CN102919127A

CN102919127A - 一种建立芦竹组培体系的方法

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Publication number: CN102919127A
Application number: CN2012104503918A
Authority: CN
Inventors: 杨志红; 周莉凡; 韩志萍
Original assignee: Huzhou University
Current assignee: Huzhou University
Priority date: 2012-11-12
Filing date: 2012-11-12
Publication date: 2013-02-13
Anticipated expiration: 2032-11-12
Also published as: CN102919127B

Abstract

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种建立芦竹组培体系的方法。该方法的步骤为：（1）外植体消毒，取芦竹的腋芽在75 %乙醇中完全浸没10秒后立即移入0.2 %的升汞溶液中10分钟；（2）初代培养，培养基为：MS中添加蔗糖30 g/L、琼脂8 g/L，再加入6-BA 5 mg/L 和 IBA 0.5 mg/L，最后调节pH至5.8；（3）继代培养，继代培养的培养基和培养条件与初代培养的培养基和培养条件相同；（4）壮芽及生根培养，芽在继代培养基中延长培养1个月完成壮芽，之后接种到生根培养基中，生根培养基为：MS中添加IBA 0.5 mg/L；（5）驯化移栽，用浮床驯化系统进行一周时间的驯化后移栽。该方法能实现芦竹的高效繁殖。

Description

一种建立芦竹组培体系的方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种建立芦竹组培体系的方法。

背景技术

植物组织培养是在细胞全能性理论基础上建立起来的一种技术。近年来，植物组织培养作为一种基本的试验技术和基础的研究手段，显示出巨大的应用潜力，被广泛应用于植物学、遗传学、育种学等各个领域。我国当前经济高速发展，在能源和污染方面面临着比较大的挑战。芦竹被认为是一种草本能源植物，兼具有污染修复特性。芦竹对Cu²⁺、pb²⁺、Cd²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Hg²⁺、Cr⁶⁺等重金属都具有一定的耐性,被用作修复镉汞等重金属污染湿地。研究表明芦竹修复体系对污染土壤中As，Cd，Pb和Zn有一定的稳定和去除作用。但是，包括芦竹在内的污染修复植物都存在一定的局限性。如何提高污染修复及利用效率是需要解决的一个关键问题。研究者采用改良剂等方法对 As, Cd, Pb污染土壤上芦竹生长及重金属吸收的相关性进行了研究，来提高芦竹污染修复性能。但是，效果有限。基因工程作为一种现代生物技术是改造芦竹成为一种超级污染修复和能源植物中的关键技术。其中，高效的组培体系是基因工程的必备条件。Miguel 2012年报道了芦竹组织培养的研究，但是在外植体取材及繁殖方式上，很难用作遗传转化。冉隆贤等 1998年也曾对芦竹组培进行了报道，但是在一个培养周期内，一个茎段只产生一个嫩芽。对于芦竹的研究和应用，迫切需要在外植体取材、高繁殖效率、高的移栽成活率等方面做深入研究，建立适合基因工程的组培体系。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，对芦竹组培过程中各个环节进行研究，拟建立一种芦竹组培体系的方法，实现芦竹的高效繁殖。

本发明解决所述技术问题的方案是：一种建立芦竹组培体系的方法，包括如下步骤，

（1）外植体消毒

取芦竹的腋芽作为外植体，移入超净台中，在75 %乙醇中完全浸没10秒后立即移入0.2 %的升汞溶液中10分钟，之后用无菌水冲洗；

（2）初代培养

在无菌条件下，剥取2～3毫米带顶端生长点的组织，插入培养基中，培养基为：MS中添加蔗糖30 g/L、琼脂8 g/L，再加入6-BA 5 mg/L 和 IBA 0.5 mg/L，最后调节pH至5.8；培养温度为：25 ±1 ℃ ，光照强度为：2500 Lx，光周期为：16小时光照8小时黑暗；

（3）继代培养

将初代培养得到的芽在无菌条件下剥取2～3 毫米带顶端生长点的组织，进行继代培养，1个月重复继代一次，继代培养的培养基和培养条件与初代培养的培养基和培养条件相同；

（4）壮芽及生根培养

将继代培养得到的芽在继代培养基中延长培养1个月完成壮芽，之后在无菌条件下将完成壮芽步骤的芽分成单个芽，切掉基部褐色组织，接种到生根培养基中，生根培养基为：MS中添加IBA 0.5 mg/L；

（5）驯化移栽

取出生根后的植株，将其转移到打孔泡沫板的孔中，打孔泡沫板漂浮于水面上，进行一周时间的驯化，驯化后移栽。

作为进一步的技术方案，所述步骤（1）中作为外植体的腋芽的高度为4～6毫米。

作为进一步的技术方案，所述步骤（1）中取芦竹的腋芽作为外植体的操作在7～9月进行。

作为再进一步的技术方案，所述步骤（5）中移栽的操作流程为：取底部有孔的盆，盆中装填草炭土，盆中种植植株后放置于水位高为3厘米的常温自来水中，使草炭土充分吸水后置于常温环境中，植株在盆中生长2个月后可再移栽于温室或大田。

本发明的有益效果有：

（1）本发明研究了芦竹腋芽的最佳消毒法，与其他植物相比，芦竹外植体消毒这一环节较为困难，很难达到理想的灭菌效果，采用本发明的技术方案，初代培养时芽的污染率在10%以下，死亡率在20%以下。

（2）本发明研究了芦竹腋芽在初代培养、继代培养过程中最佳激素组分及含量的配比，采用本发明的技术方案，腋芽分化的幼苗粗壮、生长快，每个芽初代培养可诱导5个芽以上，继代培养可诱导出15个芽以上。

（3）本发明研究了芦竹腋芽在生根培养过程中最佳激素组分及含量的配比，采用本发明的技术方案，生根率100%，经过一个月的生根培养，根的长度为4.0厘米以上。

（4）本发明在研究过程中还意外发现：7月、8月采样的芦竹腋芽在培养时的污染率为0 %， 9月采样的芦竹腋芽在培养时污染率在10 %以下，而其他月份采样的芦竹腋芽在培养时的污染率较高。申请人认为：产生这个现象的原因是7月、8月、9月的芦竹能迅速冒芽，幼嫩的外植体带菌较少，其污染率可通过消毒方式得到控制，而其他月份的采样的外植体带菌比较多，甚至细胞间隙也可能带菌，通过消毒方法很难取得理想的效果。

（5）本发明的驯化植株的方法为：取出生根后的植株，将其转移到打孔泡沫板的孔中，打孔泡沫板漂浮于水面上，进行一周时间的驯化。这种浮床驯化体系能加强植株适应外界环境的能力，使植株从培养时的高湿度环境到外界的低湿度环境、从培养时的无菌环境到外界的有菌环境的适应性得到了很好的驯化，保证了移栽成活率可以达到100%。而传统的方法是直接在原培养瓶或土壤中驯化，本发明的驯化方法与传统的驯化方法相比，移栽成活率有了很大的提高。

综上所述，本发明建立了一种能实现芦竹的高效繁殖的组培体系。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1：

一种建立芦竹组培体系的方法，包括如下步骤，

（1）外植体消毒。取芦竹的腋芽作为外植体，腋芽的高度为4～6毫米，取材时间为8月，用无菌水冲洗后放置于灭菌容器中，移入超净台中。在超净台，向容器中放入75 %酒精至完全浸没外植体，10秒后弃去酒精溶液，立即向外植体容器中加入0.2 %升汞溶液至全部浸没外植体，放置10分钟后用无菌水震荡冲洗外植体5次，每次一分钟。

（2）初代培养。在无菌条件下，剥取2～3毫米带顶端生长点的组织，插入培养基中，进行不定芽的诱导。培养基为：MS中添加蔗糖30 g/L、琼脂8 g/L，再加入6-BA 5 mg/L 和 IBA 0.5 mg/L，最后调节pH至5.8；培养温度为：25 ± 1 ℃ ，光照强度为：2500Lx，光周期为：16小时光照8小时黑暗。一周后观测、统计结果为：无细菌性水渍状污染和真菌性霉状污染，污染率为0%。一个月后观测、统计结果为：部分外植体褐变死亡，死亡率为9%，1个不定芽可平均诱导出6.4个芽。

（3）继代培养。将初代培养得到的芽在无菌条件下剥取2～3 毫米带顶端生长点的组织，进行不定芽的继代繁殖扩大培养，1个月重复继代一次，继代培养的培养基和培养条件与初代培养的培养基和培养条件相同；继代培养过程中，芽适应了组培环境，增殖速度加快。一个月后观测、统计结果为：平均每个芽可诱导出18个芽。

（4）壮芽及生根培养。将继代培养得到的芽在继代培养基中延长培养1个月完成壮芽，共培养2个月可达到壮芽要求，可获得芽平均高度4厘米以上壮芽。之后在无菌条件下将完成壮芽步骤的芽分成单个芽，用锋利的刀片在无菌条件下切掉基部褐色组织，保持切口平齐，接种到生根培养基中，生根培养基为：MS中添加IBA 0.5 mg/L。培养一个月后，根系长度平均可达4厘米以上。

（5）驯化移栽。驯化时，从培养瓶中小心取出生根后的植株，常温流水冲洗植株，去掉表面粘附的培养基。植株随后转移到一厘米左右厚度打孔泡沫板上，植株插入泡沫板孔中，根系在下浸没于水中，植株叶和芽在上，漂浮于水面上，进行一周时间的驯化，驯化水体采用自来水于常温下放置一天后使用。驯化后的植株已适应外部环境条件，可直接移栽。移栽时，取上沿直径10厘米、高10厘米、底部有孔的盆，盆中装填草炭土，草炭土装填高度为距盆的上沿一厘米。盆中种植植株后立即放置于水位高为3厘米的常温自来水中，使草炭土充分吸水后置于常温环境中，植株在盆中生长2个月后，测定地上部分鲜重和地下部分鲜重，结果为：地上部分鲜重平均为0.5306克，地下部分鲜重平均为0.2417克。之后植株可再移栽于温室或大田。采用上述方法，驯化移栽植株成活率可达100%成活。

实施例2：

一种建立芦竹组培体系的方法，包括如下步骤，

（1）外植体消毒。取芦竹的腋芽作为外植体，腋芽的高度为4～6毫米，取材时间为7月，用无菌水冲洗后放置于灭菌容器中，移入超净台中。在超净台，向容器中放入75 %酒精至完全浸没外植体，10秒后弃去酒精溶液，立即向外植体容器中加入0.2 %升汞溶液至全部浸没外植体，放置10分钟后用无菌水震荡冲洗外植体5次，每次一分钟。

（2）初代培养。在无菌条件下，剥取2～3毫米带顶端生长点的组织，插入培养基中，进行不定芽的诱导。培养基为：MS中添加蔗糖30 g/L、琼脂8 g/L，再加入6-BA 5 mg/L 和 IBA 0.5 mg/L，最后调节pH至5.8；培养温度为：25 ± 1 ℃ ，光照强度为：2500Lx，光周期为：16小时光照8小时黑暗。一周后观测、统计结果为：无细菌性水渍状污染和真菌性霉状污染，污染率为0%。一个月后观测、统计结果为：部分外植体褐变死亡，死亡率为18%，1个不定芽可平均诱导出5.1个芽。

（3）继代培养。将初代培养得到的芽在无菌条件下剥取2～3 毫米带顶端生长点的组织，进行不定芽的继代繁殖扩大培养，1个月重复继代一次，继代培养的培养基和培养条件与初代培养的培养基和培养条件相同；继代培养过程中，芽适应了组培环境，增殖速度加快。一个月后观测、统计结果为：平均每个芽可诱导出16个芽。

（4）壮芽及生根培养。将继代培养得到的芽在继代培养基中延长培养1个月完成壮芽，共培养2个月可达到壮芽要求，可获得芽平均高度4厘米以上壮芽。之后在无菌条件下将完成壮芽步骤的芽分成单个芽，用锋利的刀片在无菌条件下切掉基部褐色组织，保持切口平齐，接种到生根培养基中，生根培养基为：MS中添加IBA 0.5 mg/L，培养一个月后，根系长度平均可达4厘米以上。

（5）驯化移栽。驯化时，从培养瓶中小心取出生根后的植株，常温流水冲洗植株，去掉表面粘附的培养基。植株随后转移到一厘米左右厚度打孔泡沫板上，植株插入泡沫板孔中，根系在下浸没于水中，植株叶和芽在上，漂浮于水面上，进行一周时间的驯化，驯化水体采用自来水于常温下放置一天后使用。驯化后的植株已适应外部环境条件，可直接移栽。移栽时，取上沿直径10厘米、高10厘米、底部有孔的盆，盆中装填草炭土，草炭土装填高度为距盆的上沿一厘米。盆中种植植株后立即放置于水位高为3厘米的常温自来水中，使草炭土充分吸水后置于常温环境中，植株在盆中生长2个月后可再移栽于温室或大田。采用上述方法，驯化移栽植株成活率可达100%成活。

实施例3：

一种建立芦竹组培体系的方法，包括如下步骤，

（1）外植体消毒。取芦竹的腋芽作为外植体，腋芽的高度为4～6毫米，取材时间为9月，用无菌水冲洗后放置于灭菌容器中，移入超净台中。在超净台，向容器中放入75 %酒精至完全浸没外植体，10秒后弃去酒精溶液，立即向外植体容器中加入0.2 %升汞溶液至全部浸没外植体，放置10分钟后用无菌水震荡冲洗外植体5次，每次一分钟。

（2）初代培养。在无菌条件下，剥取2～3毫米带顶端生长点的组织，插入培养基中，进行不定芽的诱导。培养基为：MS中添加蔗糖30 g/L、琼脂8 g/L，再加入6-BA 5 mg/L 和 IBA 0.5 mg/L，最后调节pH至5.8；培养温度为：25 ± 1 ℃ ，光照强度为：2500Lx，光周期为：16小时光照8小时黑暗。一周后观测、统计结果为：部分外植体有细菌性水渍状污染和真菌性霉状污染，污染率为9%。一个月后观测、统计结果为：部分外植体褐变死亡，死亡率为16%，1个不定芽可平均诱导出5.0个芽。

（3）继代培养。将初代培养得到的芽在无菌条件下剥取2～3 毫米带顶端生长点的组织，进行不定芽的继代繁殖扩大培养，1个月重复继代一次，继代培养的培养基和培养条件与初代培养的培养基和培养条件相同；继代培养过程中，芽适应了组培环境，增殖速度加快。一个月后观测、统计结果为：平均每个芽可诱导出15个芽。

Claims

1.一种建立芦竹组培体系的方法，其特征在于：包括如下步骤，

（1）外植体消毒

（2）初代培养

（3）继代培养

（4）壮芽及生根培养

（5）驯化移栽

2.如权利要求1所述的一种建立芦竹组培体系的方法，其特征在于：所述步骤（1）中作为外植体的腋芽的高度为4～6毫米。

3.如权利要求1所述的一种建立芦竹组培体系的方法，其特征在于：所述步骤（1）中取芦竹的腋芽作为外植体的操作在7～9月进行。

4.如权利要求1所述的一种建立芦竹组培体系的方法，其特征在于：所述步骤（5）中移栽的操作流程为：取底部有孔的盆，盆中装填草炭土，盆中种植植株后放置于水位高为3厘米的常温自来水中，使草炭土充分吸水后置于常温环境中，植株在盆中生长2个月后可再移栽于温室或大田。