CN105532480A - 一种马铃薯花药诱导培养基及花培育种方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种马铃薯花药诱导培养基及花培育种方法，培养基由特定成分配比和含量比例的养分、活性炭、有机添加物、无机添加物、植物生长调节剂、凝固剂等所构成。花培育种方法包括：花药取材与预处理、培养基的灭菌、花药消毒与接种、花药变温诱导培养、愈伤分化与继代培养、炼苗与移栽。该培养基及花培育种方法特异性针对马铃薯花药培养的要求，花药诱导效率高，花培效果好，大大加快了马铃薯育种进程。

Description

一种马铃薯花药诱导培养基及花培育种方法
技术领域
本发明涉及一种马铃薯花药诱导培养基及花培育种方法，具体涉及一种特异性针对马铃薯花药培养要求的花药诱导效率高、花培效果好的马铃薯花药诱导培养基及花培育种方法，属于农业科学技术领域。
背景技术
马铃薯（Solanum tuberosum L.）又名土豆、山药蛋、洋芋、荷兰薯等，为茄科茄属多年生草本块茎植物，起源于南美西海岸的智利及秘鲁的安第斯山区，500年前引入欧洲，16世纪下半叶传入中国，在我国已有400年左右的栽培史。马铃薯性喜冷凉，生育期短，是一种粮菜饲兼用型作物。马铃薯具有丰产性好、适应性强、耐旱耐贫瘠、单位面积产量高、营养丰富且易消化吸收、用途广泛、开发利用价值较高的优点，在世界上广泛种植，并逐步成为人类粮食、蔬菜、饲料和工业原料的主要来源。世界上有155个国家和地区种植马铃薯，面积达2000多万hm2，现在已是世界上仅次于水稻、小麦和玉米的第四大粮食作物。我国马铃薯常年种植面积在530万hm2左右，鲜薯总产量约为5500万吨以上，是世界上第一大马铃薯生产国。
随着马铃薯加工业的迅速发展，对育种的要求越来越高，育种方向从高产、抗病逐渐转向优良性状加工性品质育种。长期以来马铃薯育种一直采用种间杂交为主，但由于马铃薯是同源四倍体作物，基因分离比二倍体复杂，且隐性基因表现频率低，花粉育性低，杂交结实难，实生籽培养困难，生育期长。另外我国从欧洲引入马铃薯栽培种育成的马铃薯品种都是用栽培品种做亲本，基因库非常狭窄，抗逆基因缺乏，基本处于近交水平，在品种培育上很难创新。马铃薯无性繁殖易导致病毒逐代积累，使得品性迅速退化。这些不利因素给马铃薯育种带来了极大的困难。
马铃薯家族中有74%的二倍体野生种和近缘栽培种，是抗病虫、耐寒耐热、高干物质、低还原糖含量等优良性状的重要基因库，但因与四倍体栽培种倍性不同、杂交不亲和，常规杂交育种方法不能直接利用，严重限制了野生种中优良基因在马铃薯育种中的应用。而利用组织培养技术进行马铃薯花药培养，产生的双单倍体可直接与野生种二倍体杂交，可以将丰富的野生资源库中有价值的性状基因转移到栽培种中，从而扩大遗传背景。马铃薯花药培养可以培养出双单倍体可直接与二倍体野生种杂交，将丰富的野生资源库中有价值的性状基因转移到栽培种中，可以有效解决基因分离复杂、花粉育性低、杂交结实难、实生籽培养困难，生育期长、基因库狭窄、抗逆基因缺乏等一系列的问题，也可以把获得的单倍体植株加倍成纯合体，这样既可从中选出具有优良性状的个体，直接繁育成新品种，也可选出具有单一优良性状的个体，作为杂交育种的原始材料。因此，开展马铃薯花培育种研究具有重要的理论与实践意义。
我国把花培育种与常规育种有机结合起来，已先后育成小麦、水稻、玉米、油菜等作物花培新品种。马铃薯花药培养研究始于80年代，我国学者在马铃薯花药培养方面进行了广泛的研究，取得了一些重要的理论与实践成果。华中农大、甘肃农大、中国农科院蔬菜花卉所等多家高校和科研机构先后开展了马铃薯花药培养研究，成功的将普通四倍体栽培种诱导成双单倍体植株，将双单倍体植株和二倍体野生种诱导成一单倍体植株也获得成功，获得了一批优良的马铃薯花培品系，并应用于马铃薯品种培育中。然而花培技术目前仍然未能广泛应用于马铃薯育种工作中，其主要原因在于马铃薯花培的诱导率、绿苗分化率还比较低，尚未建立起完善的、高频的花培再生体系，马铃薯花药培养技术体系仍是制约马铃薯单倍体育种的主要因素。
要将花培技术广泛应用于马铃薯育种，还需要进一步掌握花药培养的影响机理，提高培养效率。研究表明，培养基成分、培养条件、预处理条件、培养方式、接种时期、材料基因型等，均会对马铃薯愈伤组织的诱导产量和花粉植株的再生产生显著的影响。在花药程序中，愈伤组织的诱导培养是马铃薯花药培养过程的第一步，也是重点和难点，而花药愈伤组织诱导的频率和质量直接决定着花药培养的成败。因此，优化培养基和花培育种方法，摸索出高效的花药诱导培养基及高效的花培育种方法是建立高频马铃薯花药培养技术体系的关键。
通过多年马铃薯花药培养的摸索和实践，我们逐步优化基本培养基配方，并且不断加入一些提高马铃薯花药诱导力的添加物并组合其种类搭配及浓度比例，同时针对马铃薯花药培养的影响因素，如培养条件、预处理条件、培养方式、接种时期等，进行了大量的优化组合和研究试验，最终摸索出了一种马铃薯花药诱导培养基及适用于该培养基的花培育种方法。我们的研究结果对进一步推广和应用马铃薯花药培养育种和理论研究具有较大的理论与实践价值。
发明内容
为解决现有技术存在的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种马铃薯花药诱导培养基及花培育种方法。
本发明采用的技术方案如下：
一种马铃薯花药诱导培养基，其特征在于按每升蒸馏水中由以下物质配制而成：KNO31800～2000mg/L，NH4NO3 1600～1700mg/L，KH2PO4 650～750mg/L，MgSO4∙7H2O 350～400mg/L，CaCl2∙2H2O 400～480mg/L，Na2-EDTA∙2H2O 70～80mg/L，FeSO4∙7H2O 50～60mg/L，MnSO4∙4H2O 20～25mg/L，ZnSO4∙7H2O 8.0～9.0mg/L，H3BO3 11～13mg/L，KI 0.75～0.85mg/L，CuSO4∙5H2O 0.02～0.03mg/L，CoCl∙6H2O 0.02～0.03mg/L，NaMoO4∙2H2O 0.2～0.3mg/L，AgNO3 13～17mg/L，肌醇 230～270mg/L，维生素B1 0.45～0.55mg/L，维生素B6 0.45～0.55mg/L，维生素C 40～50μmol/L，烟酸 0.45～0.55mg/L，叶酸 0.25～0.35mg/L，甘氨酸1.8～2.2mg/L，脯氨酸 0.45～0.55mg/L，天冬氨酸 0.35～0.45g/L，丝氨酸 0.45～0.55mg/L，麦芽糖 35～45g/L，纤维二糖 25～35g/L，椰乳18～22g/L，植物凝胶 5.5～6.5g/L；NAA 0.45～0.55mg/L，KT 0.45～0.55mg/L，比久0.7～0.8mg/L，活性炭 0.35～0.45g/L，马铃薯提取液 45～55g/L，甘露醇35～45g/L，水解蛋白 0.7～0.8g/L。
所述的马铃薯花药诱导培养基，其特征在于按每升蒸馏水中含有以下物质配制的最佳含量为：KNO3 1900mg/L，NH4NO3 1650mg/L，KH2PO4 700mg/L，MgSO4∙7H2O 375mg/L，CaCl2∙2H2O 440mg/L，Na2-EDTA 75mg/L，FeSO4∙7H2O 55mg/L，MnSO4∙4H2O 22.5mg/L，ZnSO4∙7H2O8.5mg/L，H3BO3 12mg/L，KI 0.8mg/L，CuSO4∙5H2O 0.025mg/L，CoCl∙6H2O 0.025mg/L，NaMoO4∙2H2O 0.25mg/L，AgNO3 15mg/L，肌醇 250mg/L，维生素B1 0.5mg/L，维生素B6 0.5mg/L，维生素C 45μmol/L，烟酸 0.5mg/L，叶酸 0.3mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，脯氨酸 0.5mg/L，天冬氨酸 0.4g/L，丝氨酸 0.5mg/L，麦芽糖 40g/L，纤维二糖 30g/L，椰乳20g/L，植物凝胶 6.0g/L；NAA 0.5mg/L，KT 0.5mg/L，比久0.75mg/L，活性炭 0.4g/L，马铃薯提取液 50g/L，甘露醇40g/L，水解蛋白 0.75g/L。
所述的培养基配方的配制pH值为：5.6～6.0，最佳配制pH值为5.8。
一种马铃薯花培育种方法，其特征在于按如下步骤操作：
（1）花药取材与预处理
在马铃薯正常现蕾开花季节，上午取花蕾，用冰壶带回实验室，筛选出大小合适的花蕾，将花蕾包于双层湿纱布中，4℃低温预处理2d；
（2）培养基的灭菌
将权利要求1、2和3所述的培养基配制好后分装于100ml的三角瓶中，每瓶盛20ml～30ml的培养基，密封后置于温度为121℃、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，自然冷却凝固；
（3）花药消毒与接种
将花蕾用自来水冲洗10～20min，在超净工作台上，先用75%酒精消毒30s，再用0.1%升汞+2滴吐温-80消毒10min，无菌水冲洗3～4次后，置于己灭菌的纱布上，用镊子剥开花蕾，取出花药，选择小孢子处于单核晚期的花药作为接种外植体，接种到权利要求1、2和3所述的诱导培养基上；
（4）花药变温诱导培养
将接种花药后的培养基置于温度23～25℃的环境下暗培养2～3d，然后转入35℃高温、黑暗条件下热激处理2d，然后转入温度为23～25℃、湿度为65%～75%黑暗条件下诱导培养，诱导出花药愈伤；
（5）愈伤分化与继代培养
待愈伤长至直径1.5～2.0cm后，转接入分化培养基上进行分化培养，愈伤逐渐分化出绿苗，将苗长高于6cm的绿苗切段，转接入继代培养基上继代培养；
（6）炼苗与移栽
待试管苗长到3～5叶龄时，将三角瓶封口膜打开炼苗，6～10d后将试管苗从三角瓶中取出，将根部清洗干净，移栽入温室内，定期喷施营养液壮苗。
所述步骤（1）中大小合适的花蕾的筛选方法为：选择颜色为黄绿色、大多数花药与花蕾长度比为56%～64%的花蕾。
所述步骤（5）中分化培养的培养条件为：温度24～26℃、湿度为65%～75%、光照强度1500～2000lux、光周期14h光/10h暗；所述继代培养的培养条件为：温度27～29℃、湿度为75%～80%、光照强度2500～3000lux、光周期14h光/10h暗。
所述步骤（5）中继代培养基的配方为：MS基本培养基+0.1mg/LNAA+1.0mg/L多效唑。
本发明提供的马铃薯花药诱导培养基及花培育种方法特异性针对马铃薯花药培养的要求，花药诱导效率高，花培效果好，大大加快了马铃薯育种进程。下面的实施例以及对比实验可以清楚地反映本发明所述培养基的特点。
具体实施方式
实施例1
配制本发明所提供的培养基：
KNO3 1900mg/L，NH4NO3 1650mg/L，KH2PO4 700mg/L，MgSO4∙7H2O 375mg/L，CaCl2∙2H2O440mg/L，Na2-EDTA 75mg/L，FeSO4∙7H2O 55mg/L，MnSO4∙4H2O 22.5mg/L，ZnSO4∙7H2O 8.5mg/L，H3BO3 12mg/L，KI 0.8mg/L，CuSO4∙5H2O 0.025mg/L，CoCl∙6H2O 0.025mg/L，NaMoO4∙2H2O0.25mg/L，AgNO3 15mg/L，肌醇 250mg/L，维生素B1 0.5mg/L，维生素B6 0.5mg/L，维生素C45μmol/L，烟酸 0.5mg/L，叶酸 0.3mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，脯氨酸 0.5mg/L，天冬氨酸0.4g/L，丝氨酸 0.5mg/L，麦芽糖 40g/L，纤维二糖 30g/L，椰乳20g/L，植物凝胶 6.0g/L；NAA 0.5mg/L，KT 0.5mg/L，比久0.75mg/L，活性炭 0.4g/L，马铃薯提取液 50g/L，甘露醇40g/L，水解蛋白 0.75g/L。培养基的配制pH值为5.8。
将培养基配制好后分装于100ml的三角瓶中，每瓶盛20ml～30ml的培养基，密封后置于温度为121℃、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，自然冷却凝固，待用。
选择马铃薯品种永利早和玉岑洋芋作为花药培养供体，利用该马铃薯花培育种方法，按下述步骤进行：
将马铃薯品种永利早和玉岑洋芋于2015年春大田种植，于6月马铃薯正常现蕾开花季节晴天上午9：00～11：00取适期花蕾，用冰壶带回实验室，按照颜色为黄绿色、大多数花药与花蕾长度比为56%～64%的花蕾的选择标准筛选出大小合适的花蕾，将花蕾包于双层湿纱布中，4℃低温预处理2d。
将花蕾用自来水冲洗10～20min，在超净工作台上，先用75%酒精消毒30s，再用0.1%升汞+2滴吐温-80消毒10min，无菌水冲洗3～4次后，置于己灭菌的纱布上，用镊子剥开花蕾，取出花药，选择小孢子处于单核晚期的花药作为接种外植体，接种到待用的诱导培养基上。
将接种花药后的培养基置于温度23～25℃的环境下暗培养2～3d，然后转入35℃高温、黑暗条件下热激处理2d，然后转入温度为23～25℃、湿度为65%～75%黑暗条件下进行培养，诱导出花药愈伤，统计愈伤诱导率，愈伤诱导率=愈伤块数/接种花药数×100%。
待愈伤长至直径1.5～2.0cm后，转接入分化培养基上进行分化培养，分化培养的培养条件为：温度24～26℃、湿度为65%～75%、光照强度1500～2000lux、光周期14h光/10h暗，待愈伤逐渐分化出绿苗，统计愈伤绿化率，愈伤绿化率=绿化愈伤数/总接种愈伤数×100%。然后将苗长高于6cm的绿苗切段，转接入配方为：MS基本培养基+0.1mg/LNAA+1.0mg/L多效唑的继代培养基上继代培养，继代培养的培养条件为：温度27～29℃、湿度为75%～80%、光照强度2500～3000lux、光周期14h光/10h暗。
待试管苗长到3～5叶龄时，将三角瓶封口膜打开炼苗，6～10d后将试管苗从三角瓶中取出，将根部清洗干净，移栽入温室内，定期喷施营养液壮苗，半个月后统计继代后绿苗成活率，绿苗成活率=移栽成活苗数/继代绿苗数×100%。
数据调查：计算愈伤诱导率、愈伤绿化率和绿苗成活率，统计结果如下表1。
为了比较本发明所提供的马铃薯花药诱导培养基及花培育种方法与前人采用的马铃薯花药诱导培养基及花培育种方法的花培效果的差异，我们从相关文献查找了2个马铃薯花药诱导培养基配方，配制成花药愈伤诱导培养基，同样选取马铃薯品种永利早和玉岑洋芋作为花药供体进行花药培养，花培育种方法取材自相应参考文献，分化培养基与继代培养基、花培操作方法未特别阐明的，均同实施例1，分别计算马铃薯愈伤诱导率、愈伤绿化率和绿苗成活率，统计方法同实施例1。
实施例2
配制如下的马铃薯花药诱导培养基：
MS基本培养基+0.7%琼脂粉＋60g/L蔗糖+300mg/L水解酪蛋白+30mg/L硝酸银＋200mg/L活性炭＋0.5mg/LNAA+1.0mg/L2，4-D+0.5mg/LKT，pH为5.8（对比文件来自于梁彦涛等《马铃薯花药培养影响因素的研究》）。
花药培养方法与对比文件相同。
花药的采集和预处理：在马铃薯盛花期采集花蕾, 花蕾长度3～5mm，颜色淡绿色，将采集的花蕾放在4℃冰箱内预处理24h。选一枚花药经醋酸洋红染色后，在显微镜下观察其发育时期，选择小孢子处于单核靠边期的花药作为培养的外植体。
消毒和接种：将采集的花蕾用自来水冲洗10～20min，在超净工作台上，先后用70%的酒精灭菌30s，0.1%HgCl2浸泡15min，无菌水洗3～4遍，置于灭菌的纱布上用镊子剥开花蕾，取出花药，去除花丝，接种到愈伤组织诱导培养基上。在25℃条件下进行暗培养，对产生愈伤组织和胚状体的花药转入分化培养基，在1500lx光照、温度25℃条件下继续进行培养。
数据调查：计算愈伤诱导率和愈伤绿化率，统计结果如下表2。
实施例3
配制如下的马铃薯花药诱导培养基：
MS培养基＋60g/L蔗糖+0.5mg/LNAA+0.5mg/L2，4-D+0.5mg/LKT，pH为5.8（对比文件来自于王梓全等《马铃薯花药培养再生植株的诱导与鉴定》）。
花药培养方法与对比文件相同。
花药的采集和预处理：选取小孢子发育在单核靠边期至双核早期的花蕾，花蕾经低温4℃处理36h。
愈伤组织诱导与分化：在无菌条件下取出花药接种在马铃薯花药诱导培养基，培养温度25℃。30d后将愈伤组织转移到分化培养基上，培养温度25℃，光照强度2000lx，光周期为16h光照/ 8h黑暗，每隔20d继代1次。
移栽：选择根系发达、植株健壮的花药再生植株的试管苗，移栽到含有草炭土的营养钵中，小苗成活后将其移入网室。
数据调查：计算愈伤诱导率、愈伤绿化率和绿苗成活率，统计结果如下表3。
从不同的马铃薯花药诱导培养基及花培育种方法的花培效果来看，本发明马铃薯花药诱导培养基及花培育种方法对马铃薯品种永利早和玉岑洋芋的愈伤诱导率、愈伤绿化率和绿苗成活率均值分别为9.9%、5.6%和96%，显著高于对比文件的马铃薯花药诱导培养基及花培育种方法。本发明提供的马铃薯花药诱导培养基及花培育种方法具有明显优势，对马铃薯花药诱导效率高、花培效果好，可以大大加快马铃薯育种进程。
本领域技术人员可以根据本发明公开的内容和所掌握的本领域技术对本发明内容作出替换或变型，但是这些替换或变型都不应视为脱离本发明构思的，这些替换或变型均在本发明要求保护的权利范围内。

Claims (7)

1.一种马铃薯花药诱导培养基，其特征在于按每升蒸馏水中由以下物质配制而成：KNO31800～2000mg/L，NH4NO3 1600～1700mg/L，KH2PO4 650～750mg/L，MgSO4∙7H2O 350～400mg/L，CaCl2∙2H2O 400～480mg/L，Na2-EDTA∙2H2O 70～80mg/L，FeSO4∙7H2O 50～60mg/L，MnSO4∙4H2O 20～25mg/L，ZnSO4∙7H2O 8.0～9.0mg/L，H3BO3 11～13mg/L，KI 0.75～0.85mg/L，CuSO4∙5H2O 0.02～0.03mg/L，CoCl∙6H2O 0.02～0.03mg/L，NaMoO4∙2H2O 0.2～0.3mg/L，AgNO3 13～17mg/L，肌醇 230～270mg/L，维生素B1 0.45～0.55mg/L，维生素B6 0.45～0.55mg/L，维生素C 40～50μmol/L，烟酸 0.45～0.55mg/L，叶酸 0.25～0.35mg/L，甘氨酸1.8～2.2mg/L，脯氨酸 0.45～0.55mg/L，天冬氨酸 0.35～0.45g/L，丝氨酸 0.45～0.55mg/L，麦芽糖 35～45g/L，纤维二糖 25～35g/L，椰乳18～22g/L，植物凝胶 5.5～6.5g/L；NAA 0.45～0.55mg/L，KT 0.45～0.55mg/L，比久0.7～0.8mg/L，活性炭 0.35～0.45g/L，马铃薯提取液 45～55g/L，甘露醇35～45g/L，水解蛋白 0.7～0.8g/L。
2.根据权利要求 1 所述的马铃薯花药诱导培养基，其特征在于按每升蒸馏水中含有以下物质配制的最佳含量为：KNO3 1900mg/L，NH4NO3 1650mg/L，KH2PO4 700mg/L，MgSO4∙7H2O 375mg/L，CaCl2∙2H2O 440mg/L，Na2-EDTA 75mg/L，FeSO4∙7H2O 55mg/L，MnSO4∙4H2O22.5mg/L，ZnSO4∙7H2O 8.5mg/L，H3BO3 12mg/L，KI 0.8mg/L，CuSO4∙5H2O 0.025mg/L，CoCl∙6H2O 0.025mg/L，NaMoO4∙2H2O 0.25mg/L，AgNO3 15mg/L，肌醇 250mg/L，维生素B1 0.5mg/L，维生素B6 0.5mg/L，维生素C 45μmol/L，烟酸 0.5mg/L，叶酸 0.3mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，脯氨酸 0.5mg/L，天冬氨酸 0.4g/L，丝氨酸 0.5mg/L，麦芽糖 40g/L，纤维二糖 30g/L，椰乳20g/L，植物凝胶 6.0g/L；NAA 0.5mg/L，KT 0.5mg/L，比久0.75mg/L，活性炭 0.4g/L，马铃薯提取液 50g/L，甘露醇40g/L，水解蛋白 0.75g/L。
3.根据权利要求 1 和2所述的番茄花培育种诱导培养基，其特征在于：所述的培养基配方的配制pH值为：5.6～6.0，最佳配制pH值为5.8。
4.一种马铃薯花培育种方法，其特征在于按如下步骤操作：
（1）花药取材与预处理
在马铃薯正常现蕾开花季节，上午取花蕾，用冰壶带回实验室，筛选出大小合适的花蕾，将花蕾包于双层湿纱布中，4℃低温预处理2d；
（2）培养基的灭菌
将权利要求1、2和3所述的培养基配制好后分装于100ml的三角瓶中，每瓶盛20ml～30ml的培养基，密封后置于温度为121℃、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，自然冷却凝固；
（3）花药消毒与接种
将花蕾用自来水冲洗10～20min，在超净工作台上，先用75%酒精消毒30s，再用0.1%升汞+2滴吐温-80消毒10min，无菌水冲洗3～4次后，置于已灭菌的纱布上，用镊子剥开花蕾，取出花药，选择小孢子处于单核晚期的花药作为接种外植体，接种到权利要求1、2和3所述的诱导培养基上；
（4）花药变温诱导培养
将接种花药后的培养基置于温度23～25℃的环境下暗培养2～3d，然后转入35℃高温、黑暗条件下热激处理2d，然后转入温度为23～25℃、湿度为65%～75%黑暗条件下诱导培养，诱导出花药愈伤；
（5）愈伤分化与继代培养
待愈伤长至直径1.5～2.0cm后，转接入分化培养基上进行分化培养，愈伤逐渐分化出绿苗，将苗长高于6cm的绿苗切段，转接入继代培养基上继代培养；
（6）炼苗与移栽
待试管苗长到3～5叶龄时，将三角瓶封口膜打开炼苗，6～10d后将试管苗从三角瓶中取出，将根部清洗干净，移栽入温室内，定期喷施营养液壮苗。
5.根据权利要求 4所述的马铃薯花培育种方法，其特征在于：所述步骤（1）中大小合适的花蕾的筛选方法为：选择颜色为黄绿色、大多数花药与花蕾长度比为56%～64%的花蕾。
6.根据权利要求 4所述的马铃薯花培育种方法，其特征在于：所述步骤（5）中分化培养的培养条件为：温度24～26℃、湿度为65%～75%、光照强度1500～2000lux、光周期14h光/10h暗；所述继代培养的培养条件为：温度27～29℃、湿度为75%～80%、光照强度2500～3000lux、光周期14h光/10h暗。
7.根据权利要求 4所述的马铃薯花培育种方法，其特征在于：所述步骤（5）中继代培养基的配方为：MS基本培养基+0.1mg/LNAA+1.0mg/L多效唑。
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