无性系材料，采用组织培养方法，既可以保持母体的优良性状，又可以有效节约生产成本。现有的杉木组织培养商业产业化过程中，生根缓慢、生根率低、生长速度慢等问题，一直阻碍着杉木产业化育苗生产进程。因此，申请人拟提供一种新型的杉木生根培养基，解决现有杉木培养技术中杉木生根难、生根率低的问题。
表1中列出了植物组织培养常用的MS(Murashige&Skoog)培养基成分，包括大量元素、微量元素、铁盐、有机物和白糖。其中，大量元素由C、H、O、N、P、S、K、Ca、Cl、Mg组成，它们是植物细胞中构成核酸、蛋白质、酶系统、叶绿体以及生物膜所必不可少的元素；微量元素由Fe、Cu、Mo、Zn、Na、Mn、Co、B、I等营养元素组成，它们在植物体内的含量极低，往往仅占作物体内干重的千分之几到百万分之几，但其作用极其重要，它们参与了植物体内多种生理活动，是不可或缺的营养元素；盐酸硫铵素、烟酸、盐酸吡哆醇、肌醇、抗坏血酸、生物素为有机物，有机物是植物健康生长的营养物质，植物多数能够直接吸收，对植物细胞分化和再分化起着积极作用；白糖是异养培养植物的碳源，并对保持培养基渗透压起主要作用。
表1植物组织培养常用的MS培养基成分
| 组成成分 | 使用浓度(mg/L) | 组成成分 | 使用浓度(mg/L) | ||
| 大量元素 | NH4NO3KNO3CaCl2·2H2OMgSO4·7H2OKH2PO4 | 16501900440370170 | 铁盐 | FeSO4·7H2ONa2-EDTA | 27.837.3 |
| 白糖 | 30000 | ||||
| 微量元素 | KIH3BO3MnSO4·4H2OZnSO4·7H2ONa2MoO4·2H2OCoCl2·6H2OCuSO4·5H2O | 0.836.222.38.60.250.0250.025 | 有机物 | 肌醇烟酸盐酸吡哆醇甘氨酸盐酸硫铵等 | 100.00.50.52.00.4 |
发明内容
本发明的目的在于提供一种杉木优良无性系的组织培养生根方法，以解决现有技术中存在的上述问题，用本发明的组织培养生根法可以缩短生根周期，提高生根率，加快苗木的生长速度。
本发明的解决方案是：
一种杉木优良无性系的组织培养生根方法，具体是切取杉木增殖继代小苗，接种于优选出的杉木生根培养基，生根方式为皮部生根型；其中，
杉木生根培养基由改良MS(Murashige & Skoog)基本培养基、ABT1#(50％萘乙·吲乙可溶性粉剂)0.4～0.8mg/L、IBA(吲哚丁酸)0.1～0.5mg/L和根太阳稀释液2～6mL/L组成；
所述根太阳稀释液由根太阳原液兑水1∶100稀释制成；
所述改良MS培养基包含大量元素、有机物、微量元素、铁盐、白糖及活性炭；
所述大量元素由680～825mg/L NH4NO3、633～950mg/L KNO3、57～85mg/L KH2PO4、200～300mg/L无水CaCl2和185mg/L MgSO4·7H2O组成；
所述有机物由5mg/L盐酸硫铵素、1mg/L烟酸、1mg/L盐酸吡哆醇、100mg/L肌醇、5mg/L抗坏血酸和0.4mg/L生物素组成；
白糖的含量为15g/L；活性炭含量为0.05g/L；
所述微量元素和铁盐含量与传统MS培养基中的含量相同，即，FeSO4·7H2O含量为27.8mg/L、Na2-EDTA含量为37.3mg/L、KI含量为0.83mg/L、H3BO3含量为6.2mg/L、MnSO4·4H2O含量为22.3mg/L、ZnSO4·7H2O含量为8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O含量为0.25mg/L、CoCl2·6H2O含量为0.025mg/L、CuSO4·5H2O含量为0.025mg/L。
本发明提供的改良MS培养基之大量元素可优选为：NH4NO3含量为680mg/L、KNO3含量为800mg/L、KH2PO4含量为85mg/L、无水CaCl2含量为200mg/L、MgSO4·7H2O含量为185mg/L。
本发明提供的杉木生根培养基中的激素配比可优选为：ABT1#0.4mg/L、IBA 0.1mg/L、根太阳稀释液2mL/L。
所述杉木增殖继代小苗的切取长度优选1.5cm。
在上述杉木生根培养基中，ABT1#、IBA、根太阳为激素，它们能够加快并促进植物细胞的有丝分裂，对植物培养成功与否起着关键性的作用；活性炭在培养基中的加入可促进或抑制离体生长，具有对生长抑制物、生长调节剂及其他有机物等的吸附作用，在生根阶段给培养物创造暗环境，对生根有促进作用。
下面将通过一些具体的试验情况来说明本发明所述杉木优良无性系组织培养生根方法中改良MS培养基优选组分范围及有效的激素配比。
本发明将增殖继代培养出的杉木小苗接入杉木生根培养基上，以下各组试验的培养条件为：温度25±2℃、光照强度控制在1500～3000Lux，自然光照培养，环境湿度35～45％，所有使用药品试剂均为分析纯。
一、MS大量元素对杉木组织培养苗培养的影响
取传统MS培养基中各大量元素的1/4量，铁盐、微量元素、有机物、白糖含量不变(以下简称1/4MS培养基，下同)、1/3MS培养基、1/2MS培养基和MS培养基四组进行对比试验，在不添加激素前提下，确定大量元素对杉木组织培养苗培养的影响。
取杉木增殖继代小苗接种于所述不同浓度梯度培养基。每组试验至少20瓶，每瓶接种20株高1.5cm杉木小苗，三次重复。
表2大量元素对杉木培养的影响
| 培养基 | 生长情况(22天统计) |
| 1/4MS大量元素， | 苗木缓慢生长，叶色偏黄。 |
| 1/3MS大量元素， | 苗木生长正常，叶色绿色，少部分苗木出现高生长。 |
| 1/2MS大量元素， | 苗木生长正常，叶色浓绿，多数苗木出现高生长。 |
| MS | 苗木生长速度缓慢，叶色偏黄，茎段变白。 |
上表表明，大量元素使用浓度的高低直接影响着杉木生根培养效果，在中低盐分1/3MS～1/2MS浓度杉木组织培养苗生长正常，叶色浓绿，苗木出现高生长。对杉木生根培养均能取得较好培养效果。
二、NH4NO3、KNO3、KH2PO4、无水CaCl2对杉木培养的影响
为进一步确定NH4NO3、KNO3、KH2PO4、无水CaCl2大量元素对杉木培养的影响，我们在改良MS培养基中选择添加不同浓度的NH4NO3、KNO3、KH2PO4及无水CaCl2，进行正交设计试验，确定改良MS培养基中的最佳NH4NO3、KNO3、KH2PO4及无水CaCl2浓度配比。
改良MS培养基中其余组分如下：MgSO4·7H2O含量为185mg/L；
盐酸硫铵素含量为5mg/L、烟酸含量为1mg/L、盐酸吡哆醇含量
为1mg/L、肌醇含量为100mg/L、抗坏血酸含量为5mg/L、生物素含量为0.4mg/L；
白糖含量为15g/L；活性炭含量为0.05g/L；
微量元素、铁盐含量与传统MS培养基中的含量相同。
取杉木增殖继代小苗，接种于9组改良MS培养基进行杉木组织培养效果试验。每组试验至少20瓶，每瓶接种20株高1.5cm杉木小苗，三次重复。
表3 4因素3水平正交设计试验(mg/L)(22天统计)
| 组合 | NH4NO3 | KNO3 | KH2PO4 | 无水CaCl2 | 生长情况 |
| 1 | 550 | 633 | 57 | 200 | 生长较快，叶色偏黄，个别出现高生长 |
| 2 | 550 | 800 | 70 | 300 | 生长速度较快，叶色偏黄，个别出现高生长 |
| 3 | 550 | 950 | 85 | 400 | 生长速度较快，叶色偏黄，少数出现高生长 |
| 4 | 680 | 633 | 70 | 400 | 生长正常，茎段偏白，叶色叶片正常 |
| 5 | 680 | 800 | 85 | 200 | 生长速度快，叶片浓绿色，茎段多数抽长明显 |
| 6 | 680 | 950 | 57 | 300 | 生长速度较快，叶色浓绿，少数高生长 |
| 7 | 825 | 633 | 85 | 300 | 生长速度较快，叶色浓绿，茎段抽长明显 |
| 8 | 825 | 800 | 57 | 400 | 生长速度较快，茎段偏白，少数高生长 |
| 9 | 825 | 950 | 70 | 200 | 生长速度较快，叶色浓绿，少数高生长 |
根据上述试验结果，杉木生根培养改良MS培养基中NH4NO3、KNO3、KH2PO4、无水CaCl2组份含量优选为：NH4NO3含量为680～825mg/L、KNO3含量为633～950mg/L、KH2PO4含量为57～85mg/L、无水CaCl2含量为200～300mg/L。
根据上述试验结果，杉木生根培养改良MS培养基中NH4NO3、KNO3、KH2PO4、无水CaCl2组份含量更优选为：NH4NO3含量为680mg/L、KNO3含量为800mg/L、KH2PO4含量为85mg/L、无水CaCl2含量为200mg/L。
三、激素配比对杉木生根率的影响
以改良MS培养基为基本培养基，所述改良MS培养基的组成为：NH4NO3含量为680mg/L、KNO3含量为800mg/L、KH2PO4含量为85mg/L、无水CaCl2含量为200mg/L和MgSO4·7H2O含量为185mg/L；
盐酸硫铵素含量为5mg/L、烟酸含量为1mg/L、盐酸吡哆醇含量为1mg/L、肌醇含量为100mg/L、抗坏血酸含量为5mg/L、生物素含量为0.4mg/L；
白糖含量为15g/L、活性炭含量为0.05g/L；
微量元素、铁盐含量与传统MS培养基中的含量相同。
在改良MS培养基中添加不同浓度的ABT1#、IBA和根太阳，进行正交设计试验，确定杉木生根配方的最佳激素配比。
取杉木增殖继代小苗接种于杉木生根培养基进行组织培养生根试验。每组试验至少20瓶，每瓶接种20株小苗，三次重复。
表43因素4水平正交设计表(22天统计)
| 试验组合 | ABT1#mg/L | IBAmg/L | 根太阳mL/L | 生根率 | 生长情况 |
| 1 | 0.4 | 0 | 0 | 20％ | 基部长愈伤，切口变黑，苗正常 |
| 2 | 0.4 | 0.1 | 2 | 96％ | 基部长愈伤，苗正常，发根多 |
| 3 | 0.4 | 0.3 | 4 | 82％ | 少部分烧苗，较粗壮苗不明显，发根多 |
| 4 | 0.4 | 0.5 | 8 | 75％ | 多数苗有烧苗现象，发根多 |
| 5 | 0.6 | 0 | 2 | 10％ | 苗木生长正常，叶色浓绿长愈伤组织 |
| 6 | 0.6 | 0.1 | 0 | 12％ | 部分苗木出现烧苗现象 |
| 7 | 0.6 | 0.3 | 8 | 20％ | 90％以上苗木整株变白，叶片缺绿 |
| 8 | 0.6 | 0.5 | 4 | 85％ | 苗木生长正常，少数苗出现白苗现象 |
| 9 | 0.8 | 0 | 4 | 50％ | 基部褐化明显，出现较多烧苗、白苗现象 |
| 10 | 0.8 | 0.1 | 8 | 0 | 基部褐化明显，苗木出现白苗 |
| 11 | 0.8 | 0.3 | 0 | 0 | 苗木生长正常，叶色浓绿 |
| 12 | 0.8 | 0.5 | 2 | 80％ | 小部分小苗出现白苗，苗木生长正常，叶色浓绿 |
| 13 | 1.2 | 0 | 8 | 0 | 小部分出现白苗、烧苗现象 |
| 14 | 1.2 | 0.1 | 4 | 15％ | 基部褐化明显，苗木生长正常 |
| 15 | 1.2 | 0.3 | 2 | 80％ | 多数苗木白化，烧苗，死苗，出现不正常发根，根颜色呈红色 |
| 16 | 1.2 | 0.5 | 0 | 10％ | 多数苗木出现烧苗现象 |
试验数据显示：杉木生根培养阶段对不同激素浓度配比敏感，苗木生长情况出现了显著差异，高浓度的ABT1#、IBA和根太阳虽然同样取得了较高生根率，但同时部分苗木出现烧苗、白苗现象。
根据上述正交试验结果，杉木生根培养基激素的含量优选为：ABT1#含量为0.4～0.8mg/L、IBA含量为0.1～0.5mg/L、根太阳(原液兑水1∶100稀释)含量为2～6mL/L。
杉木生根培养基的激素含量更优选为：ABT1#含量为0.4mg/L、IBA含量为0.1/L、根太阳(原液兑水1∶100稀释)含量为2ml/L。
苗木能够生根形成完整植株，是影响杉木产业化育苗的一个关键性技术难点，提高生根率，缩短生根时间是本发明重点解决的问题。本发明揭示的杉木生根培养基，解决了杉木组织培养生根苗生根率低的技术难题，在采用上述杉木生根培养基后，杉木的生根时间由原来普遍的30天缩短至16～22天，经22天培养后，最高生根率达到96％，在加快杉木组培苗生根速度、提高苗木生根率的同时，又提高苗木生长速度，大大缩短了杉木生根苗的开瓶移栽时间，大幅度降低了杉木苗木的培养成本，满足杉木产业化生产的要求。
具体实施方式
为更好的说明本发明，我们提供了下述实施例，以下的实施只是为了更好地说明本发明，但本发明的保护范围不限于此。
本发明切取长度约1.5cm的杉木增殖继代小苗，接种于杉木生根培养基进行组织培养生根试验，生根方式为皮部生根型。
杉木生根培养基由不同浓度的NH4NO3、KNO3、KH2PO4、无水CaCl2，ABT1#、IBA、根太阳和185mg/LMgSO4·7H2O、5mg/L盐酸硫铵素、1mg/L烟酸、1mg/L盐酸吡哆醇、100mg/L肌醇、5mg/L抗坏血酸、0.4mg/L生物素、15g/L白糖、0.05g/L活性炭、微量元素和铁盐组成。其中，微量元素、铁盐含量与传统MS培养基中的含量相同。
本实施例在温度25±2℃、光照强度控制在1500～3000Lux，自然光照培养，环境湿度35～45％的培养条件下进行。所有使用药品试剂均为分析纯。
每组试验至少20瓶，每瓶接种20株高1.5cm杉木小苗，三次重复。
试验结果见表5。
表5表明：用本发明的生根培养基进行杉木优良无性系的组织培养生根，杉木的生根时间缩短至16～22天，最高生根率达到96％，提高苗木生长速度，可大幅度降低杉木苗木的培养成本。
表5不同杉木生根培养基杉木生根时间、生根率及生长速度(mg/L)
| 组合 | NH4NO3 | KNO3 | KH2PO4 | 无水CaCl2 | ABT1# | IBA | 根太阳mL/L | 生根时间(天) | 生根率(22天统计) | 生长速度(40天统计) |
| 1 | 680 | 950 | 57 | 300 | 0.4 | 0.1 | 2 | 16 | 96％ | 苗木平均抽长1.5cm |
| 2 | 825 | 633 | 85 | 300 | 0.4 | 0.1 | 2 | 16 | 96％ | 苗木平均抽长1.5cm |
| 3 | 825 | 950 | 70 | 200 | 0.4 | 0.1 | 2 | 17 | 95.5％ | 苗木平均抽长1.4cm |
| 4 | 750 | 800 | 57 | 250 | 0.4 | 0.1 | 2 | 16 | 96％ | 苗木平均抽长1.5cm |
| 5 | 680 | 633 | 57 | 200 | 0.4 | 0.1 | 2 | 17 | 95％ | 苗木平均抽长1.4cm |
| 6 | 825 | 950 | 85 | 300 | 0.4 | 0.1 | 2 | 18 | 95％ | 苗木平均抽长1.3cm |
| 7 | 680 | 800 | 85 | 200 | 0.4 | 0.1 | 2 | 16 | 96％ | 苗木平均抽长1.6cm |
| 8 | 680 | 800 | 85 | 200 | 0.4 | 0.3 | 4 | 17 | 82％ | 苗木平均抽长1.5cm |
| 9 | 680 | 800 | 85 | 200 | 0.6 | 0.5 | 4 | 18 | 85％ | 苗木平均抽长1.3cm |
| 10 | 680 | 800 | 85 | 200 | 0.8 | 0.5 | 2 | 18 | 80％ | 苗木平均抽长1.3cm |
| 11 | 680 | 800 | 85 | 200 | 0.8 | 0.5 | 6 | 22 | 85％ | 苗木平均抽长1.5cm |
| 12 | 680 | 800 | 85 | 200 | 0.6 | 0.3 | 4 | 18 | 96％ | 苗木平均抽长1.4cm |
Claims (8)
1.一种杉木组织培养生根方法，其特征在于：切取杉木增殖继代小苗，接种于杉木生根培养基进行组织培养生根：
所述杉木生根培养基由改良MS培养基、ABT1#0.4～0.8mg/L、IBA 0.1～0.5mg/L和根太阳稀释液2～6mL/L组成；
所述根太阳稀释液由根太阳原液兑水1∶100稀释制成；
所述改良MS培养基包含大量元素、有机物、微量元素、铁盐、白糖及活性炭：
所述大量元素由680～825mg/L NH4NO3、633～950mg/L KNO3、57～85mg/L KH2PO4、200～300mg/L无水CaCl2和185mg/L MgSO4·7H2O组成；
所述有机物由5mg/L盐酸硫铵素、1mg/L烟酸、1mg/L盐酸吡哆醇、100mg/L肌醇、5mg/L抗坏血酸和0.4mg/L生物素组成；
白糖的含量为15g/L；活性炭含量为0.05g/L；
所述微量元素和铁盐含量与传统MS培养基中微量元素和铁盐含量相同。
2.根据权利要求1所述的杉木组织培养生根方法，其特征在于：NH4NO3含量为680mg/L，KNO3含量为800mg/L，KH2PO4含量为85mg/L，无水CaCl2含量为200mg/L。
3.根据权利要求1所述的杉木组织培养生根方法，其特征在于：ABT1#含量为0.4mg/L，IBA含量为0.1mg/L，根太阳稀释液含量为2mL/L。
4.根据权利要求1所述的杉木组织培养生根方法，其特征在于：NH4NO3含量为680mg/L，KNO3含量为800mg/L，KH2PO4含量为85mg/L，无水CaCl2含量为200mg/L；ABT1#含量为0.4mg/L，IBA含量为0.1mg/L，根太阳稀释液含量为2mL/L。
5.根据权利要求1所述的杉木组织培养生根方法，其特征在于：所述微量元素和铁盐是：FeSO4·7H2O含量为27.8mg/L，Na2-EDTA含量为37.3mg/L，KI含量为0.83mg/L，H3BO3含量为6.2mg/L，MnSO4·4H2O含量为22.3mg/L，ZnSO4·7H2O含量为8.6mg/L，Na2MoO4·2H2O含量为0.25mg/L，CoCl2·6H2O含量为0.025mg/L，CuSO4·5H2O含量为0.025mg/L。
6.根据权利要求1所述的杉木组织培养生根方法，其特征在于：生根方式为皮部生根型。
7.根据权利要求1所述的杉木组织培养生根方法，其特征在于：所述杉木增殖继代小苗的切取长度为1.5cm。
8.根据权利要求1所述的杉木组织培养生根方法，其特征在于：所述组织培养生根是在温度25±2℃、光照强度控制在1500～3000Lux、环境湿度35～45％的培养条件下进行。
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| 吴擢溪，李振问，吴大忠.杉木组织培养繁殖体系建立的研究.《福建林学院学报》.1991,第11卷(第1期),67-74. * |
| 施季森,何祯祥,叶志宏,等.杉木无性系扦插生根能力遗传变异的研究.《南京林业大学学报(自然科学版)》.1993,第17卷(第4期),9-14. * |
| 欧阳磊,郑仁华,翁玉榛,陈孝丑,李林源,康月惠.杉木优良无性系组培快繁技术体系的建立.《南京林业大学学报(自然科学版)》.2007,第31卷(第3期),47-51. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101480166A (zh) | 2009-07-15 |
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