KR101887221B1

KR101887221B1 - 기내배양에 의한 대나무 대량증식 방법

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Publication number: KR101887221B1
Application number: KR1020160104813A
Authority: KR
Inventors: 한장호; 윤웅한; 김태호; 강순자; 장영식; 김경란
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장); 담양군
Priority date: 2016-08-18
Filing date: 2016-08-18
Publication date: 2018-08-09
Anticipated expiration: 2036-08-18
Also published as: KR20180020475A

Abstract

본 발명은 기내배양에 의한 대나무 대량증식 방법 및 대나무 기내배양용 배지 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 온대지역에서 자라는 온대종 대나무의 신초를 이용한 대량증식 방법에 있어서, (a) 대나무의 가지에서 측아를 포함하는 마디 절편을 채취하여 멸균시키는 단계; (b) 상기 멸균한 마디 절편을 배양하여 신초를 발생시키는 단계; (c) 상기 발생한 신초를 계대배양하여 다발성 신초를 유도하는 단계; (d) 상기 유도된 다발성 신초를 배양하여 발근을 유도하는 단계; 및 (e) 상기 발근이 유도된 다발성 신초를 배양하여 뿌리와 줄기를 성장시켜 유식물체를 얻는 단계; (f) 상기 유식물체를 순화시킨 후 정상적인 대나무 식물체로 육성하는 단계를 포함하는 대나무 대량증식 방법 및 이에 의해 생산된 대나무 식물체에 관한 것이다. 상기 방법을 이용하면 기내배양을 통하여 짧은 기간에 동일한 대나무 개체를 대량으로 증식시키고 필요할 때마다 발근을 유도하여 정상적인 식물체를 얻을 수 있는 바, 대나무 대량증식에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

기내배양에 의한 대나무 대량증식 방법{Method of mass propagation of bamboo by in vitro culture}

본 발명은 기내배양에 의한 대나무 대량증식 방법 및 대나무 기내배양용 배지 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 온대지역에서 자라는 온대종 대나무의 신초를 이용한 대량증식 방법에 있어서, (a) 대나무의 가지에서 측아를 포함하는 마디 절편을 채취하여 멸균시키는 단계; (b) 상기 멸균한 마디 절편을 배양하여 신초를 발생시키는 단계; (c) 상기 발생한 신초를 계대배양하여 다발성 신초를 유도하는 단계; (d) 상기 유도된 다발성 신초를 배양하여 발근을 유도하는 단계; 및 (e) 상기 발근이 유도된 다발성 신초를 배양하여 뿌리와 줄기를 성장시켜 유식물체를 얻는 단계; (f) 상기 유식물체를 순화시킨 후 정상적인 대나무 식물체로 육성하는 단계를 포함하는 대나무 대량증식 방법 및 이에 의해 생산된 대나무 식물체에 관한 것이다.

대나무는 초본식물이면서 요즈음 빠르게 성장하고 있는 친환경 재생자원으로서 주목을 받고 있다. 대나무는 주로 아시아와 아프리카 및 중남미의 열대지역에서 온대지역 사이에 분포하고 있고, 세계적으로는 14백만 ha 면적에 90속 1,500종이, 우리나라에는 약 7,045ha 면적에 5속 19종 정도가 분포하고 있다 (비특허문헌 1). 대나무는 비교적 추위에 약하여 생육지역에 한계성을 가지고 있으나, 최근 지구온난화에 의한 연평균 기온상승으로 기존에 식재가 불가능한 지역에도 대나무 생육이 가능하여 조경수로서의 활용이 증가하고 있다.

또한, 대나무의 이산화탄소 흡수력은 소나무의 4배이며 피톤치드 발생량이 높아 환경대안 수종으로 주목받는 가운데, 원죽과 죽순 등 1차 산업과 대나무 가공품 등 2차 산업에 이어 관광산업 등 3차 산업까지 대나무 산업 활성화로 인한 산업적 가치가 높아지고 있다.

동양에서는 전통적으로 대나무가 4군자 중 하나로 덕과 학식을 갖춘 사람의 인품에 비유되어 이에 대한 인식이 좋으므로, 아직 관상용 분화 시장이 형성되지 않았지만 관상용 대나무가 기내 대량증식으로 상품화된다면 산업적 가치를 인정받아 새로운 소득원으로 자리매김 할 것으로 기대된다.

기존의 대나무의 번식은 종자 또는 영양번식에 의한 방법이다. 대부분의 대나무는 100년간 1∼3회 밖에 개화하지 않으며, 종자의 수명도 짧은 편이므로, 종자를 이용한 방법은 대량증식에 적합하지 않다. 영양번식은 식물체를 뿌리와 함께 채취하여 번식시켜야 하므로 수량적으로 한계가 있고 계절적인 제약이 따른다.

대나무 기내배양에 의한 번식방법은 짧은 기간에 계속적으로 재료를 얻을 수 있어 유리하고 조직배양으로 대량 증식이 가능한 장점이 있다. 그동안 40종 이상의 대나무 어린 개체나 성체 조직을 이용하여 조직배양에 의한 증식방법을 연구하였으나, 주로 열대지역 대나무종을 사용하였고, 대나무 종별로 조직배양 방법에 큰 차이를 보였으며, 분화 효율성도 낮은 편이었다 (비특허문헌 2).

대나무 성체 조직을 이용한 기내배양 증식방법은 주로 가지 마디의 측아를 를 발아시켜 나온 신초를 증식하는 방법이다. 이러한 신초 증식방법은 종자로부터 배(Embryo) 형성 캘러스를 유도하여 재분화시키는 방법에 비하여 증식 개체간의 변이가 적다. 그러나 성체에서 조직의 채취, 소독 및 신초증식 과정에 오염이 되기 쉽고, 증식효율이 불안정하다는 문제점이 있었다.

한편, 한국특허공개 제2011-0028796호는 직근 대나무의 재배방법으로서, 대나무의 선택단계; 대나무 삽수의 길이조절단계; 대나무 삽수의 침지단계; 대나무 삽수의 매립단계; 및 대나무 삽수의 각 마디에서 자라난 발근 부분을 이식하는 이식단계;를 포함하는 직근 대나무 대량 재배방법을 개시하고 있다 (특허문헌 1).

대한민국 공개특허공보 제2011-0028796호.

"한국의 대나무 식생현황과 산업화 전략", 담양군청, 제10차 세계대나무총회(WBC)_Korea, 2015. K.D. Mudori, Afr. J. Biotech. Vol.12(20), pp.2770-2785 (2013).

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 성숙한 온대종 대나무를 대상으로 성숙한 식물체의 가지에서 마디를 채취하여 측아의 발아력을 저하시키지 않으면서 배양 중에 오염되지 않도록 멸균하고, 기내배양으로 신초를 유도한 뒤 계속 증식과 유지가 가능한 다중 줄기조직으로 분화시켜 4주 이후 부터 동일한 개체 조직을 대량으로 증식이 가능하게 하였으며, 이러한 신초 분화조직을 발근배지로 옮겨 80% 이상의 고효율로 뿌리를 발생시키고 발근 개체의 순화 과정을 거쳐 정상적인 대나무 식물체로 증식할 수 있는 방법을 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 기내배양에 의한 대나무 대량증식 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 생산된 대나무 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 대나무의 신초 유도용 배지 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 대나무의 신초 증식용 배지 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 대나무의 발근 유도용 배지 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 대나무의 뿌리 성장 유도용 배지 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 구체예는 기내배양에 의한 대나무 대량증식 방법을 제공한다. 구체적으로 상기 기내배양에 의한 대나무 대량증식 방법은

(a) 대나무의 가지에서 측아를 포함하는 마디 절편을 채취하여 멸균시키는 단계;

(b) BAP (6-benzyloaminopurine), 수크로오스 및 젤라이트가 첨가된 MS 배지에서 상기 멸균한 마디 절편을 배양하여 신초를 발생시키는 단계;

(c) BAP, 수크로오스 및 젤라이트가 첨가된 MS 배지에서 상기 발생한 신초를 계대배양하여 다발성 신초를 유도하는 단계; 및

(d) BAP, NAA (naphthalene-acetic acid), 수크로오스 및 젤라이트가 첨가된 1/2 MS 배지에서 상기 유도된 다발성 신초를 배양하여 발근을 유도하는 단계;를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "기내배양(in vitro culture)"이란 체외배양이라고도 하며, 생물체에서 끄집어낸 물질을 체외에서 재현시키기 위한 실험실 내 배양을 의미한다. 일반적으로 식물체의 기내배양에 사용되는 식물 호르몬의 종류로는 BAP (6-benzyloaminopurine), 키네틴 (Kinetin, N-2-furanylmethyl-1H-purine-6-amine) 및 TDZ (Thiazuron-N-phenyl-N-1,2,3 thiadiazol-5ylurea)와 같은 사이토키닌(Cytokinins); IAA (Indole acetic acid), IBA (Indole butyric acid), NAA (Naphthalene-acetic acid) 및 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy-acetic acid)와 같은 옥신(Auxins); GA3와 같은 지베렐린(Gibberellins) 등이 있다. 식물 호르몬은 적용되는 조직의 종류에 따라 유효농도가 다르며, 합성된 장소 이외의 곳에 운반되어 동일한 기능을 나타낼지 여부가 불확실한 경우가 많다. 따라서, 목적에 따라 식물 호르몬의 종류 및 농도를 적절히 선택하는 것이 중요하며, 이는 실제 실험을 통하지 않고는 예측하여 선택하기가 어려울 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "대나무"는 외떡잎식물 벼목 화본(벼)과(Poaceae) 대나무아과(Bambusoidea)에 속하는 상록성 여러해살이 식물의 총칭이다. 대나무는 주로 아시아와 아프리카 및 중남미의 열대지역에서 온대지역 사이에 분포하고 있으며, 우리나라에는 전라남도 담양군, 경상남도 사천시 등에 분포하고 있다. 특히 우리나라에 분포하는 대나무는 해장죽속, 왕대속, 이대속, 조릿대속의 4속 14종류가 있다.

상기 (a) 단계에서 사용된 대나무는 온대지역에 분포하는 대나무일 수 있고, 예를 들어 포대죽(Phyllostachys aurea) 또는 금죽(Phyllostachys sulphurea)일 수 있으나, 이러한 특정 종류에 반드시 한정되는 것은 아니다.

상기 (a) 단계의 마디 절편은 측아 및 2~3차 가지를 포함하는 조직을 Y자 형태로 채취한 것일 수 있고, 구체적으로 1개 측아와 2차 측지를 포함한 2~5cm 조직을 Y자 형태로 채취한 것일 수 있다. 상기 "측아(lateral bud)"란 마디에서 형성된 싹의 총칭으로 액아(axillary bud) 또는 곁눈이라고도 한다. 상기 "측지(lateral branch)"란 옆으로 뻗어나온 가지를 의미한다. 상기 "2차 가지(2차 측지)"란 나무의 줄기에서 뻗어난 가지인 1차 가지에서 분지되어 자란 가지를 의미하고, 상기 "3차 가지(3차 측지)"란 2차 가지에서 분지되어 자란 가지를 의미한다. 1개 측아와 2~3차 측지를 포함하는 조직을 Y자 형태로 채취하여 사용하는 이유는, 측아를 Y자형 교차부위에 포함하도록 표본을 채취하면 소독 과정에서의 측아의 손상이 적어 신초 발생율이 높고, 배지에 치상할 때 감염을 최소화할 수 있기 때문이다.

상기 (a) 단계의 멸균은 살균제 용액, 70% 알콜, 50% 락스 등을 사용하여 수행할 수 있고, 구체적으로 살균제 용액에서 1~3시간 소독한 후에 70% 알콜에 1분~2분간 흔들어 소독한 후, 50% 락스에서 소독한 다음, 멸균수로 세척하는 것에 의하여 수행할 수 있고, 예를 들어 시중에서 판매하는 회전식 진탕기를 사용하여 살균제 용액에서 2시간 소독한 후에 70% 알코올에 1분간 흔들어 소독하고, 이후 진탕기를 사용하여 50% 락스에서 30분간 소독한 다음, 멸균수로 5~6회 세척할 수 있다. 상기 멸균 방법은 마디 절편의 조직 상태에 따라 적절히 조정하여 사용할 수 있으며, 예를 들어 채취된 마디 절편이 당해 연도에 발생하여 조직이 연한 경우, 살균제 용액에서 20분~시간 소독한 후에 70% 알콜에 1분간 흔들어 소독한 후, 10% 락스에 40분간 진탕하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기와 같이 조직 상태에 따라 소독 시간, 소독제 농도 등을 적절히 조정하면 소독 과정에서 일어날 수 있는 측아 발아력의 피해를 최소화할 수 있다.

상기 (a) 단계를 수행하여 멸균된 대나무의 마디 절편을 다음 단계에서 사용할 수 있다.

상기 (b) 단계의 "신초(shoot, new shoot)"란 새롭게 자라난 잎, 줄기 또는 가지를 의미할 수 있다.

상기 (b) 단계의 신초 발생에 사용되는 BAP 농도는 4~6 mg/L일 수 있고, 예를 들어 5 mg/L일 수 있다. 상기 범위를 벗어나는 농도를 사용할 경우 신초 발생이 적거나 기형적인 신초가 발생할 수 있다.

구체적으로, 상기 (b) 단계에서 4~6 ㎎/L BAP, 2~4% 수크로오스 및 3~5 g/L 젤라이트가 첨가된 MS 배지를 사용할 수 있고, 예를 들어 5 ㎎/L BAP, 3% 수크로오스 및 4 g/L 젤라이트가 첨가된 MS 배지를 사용할 수 있다.

상기 (b) 단계의 배양은 25~30℃ 온도에서 15~17시간 광조건 및 7~9시간 암조건하에 2~3주 동안 수행할 수 있고, 예를 들어 28℃ 온도에서 16시간 광조건 및 8시간 암조건하에 2~3주 동안 수행할 수 있다. 상기 온도 범위를 벗어나는 경우 정상적인 신초 발생이 낮아지거나, 캘러스화 가능성 등의 문제가 발생할 수 있다.

상기 (b) 단계의 배양은 멸균한 마디 절편을 배양 용기에 치상하여 배양할 수 있다.

상기 (b) 단계를 수행하여 (a) 단계의 마디 절편에서 신초가 발생할 수 있고, 구체적으로 상기 (b) 단계의 배양 시작 약 2주 후부터 마디부위 측아(곁눈)에서 신초가 발생할 수 있으며, 약 90% 이상의 마디에서 신초가 발생할 수 있다. 이때 배양 용기 내 조직의 오염상태를 관찰하여 일부 오염된 조직이 발견되면, 오염되지 않은 조직만을 신속히 새로운 배지로 옮겨주어야 한다. 발생한 신초의 잎이 2~3개가 전개되면 이를 분리하여 다음 단계에 사용할 수 있다.

상기 (c) 단계의 "다발성 신초(multiple shoots)"란 상기 (b) 단계의 신초로부터 여러 개의 줄기가 분화 발생하여 신초가 다발을 형성한 것을 의미한다.

상기 (c) 단계의 다발성 신초 유도에 사용되는 BAP 농도는 2~4 mg/L일 수 있고, 예를 들어 3 mg/L일 수 있다. 상기 범위를 벗어나는 농도를 사용할 경우 정상적인 신초 발생이 감소하는 문제가 발생할 수 있다.

구체적으로, 상기 (c) 단계에서 2~4 ㎎/L BAP, 2~4% 수크로오스 및 3~5 g/L 젤라이트가 첨가된 MS 배지를 사용할 수 있고, 예를 들어 3 mg/L BAP, 3% 수크로오스 및 4 g/L 젤라이트가 첨가된 MS 배지를 사용할 수 있다.

상기 (c) 단계의 "계대배양(subculture)"이란 세포 증식을 위해 새로운 배양 배지에 옮겨 세포의 대를 계속 이어서 배양하는 방법으로서, 이는 제한된 배양 배지 내에서 세포가 증식을 멈추게 되는 것을 막고 세포가 증식할 수 있도록 새로운 공간을 제공하는 것이다.

상기 (c) 단계에서 배지를 매 2~4주(예를 들어, 3주)마다 새로운 배지로 교체하여 계대배양을 수행할 수 있다.

상기 (c) 단계의 계대배양은 25~30℃ 온도에서 수행할 수 있고, 예를 들어 28℃에서 수행할 수 있다.

상기 (c) 단계를 수행하여 (b) 단계의 신초로부터 복수의 신초가 추가적으로 분화 발생하는 것에 의하여 다발성 신초가 유도될 수 있고, 구체적으로 배양 과정에서 5~6개 이상 분화된 다중 신초 다발을 2~3개 단위로 나누어 다시 치상하면, 줄기 조직이 계대할 때마다 배로 증가할 수 있다. 계대배양 중에 오염되거나 모 조직이 갈변하는 경우는 제거하고, 3회 이상 계대배양 후에도 다중 신초로 분화하지 않는 조직은 제거하는 것이 바람직하다. 채취된 부위에 따라 신초 유도 및 증식 효과가 다르게 나타날 수 있으므로, 왕성하게 증식하는 조직을 선발하여 주 배양 조직으로 확립할 수 있다. 상기 주 배양 조직을 발근 유도 배지로 옮겨 발근을 유도할 수 있다.

상기 (d) 단계의 발근 유도에 사용되는 BAP 농도는 0.5~1 mg/L일 수 있고, 예를 들어 0.5 mg/L일 수 있다. 상기 범위를 벗어나는 농도를 사용할 경우 뿌리 생장이 지체되거나 신초만 성장하는 문제가 발생할 수 있다.

상기 (d) 단계의 발근 유도에 사용되는 NAA 농도는 1~4 mg/L일 수 있고, 구체적으로 1~2 mg/L일 수 있다. NAA는 뿌리 분화에 주요 역할을 하지만, 농도가 높을수록 신초가 스트레스를 받아 갈변할 수 있으므로, 상기 범위에서 조정하는 것이 적절할 수 있다.

구체적으로, 상기 (d) 단계에서 0.5~1 mg/L BAP, 1~4 mg/L NAA, 1~2% 수크로오스 및 3~4 g/L 젤라이트가 첨가된 1/2 MS 배지를 사용할 수 있고, 예를 들어 0.5 mg/L BAP, 1mg/L NAA, 1.5% 수크로오스 및 4 g/L 젤라이트가 첨가된 1/2 MS 배지를 사용할 수 있다.

상기 (d) 단계에서 배양은 다발성 신초를 상기 배지에 치상하여 2~3주 동안 수행할 수 있다.

상기 (d) 단계를 수행하여 다발성 신초의 뿌리 분화를 유도할 수 있다. 이때 2~3개 다발 신초가 뿌리분화를 위해 적절할 수 있고, 그 이하 또는 이상의 다발을 갖는 신초는 뿌리 발생 효율이 낮을 수 있다. 뿌리가 3 mm 이상 신장되기 시작하면 발근 신초를 뿌리 성장 유도용 배지로 옮겨 뿌리와 줄기를 성장시킬 수 있다.

상기 구체예에 따른 대나무의 대량 증식 방법은 (e) BAP, NAA, 수크로오스 및 젤라이트가 첨가된 1/2 MS 배지에서 상기 발근이 유도된 신초를 배양하여 뿌리와 줄기를 성장시켜 유식물체를 얻는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 (e) 단계의 뿌리와 줄기 성장에 사용되는 BAP 농도는 0.5~1 mg/L일 수 있고, 예를 들어 1 mg/L BAP 일 수 있다. BAP 농도가 상기 범위보다 낮으면 줄기 성장이 더디고, 상기 범위보다 높으면 뿌리 성장이 지연되는 문제가 발생할 수 있으나, 이러한 반응은 품종에 따라 다를 수 있으므로 각각의 품종에 적절한 농도로 조절할 수 있다.

상기 (e) 단계의 뿌리와 줄기 성장에 사용되는 NAA 농도는 0.5~1 mg/L일 수 있고, 예를 들어 0.5 mg/L NAA일 수 있다. NAA 농도가 상기 범위보다 낮으면 뿌리 성장이 지체될 수 있고, 상기 범위보다 높으면 줄기 성장 과정에 스트레스가 증가하여 줄기 갈변화가 심해질 수 있으나, 이러한 반응은 품종에 따라 다를 수 있으므로 각각의 품종에 적절한 농도로 조절할 수 있다.

구체적으로, 상기 (e) 단계에서 0.5~1 mg/L BAP, 0.5~1 mg/L NAA, 1~2% 수크로오스 및 3~5 g/L 젤라이트가 첨가된 1/2 MS 배지를 사용할 수 있고, 예를 들어 1 mg/L BAP, 0.5 mg/L NAA, 1.5% 수크로오스 및 4 g/L 젤라이트가 첨가된 1/2 MS 배지를 사용할 수 있다.

상기 (e) 단계의 배양은 배지를 교체하지 않고 3~5주(예를 들어, 4주) 동안 수행할 수 있다.

상기 (e) 단계를 수행하여 발근이 유도된 신초의 뿌리와 줄기를 성장시킬 수 있다. 상기 (e) 단계에서 뿌리와 줄기의 성장이 계속되므로, 이를 충분히 수용할 수 있는 배양 용기를 사용하여야 한다. 여러 개의 뿌리가 3~4cm 이상 신장되고 잎과 줄기가 충분히 성장하여 유식물체의 모양을 갖추면, 이를 정상적인 식물체로 성장시키기 위하여 사용할 수 있다.

상기 구체예에 따른 대나무의 대량 증식 방법은, 상기 (e) 단계에서 얻은 유식물체를 순화시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 "순화(acclimation)"란 기내배양으로 분화 성장한 유식물체를 바로 외부 환경에서 재배하면 적응하지 못할 수 있기 때문에 일정기간 생육환경(온도, 습도, 광조건)을 점진적으로 조절하여 식물체를 적응시키는 과정을 의미한다.

상기 순화는 유식물체를 멸균수로 씻어 배지 성분을 제거하고, 유식물체를 멸균한 배양토(버미큘라이트)가 들어있는 포트에 옮기고, 비닐봉지를 씌워 80~90%의 습도와 28~32℃ 온도에서 2~5주(예를 들어, 4주) 동안 생육시키는 것에 의하여 수행할 수 있다. 상기 생육은 1/2 MS 배지를 사용하여 영양성분 및 수분을 보충함으로써 수행할 수 있다.

상기 순화한 식물체는 외부 환경인 온실로 옮겨 육성할 수 있다. 구체적으로, 식물체는 멸균 배양토를 채운 화분에 옮겨 그늘 조건에서 육성하다가, 식물체가 성장함에 따라 원예용상토를 채운 큰 화분으로 옮겨서 육성할 수 있다.

상기 구체예에 따른 대나무의 대량 증식 방법은, 보다 구체적으로

(b) 4~6 ㎎/L BAP, 2~4% 수크로오스 및 3~5 g/L 젤라이트가 첨가되고, pH 5.6~6.0으로 조절된 MS 배지에서 상기 멸균한 마디 절편을 배양하여 신초를 발생시키는 단계;

(c) 2~4 ㎎/L BAP, 2~4% 수크로오스 및 3~5 g/L 젤라이트가 첨가되고, pH 5.6~6.0으로 조절된 MS 배지에서 상기 발생한 신초를 계대배양하여 다발성 신초를 유도하는 단계;

(d) 0.5~1 mg/L BAP, 1~4 mg/L NAA, 1~2% 수크로오스 및 3~4 g/L 젤라이트가 첨가되고, pH 5.6~6.0으로 조절된 1/2 MS 배지에서 상기 유도된 다발성 신초를 배양하여 발근을 유도하는 단계; 및

(e) 0.5~1 mg/L BAP, 0.5~1 mg/L NAA, 1~2% 수크로오스 및 3~5 g/L 젤라이트가 첨가되고, pH 5.6~6.0으로 조절된 1/2 MS 배지에서 상기 발근이 유도된 다발성 신초를 배양하여 뿌리와 줄기를 성장시켜 유식물체를 얻는 단계;를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예는 상기 기내배양에 의한 대나무의 대량증식 방법에 의해 제조된 대나무를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 4~6 ㎎/L BAP, 2~4% 수크로오스 및 3~5 g/L 젤라이트가 첨가된 MS 배지를 유효성분으로 함유하며, pH가 5.6~6.0으로 조절된, 대나무의 신초 유도용 배지 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 2~4 ㎎/L BAP, 2~4% 수크로오스 및 3~5 g/L 젤라이트가 첨가된 MS 배지를 유효성분으로 함유하며, pH가 5.6~6.0으로 조절된, 대나무의 신초 증식용 배지 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 0.5~1 mg/L BAP, 1~4 mg/L NAA, 1~2% 수크로오스 및 3~4 g/L 젤라이트가 첨가된 1/2 MS 배지를 유효성분으로 함유하며, pH 5.6~6.0으로 조절된, 대나무의 발근 유도용 배지 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 0.5~1 mg/L BAP, 0.5~1 mg/L NAA, 1~2% 수크로오스 및 3~5 g/L 젤라이트가 첨가된 1/2 MS 배지를 유효성분으로 함유하며, pH 5.6~6.0으로 조절된, 대나무의 뿌리 성장 유도용 배지 조성물을 제공한다.

관상용 또는 정원수로 이용되는 대나무를 기존 영양번식으로는 대량 번식시키기에는 한계가 있었으나, 본 발명의 구체예들의 따른 방법을 이용하면 기내배양을 통하여 짧은 기간에 동일한 대나무 개체를 대량으로 증식시키고 필요할 때마다 발근을 유도하여 정상적인 식물체를 얻을 수 있다. 또한, 기내배양에 의해 정상적인 식물체를 얻는 데 소요되는 시간을 5∼6개월로 단축시킬 수 있는 바, 대나무 대량증식에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에서 기내배양의 재료로 사용된 포대죽과 금죽을 온실에서 재배하고 있는 사진이다.
도 2는 (A) 대나무 성체에서 측아 부위를 포함한 가지를 Y자형으로 마디 절편을 채취하여 멸균한 후 신초 유도배지에 치상한 모습; (B) 치상 후 2주 후에 측아에서 신초가 발아하여 자라난 모습이다.
도 3은 (A) 발아하여 2마디 이상 생장한 신초를 신초 증식배지에 옮긴 후 모습; (B) 신초가 생장하는 모습이다.
도 4는 신초를 매 3주마다 계대 배양하면서 (A) 계대배양 초기와, (B) 2차 계대배양 후 다중 신초 다발(다발성 신초)이 발생하는 모습을 나타내었다.
도 5 (A) 및 (B)는 다중 신초 다발(다발성 신초)을 2～3개의 신초 다발로 나누어 다시 계대배양한 모습이다.
도 6은 여러 개로 분화한 신초에 식물호르몬(NAA 0.5, 1, 2, 4, 6㎎/L)을 처리하면서 뿌리의 발근상태를 관찰한 모습이다: (A) 발근 초기모습, (B) 3주 후 유식물체로 발달한 모습.
도 7은 유식물로 발달한 식물체를 배양토(버미큘라이트)가 포함된 포트에 옮겨 순화시키는 과정을 나타낸다.
도 8은 순화시킨 식물체를 배양토를 채운 중간 화분에서 그늘 조건에서 육성하는 모습이다.
도 9 (A) 및 (B)는 원예용 상토를 채운 큰 화분에서 육성하는 대나무 식물체의 모습이다.

이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

실시예 1. 대나무 조직 채취 및 무균처리

온대종 대나무인 포대죽(Phyllostachys aurea ), 금죽(Phyllostachys sulphurea)을 준비하였다 (도 1). 포대죽과 금죽의 성체의 가지에서 1개 마디 측아와 2차 측지 마디를 포함한 2∼3㎝ 조직을 Y자 형태로 채취하였다 (도 2A). 이를 살균제 (제품명: 스포탁유제, 제조사: 한국삼공농약) 용액에 회전식 진탕기를 이용하여 2시간 소독한 후에 70% 알콜에 1분간 흔들어 소독하였다. 이후 다시 50% 락스에 30분간 진탕기에서 흔들어 소독한 뒤, 멸균수로 5∼6회 세척하였다. 당해 연도에 발생한 가지는 측아 발아 시험에서 피해가 발생하여 살균제에 2분간 진탕, 10% 락스에 40분간 소독으로 완화하였다. 위 방법으로 신초 발아율은 95% 이상이었으며, 치상 후 배지에서 오염은 최소화되었다.

실시예 2. 대나무 측아 유도 및 신초 증식

신초 유도배지는 MS (Murashige and Skoog Basal Medium) 기본배지에 3% 수크로오스(sucrose), 5㎎/L BAP, 4g/L 젤라이트(gellite)를 포함하고, 산도(pH) 5.8로 조정한 후, 멸균하여 사각 투명 배양플라스틱 용기에 부어 제조하였다 (표 1). 작성한 배지에 상기 실시예 1에서 멸균한 마디 조직을 배지에 세워서 치상하고, 배양은 일장 시간을 16/8시간(명/암)으로 조정하여 28℃에서 배양하였다. 배양 후 2주 후부터 마디 부위 측아에서 신초가 발생하였다 (도 2B). 식물의 조직 배양에 사용되는 식물 호르몬의 종류는 표 2에 나타내었으며, 본 발명의 실시예들에서는 이들 중 일부를 선택하여 사용하였다.

원 마디에서 발생한 신초의 잎이 2∼3개가 전개하면, 이를 분리하여 새로운 증식배지에 이식하고 매 3주 마다 새로운 증식배지에 계대 배양하여 하나의 신초에서 여러 개의 신초가 추가적으로 분화 발생하도록 유도하였다 (도 3). 증식배지의 조성은 MS 기본배지에 3% 수크로오스(sucrose), 3㎎/L BAP, 4g/L 젤라이트(gellite)에 산도(pH) 5.8로 조정하여 작성하였다. 계대배양 중에 조직이 오염되거나 갈변된 조직이 발견되면 수시로 제거하였다. 배양과정에서 5∼6개 이상 분화된 다중 신초다발은 2∼3개 단위로 나누어 다시 치상하는 것에 의하여 줄기조직은 계대할 때마다 배로 증가하였다 (도 4). 채취된 부위에 따라 신초 유도 및 증식 효과가 다르게 나타날 수 있으므로, 왕성하게 증식하는 조직을 선발하여 주 배양조직으로 확립하였다 (도 5).

실시예 3. 뿌리 발생 및 성장

상기 실시예 2에서 선발된 주 배양조직을 이용하여 뿌리 분화를 유도하였다. 구체적으로, 다중 신초가 왕성하게 발생하는 조직이 뿌리분화 능력도 우수하므로, 3∼4개 이상 줄기가 발생한 클러스터를 배양에 이용하였다. 뿌리 분화를 위한 배지 및 호르몬 조성은 다음과 같다. 1/2 MS 기본배지에 0.5㎎/L BAP, 1㎎/L NAA, 1.5% 수크로오스(sucrose), 4g/L 젤라이트(gellite)를 포함하고 산도(pH) 5.8로 조정하였다. 위 뿌리분화 배지에 신초 조직을 2주간 28℃에서 치상한 후 뿌리 발생을 관찰하였다 (도 6A). 뿌리가 3㎜ 이상 자라면 발근 조직을 뿌리/식물체 성장배지로 옮겨 3∼4주간 뿌리와 줄기를 충분히 성장시켜 유식물체의 모양을 갖추도록 하였다 (도 6B). 식물체 뿌리 성장배지의 조성은 1/2 MS 기본배지에 1㎎/L BAP, 0.5㎎/L NAA, 1.5% 수크로오스(sucrose), 4g/L 젤라이트(gellite), 산도(pH) 5.8이었다 (도 7).

실시예 4. 식물체 순화

뿌리가 발생한 배지에서 4주간 성장한 유식물은 온실로 옮기기전에 순화기간이 필요하다. 뿌리가 나온 유식물을 멸균수로 씻어 배지성분을 제거한 후 멸균한 배양토(버미큘라이트)가 든 포트에 옮기고 비닐봉지를 씌워 80∼90%의 습도와 30±2℃ 온도의 실내환경 조건에서 4주간 생육하면서 순화시켰다. 생육기간중에는 1/2 농도의 MS용액으로 영양성분을 분주하였다(도 7). 이후 실내에서 2∼3주간 충분히 순화한 식물체를 외부환경인 온실로 옮겼다. 이때 화분은 식물체 크기에 따라 처음에는 멸균한 배양토를 채운 중간화분에 옮겨 차광막을 친 그늘 조건에서 성장시키다가, 식물체가 커감에 따라 원예용 상토를 채운 큰 화분으로 옮겨서 육성하였다 (도 8 및 도 9).

실험예 1. 대나무 " 포대죽 " 기내배양시 신초의 발근 유도에 식물 호르몬 농도별 처리가 미치는 영향

상기 실시예 1 내지 2를 수행하여 얻은 포대죽 다발성 신초를 발근 유도배지에서 2주간 배양하였다. 구체적인 배지 조성 및 발근 유도 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 그 결과, 0.5~4 mg/L NAA 농도에서 농도가 증가할수록 발근율이 증가하였으나, 스트레스 정도도 함께 증가하였다. 그러나, 높은 농도인 6 mg/L NAA를 사용하였을 때는 오히려 발근율이 감소하였다. 따라서, 발근율이 우수하면서 식물체의 스트레스 정도가 심하지 않은 1~2 mg/L 농도의 NAA를 사용하는 것이 적절함을 확인할 수 있었다.

호르몬 종류¹ ⁾	농도 (mg/L)	발근개체수² ⁾ (개±SD)	발근율 (%)	스트레스 정도 (1-5)
NAA	0.5	17±0.5	53.1	+
	1	26±1.29	81.3	++
	2	30±0.58	93.8	+++
	4	31±0.5	96.8	++++
	6	24±0.82	75.0	++++

1) 기본배지조성 : 1/2 MS배지 + 0.5 mg/L BAP + 1.5% 수크로오스, pH 5.8;

2) 32개체 처리.

실험예 2. 대나무 " 금죽 " 기내배양시 신초의 발근 유도에 식물 호르몬 농도별 처리가 미치는 영향

상기 실시예 1 내지 2를 수행하여 얻은 금죽 다발성 신초를 발근 유도배지에서 2주간 배양하였다. 구체적인 배지 조성 및 발근 유도 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 그 결과, IBA를 사용하였을 때에는 발근율이 매우 낮고, 스트레스 정도가 심하여 적절하지 못하다는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 1~2 mg/L NAA를 사용하였을 때에는 발근율도 높고, 스트레스 정도가 심하지 않아 적절함을 확인할 수 있었다.

호르몬 종류¹ ⁾	농도 (mg/L)	발근개체수² ⁾ (개±SD)	발근율 (%)	스트레스 정도 (1-5)
NAA	1	9±0.95	56.3	++
NAA	2	12±0.82	75.0	+++
IBA	2	5±0.5	31.3	++++
IBA	4	6±0.58	37.5	++++

1) 기본배지조성 : 1/2 MS배지 + 0.5mg/L BAP + 1.5% 수크로오스, pH 5.8;

2) 16개체 처리.

온대지역에 분포하는 대나무종의 기내배양을 통하여 1년 이내의 단기간에 대량 증식시킴으로써 관상용 또는 분재소재로 활용 가능하거나 조경용에 필요한 대나무 개체를 용이하게 확보하고 상품화에 기여할 수 있으며, 자연 번식이 어려운 대나무종이나 희귀한 변이종을 기내배양을 통해 번식할 수 있으므로 유전자원의 보존에도 기여할 수 있다.

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(a) 대나무의 가지에서 측아를 포함하는 마디 절편을 채취하여 멸균시키는 단계;
(b) 4~6 ㎎/L BAP, 2~4% 수크로오스 및 3~5 g/L 젤라이트가 첨가되고, pH 5.6~6.0으로 조절된 MS 배지에서 상기 멸균한 마디 절편을 배양하여 신초를 발생시키는 단계;
(c) 2~4 ㎎/L BAP, 2~4% 수크로오스 및 3~5 g/L 젤라이트가 첨가되고, pH 5.6~6.0으로 조절된 MS 배지에서 상기 발생한 신초를 계대배양하여 다발성 신초를 유도하는 단계;
(d) 0.5~1 mg/L BAP, 1~4 mg/L NAA, 1~2% 수크로오스 및 3~4 g/L 젤라이트가 첨가되고, pH 5.6~6.0으로 조절된 1/2 MS 배지에서 상기 유도된 다발성 신초를 배양하여 발근을 유도하는 단계; 및
(e) 0.5~1 mg/L BAP, 0.5~1 mg/L NAA, 1~2% 수크로오스 및 3~5 g/L 젤라이트가 첨가되고, pH 5.6~6.0으로 조절된 1/2 MS 배지에서 상기 발근이 유도된 다발성 신초를 배양하여 뿌리와 줄기를 성장시켜 유식물체를 얻는 단계;를 포함하는 기내배양에 의한 대나무 대량증식 방법.
4~6 ㎎/L BAP, 2~4% 수크로오스 및 3~5 g/L 젤라이트가 첨가된 MS 배지를 유효성분으로 함유하며, pH가 5.6~6.0으로 조절된, 대나무의 신초 유도용 배지 조성물.
2~4 ㎎/L BAP, 2~4% 수크로오스 및 3~5 g/L 젤라이트가 첨가된 MS 배지를 유효성분으로 함유하며, pH가 5.6~6.0으로 조절된, 대나무의 신초 증식용 배지 조성물.
0.5~1 mg/L BAP, 1~4 mg/L NAA, 1~2% 수크로오스 및 3~4 g/L 젤라이트가 첨가된 1/2 MS 배지를 유효성분으로 함유하며, pH 5.6~6.0으로 조절된, 대나무의 발근 유도용 배지 조성물.
0.5~1 mg/L BAP, 0.5~1 mg/L NAA, 1~2% 수크로오스 및 3~5 g/L 젤라이트가 첨가된 1/2 MS 배지를 유효성분으로 함유하며, pH 5.6~6.0으로 조절된, 대나무의 뿌리 성장 유도용 배지 조성물.