CN105494105B - 一种牡丹组织培养容器苗技术 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物组织培养领域，特别涉及一种牡丹组织培养容器苗方法。从健壮生长的牡丹‘凤丹’、‘明星’等的母株上采集无病虫害、健康饱满的鳞芽作为外植体，以一种环境友好的外植体表面消毒方法进行表面消毒，接种在一种特制的牡丹培养基上建立无菌培养体系；试管苗在增殖培养基上以每28天‑35天为一个继代周期进行继代扩繁；试管苗在培养瓶里的营养钵基质上诱导生根形成小植株容器苗；经过环境适应性驯化形成适应自然环境的组织培养容器苗，可随时随地换盆、移栽和出圃应用。本发明的主要特征在于：一种环境友好的牡丹外植体表面消毒方法；一种牡丹组织培养的基本培养基；一种牡丹容器苗的组织培养基和培养方法；为牡丹工厂化繁育优质种苗的关键技术。

Description

一种牡丹组织培养容器苗技术
技术领域
本发明属植物组织培养领域，涉及一种牡丹的组织培养繁殖方法。具体而言，本发明涉及一种从健壮生长的牡丹母株上采集无病虫害的健康饱满鳞芽作为外植体，以环境友好的表面消毒方法建立无菌培养体系；在一种WPL增值培养基上扩繁试管苗(不定芽)；在组织培养瓶里的营养钵生根基质中诱导试管苗生根形成组织培养容器苗，经环境适应性驯化(过渡和炼苗)过程，组织培养容器苗从适应植物组织培养室(简称“组培室”，下同)条件驯化成适应田间自然条件的容器苗。本发明克服了牡丹外植体表面消毒困难，组织培养材料容易褐化死亡，生根小植株移栽炼苗过程大量死亡，植株需在秋季移栽成活的季节限制，组织培养容器苗植株根系得到完整保护，随时随地换盆、移栽或出圃而不影响植株生存生长，成为牡丹优质种苗繁育生产的关键技术。
背景技术
牡丹属于芍药科(原毛莨科)芍药属牡丹组(Sect.Moutan DC.)植物，原产我国，是我国传统名花。一种牡丹，杨山牡丹变种‘凤丹’，学名为Paeonia ostii T.Hong etJ.X.Zhang var.lishizhenii B.A.Shen(Paeonia ostii‘Lishizhenii’)，抗逆性强，适应性广，从东北哈尔滨到西北甘肃、新疆；从南部福建到北部内蒙都有引种栽培。
牡丹的应用主要有3个方面，观赏和繁殖砧木(嫁接繁殖牡丹重瓣花观赏品种)；中药材(丹皮)栽培；牡丹籽油新资源食品(中华人民共和国卫生部公告2011年第9号)。其中，该牡丹籽油是在21世纪初发现，并迅速得到我国领导人和政府高度重视(习近平：“今天长了见识”，(http：//news.xinhuanet.com/politics/2013-11/27/c_118308353.htm)。我国食用油对外依赖度超过60％，牡丹籽油的发现和应用无疑有利于缓解我国食油窘境。国家林业局和国家农业综合开发办公室已将油用牡丹列为农业综合开发的名优经济林等示范项目，建设靓丽生态环境和发展林下特色经济(国家林业局计财司国家农业综合开发办公室关于印发《2016年农业综合开发林业项目申报指南》的通知，规山函【2015】242号)。
牡丹用于群体绿化美丽中国和油料生产亟需大量优质种苗。目前生产上繁殖牡丹种苗的方法主要有播种、嫁接、分株和吊包等方法，播种繁殖的实生苗存在两个严重问题，繁殖后代群体变异大，苗木质量难以保证；田间播种繁殖的植株大多数带有根结线虫病，容易导致病疫传播，严重制约产业发展和国内外交流。牡丹无性繁殖方式主要有嫁接、分株、吊包等，这些繁殖方式受到母株品质和繁殖材料数量和质量限制，主要用于观赏牡丹品种繁殖，且种苗大小、长势等参差不齐，难以标准化或量化生产。为解决这些问题，牡丹组织培养技术被业界认可。观赏牡丹品种组织培养技术的研究论文于1984年首次在《科学通报》上公开发表(李玉龙等，1984)，其后英国、法国、意大利等外国科学家先后开展牡丹组织培养研究，在外植体选择、无菌培养体系建立、试管苗(不定芽)扩繁、不定根发生、小植株移栽驯化等阶段都取得不同程度进展，国内外有相关报道和专利申报。而在一个实验室建立完整(五个阶段)组织培养体系和实用技术仍然是理论探索。
牡丹组织培养存在的主要问题是：(1)外植体(鳞芽)表面消毒困难，不得不用剧毒消毒剂氯化汞，其残留对环境、操作者和培养材料等会有影响；(2)不定芽在培养基上容易褐化以至死亡；(3)试管苗生根困难，移栽驯化难以成活。小植株(生根试管苗)从实验室环境过渡到适应田间环境的过程中容易死亡，导致牡丹组织培养不能用于生产。
牡丹播种育苗和种苗移栽受季节严重限制，必须在秋季进行，否则种子沉睡在土里不能萌芽生长，荒废土地资源至翌年春季；移栽必须在秋季否则大部分植株死亡，这也限制了牡丹产业发展。
本实验室根据植物细胞全能性原理(植物细胞具有形成完整植株的全部遗传信息，在适当条件下，一个细胞能够形成完整植株)，研究牡丹分子调控基础，克隆到‘凤丹’抗逆生长关键基因DREB、WRKY和XET(GenBank登陆序列号KT890350、KT890351和KT890352)，证实其具有环境抗逆适应性遗传基础；研究牡丹细胞全能性的实现条件，系统研究组织培养过程关键技术获得本发明成果。该成果提供一种环境友好的牡丹外植体表面消毒方法，克服剧毒消毒剂氯化汞等的残留缺陷；一种牡丹组织培养的培养基WPL，培养物叶片绿色正常，未现枯褐，试管苗(不定芽)正常生长分化；一种牡丹组织培养容器苗方法，在组织培养瓶中形成组织培养容器苗，在从组织培养条件过渡到田间自然条件过程中，小植株根系完整保护和成活，容器苗正常生长发育，克服移栽季节限制随时随地可移栽应用。
发明内容
根据植物组织培养的程序(五个阶段)，母株和外植体选择、无菌培养体系建立、不定芽扩繁、不定根发生、小植株移栽驯化等，解决牡丹组织培养技术关键。
本发明的要点之一，提供一种环境友好的牡丹外植体表面灭菌消毒方法。消毒液为20％-30％过氧化氢或40％乙氰尿酸钠或次氯酸钙5％-15％或次氯酸钠1％-5％(视消毒剂供应情况选用)与70％-80％乙醇水溶液的混合液，其比例为3∶1(v∶v，v为体积，下同)，每100ml消毒液中滴加吐温-20或吐温-800.4-1ml。外植体表面以刺激性小的婴儿浴皂液清洁，氯间二苯酚0.1-0.5％浓度预处理，水冲洗后直接用上述消毒液处理、水洗备用。其特征为不含剧毒品，对环境、操作者和培养物等较安全友好；消毒剂乙醇与过氧化氢或次氯酸钙或次氯酸钠混合进行外植体表面消毒，优化消毒程序，提高效率。
本发明的要点之二，提供一种牡丹组织培养基(WPL)。每升培养基水溶液中含有以下成分：(1)基本培养基(无机物)，NH4NO3含680-720mg，KH2PO4 136-170mg，KNO3 808-948mg，Ca(NO3)·7H2O 440-570mg，CaCl2·2H2O 404-516mg，MgSO4·7H2O 340-406mg，FeSO4·7H2O27.8mg，H3BO3 6.2-8mg，MnSO4·4H2O 22.3mg，ZnSO4·7H2O 8.6-12mg，CuSO4·5H2O0.025mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，KI 0.83mg，CoCl2·6H2O 0.025mg。(2)有机添加物，肌醇80-100mg、烟酸0.5-1mg、盐酸硫胺素0.5-1mg、盐酸吡哆醇0.1-0.5mg、甘氨酸2g、PVP0.5mg，核黄素20-30mg，AC 100-200mg。
WPL增值培养基每升水溶液中还含有：植物生长调节物质，生长素类的吲哚乙酸(IAA)或吲哚丁酸(IBA)或萘乙酸(NAA)0.05-0.1mg，细胞分裂素类的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.5-2mg；蔗糖20-25g，琼脂6-8g。
WPL培养基以HCl 1mol和NaOH 1mol水溶液调节pH值为6.3。
本发明的要点之三，提供一种牡丹组织培养容器苗培养基，其组成为：(1)混合基质，木炭(粒径≤5mm)或珍珠岩与泥炭的比例为2∶1(v∶v)，每升混合基质含活性炭1g；(2)营养液，每升营养液含1/3-1/2WPL，即WPL基本培养基与水的比例为1∶1-2(v∶v)；(3)植物生长调节物质，每升营养液含吲哚丁酸1-3mg。
本发明的要点之四，提供一种牡丹组织培养容器苗方法。包括3个连续阶段。
阶段1，牡丹无菌培养体系建立，选择健壮的植株，采集无病虫害的健康饱满鳞芽作为外植体。外植体预处理，以婴儿浴皂清洁表面，氯间二甲苯酚(商品名：滴露)35-50mg/L浸泡5-10min，自来水冲洗15-30min备用。外植体表面消毒，在无菌条件下，按上述要点一所述的方法处理外植体10-25min。无菌水冲洗3-4次，每次3min；鳞芽置于滤纸上沥干表面水分；用灭菌的镊子剥离鳞片，取腋芽接种在已灭菌(121℃，0，11MPa，15-20min)的WPL增值培养基上；在组培室(光照16h，36μmol/m2/s，黑暗8h，23-25℃，下同)培养。每天观察并剔除微生物污染的培养物，15天后无污染的材料，转移到新配制且灭菌的相同培养基上，在组培室培养，培养材料无污染即无菌培养体系已建立。
该方法与传统操作的细节不同，其特征在于外植体的清洁避免了刺激性强的洗衣粉等对材料的伤害，增加了滴露表面预消毒处理；乙醇作为外植体表皮毛伸展剂(使表皮毛直立起来)，便于消毒液紧密接触外植体表面，使去污染更彻底；消毒液为无汞环境友好试剂。
阶段2，牡丹试管苗扩繁，牡丹试管苗(不定芽)在WPL增殖培养基上在组培室培养。增殖培养基制备按上述要点之二进行，培养基、接种器材(医用镊子、剪刀、手术刀、滤纸、培养皿等)、洁净水等进行高温灭菌(121℃、0.11MPa、20min)并以灭菌指示剂(山东新华牌121℃压力蒸汽灭菌化学指示卡或3M指示胶带)监控灭菌质量(指示剂需变色正常，否则重新配制培养基和灭菌)。其特征在于：(1)试管苗在WPL培养基上叶片绿色正常，无枯褐现象；(2)WPL培养基中的植物生长调节剂，细胞分裂素浓度高于生长素浓度；(3)在组培室每培养28-35天，分化出新的试管苗，每培养周期增值试管苗2-5倍。
阶段3，牡丹容器苗培养与驯化。(1)无菌容器制备，上述发明要点之三的生根培养基混合基质装入微型营养钵(材质耐高温灭菌121℃，0.11兆帕，20min；大小约3-4.5cm×3-4.5cm，直径×高)，置入组织培养瓶(大小为可置入1个以上营养钵，7cm×10cm的培养瓶可置入2个营养钵)；在组织培养瓶内加入1/3-1/2WPL基本培养基无机物水溶液至混合基质湿润(约40ml)；高温灭菌(121℃，0.11MPa，20min)备用；(2)容器苗培养，在无菌条件下牡丹健壮试管苗(高≥1.5cm，直径≥2mm)扦插在营养钵基质中，在组培室培养至植株顶芽或腋芽有生长迹象即表明试管苗已生根形成组织培养容器苗。(3)容器苗驯化，将载有组织培养容器苗的培养瓶从组培室转移至有散射光(自然光不直射)的室内培养2天，逐渐打开培养瓶盖，依序打开1/4，2/4，3/4各培养两天到全打开培养5-7天；组织培养容器苗从培养瓶中取出并转移到温室(夏季适当遮阴)条件下养护，每7d喷施一次营养液，营养液每升含1/5-1/3WPL无机物，其余为水；其间喷施一次KH2PO4叶面肥，每升KH2PO4叶面肥含KH2PO42g，其余为水。小植株在该条件下养护至木质化即成为驯化组织培养容器苗，可适应田间自然环境生存生长，此时的容器苗即可按田间常规养护管理和随时随地按需要出圃。其特征在于：试管苗在组织培养瓶中形成容器苗；环境适应性驯化过程是将容器苗转移至不同的环境中养护，不发生移栽、断根、伤根或根系脱落等事件；最大限度保持小植株根系完整性，保证小植株驯化至适应田间环境而独立存活，生长发育，克服牡丹移栽的季节限制，随时随地可换盆、移栽或造林应用。
具体实施方式
实施例一
牡丹无菌培养体系的建立
牡丹‘凤丹’(Paenoia ostti T.Hong et J.X.Zhang var.Lishizhenii B.A.Shenin Acta Phytota.Sin.1997，35(4)：360-361)，‘明星’(Paenoia suffruticosa Andr.‘Mingxing’)，‘文公红’(Paenoia suffruticosa Andr.‘Wengonghong’)等，选择生长健壮的植株，在当年10月-翌年3月采集无病虫害的健康饱满鳞芽作为外植体，以柔软毛刷蘸婴儿浴皂水清洁表面，氯间二甲苯酚(商品名：滴露)水溶液(每升含氯间二甲苯酚35-50ml)浸泡5-10min(其间轻柔震荡)，流水冲洗20min，在无菌条件下加入28％过氧化氢与70％乙醇的混合液(3∶1，体积比)，滴入土温-80(每50ml混合液滴入0.2ml即1滴)，灭菌8-15min，无菌水冲洗3-4次，每次3min。鳞芽置于已灭菌的滤纸上沥干表面水分，以医用剪刀、镊子、解剖刀剥离鳞片，取出鳞片包裹的腋芽，切除形态学下端伤口表面部分，接种在预制的WPL增值培养基上(每升WPL基本培养基中加入植物生长调节剂IAA 0.05mg，细胞分裂素6-BA0.5mg，蔗糖20g，琼脂6.5g，pH以HCl和NaOH的1mol每升水溶液调至6.3，每只直径2.5cm的试管灌装10ml培养基)，在组培室(温度23-25℃，光照36μmol/m2/s，光暗节律为：光16h/d，暗8h/d)培养，每天检查并挑出被微生物污染的材料试管；10-15d后没被污染的培养物转移到新配制的WPL增值培养基上(配方和配制方法同上)，在组培室培养；顶芽或腋芽开绽生长且无微生物污染，无菌培养体系已建成。
实施例二
牡丹试管苗(不定芽)组织培养扩繁
优选的牡丹‘风丹’(Paeonia ostii T.Hong et J.X.Zhang var.lishizheniiB.A.Shen)、‘明星’(Paenoia suffruticosa Andr.‘Mingxing’)植株，在1月份采集健康饱满的鳞芽按实施例一所述方法建立无菌培养体系；腋芽在WPL增值培养基上(培养基配方和配制方法同上)，在组培室培养，组培室条件为温度23-25℃，光照36μmol/m2/s，日光照节律为16h/8h(光/暗)，醋酸纤维膜过滤空气通风。培养物在该条件下培养28天，每个培养物分化出不定芽2-5个。理论繁殖量根据计算公式y＝xn(y为繁殖量，x增值倍数，n年均增值次数＝365/28)，1个繁殖材料年产试管苗不低于8000株。
其特征WPL增值培养基每升含：(1)无机物，NH4NO3含680mg，KH2PO4 170mg，KNO3808mg，Ca(NO3)·7H2O 470mg，CaCl2·2H2O 440mg，MgSO4·7H2O 370mg，FeSO4·7H2O27.8mg，H3BO3 6.2mg，MnSO4·4H2O 22.3mg，ZnSO4·7H2O 8.6mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，KI 0.83mg，CoCl2·6H2O 0.025mg。(2)有机物，肌醇100mg、烟酸0.5mg、盐酸硫胺素1mg、盐酸吡哆醇0.5mg、甘氨酸2g、PVP 0.5-1mg，核黄素20-30mg，AC100-200mg，(3)植物生长调节剂细胞分裂素6-BA 0.3-2mg，生长素IAA 0.05-2.2mg；(4)蔗糖20-30g，(5)琼脂6-8g，pH 6.3。
实施例三
牡丹组织培养容器苗
牡丹‘风丹’(Paenoia ostti T.Hong et J.X.Zhang var.LishizheniiB.A.Shen)按上述实施例一和二获得试管苗。试管苗通过以下3个阶段培养成适应田间环境的组织培养容器苗。(1)容器苗培养，试管苗生根形成容器苗经过以下培养过程：生根混合基质[木炭(粒径≤5mm)或珍珠岩与泥炭(2∶1，v∶v)，活性炭1g/L]装入黑色聚乙烯营养钵(3-4.5cm×3-4.5cm，直径×高)，营养钵置入透明组织培养瓶(约7.5cm×10cm，直径×高)内；培养瓶内加入生根培养液40ml[每升含1/3-1/2WPL无机物，吲哚丁酸1-3mg，其余为水]；高温灭菌(温度121℃，压力0.11MPa，20min)备用。在无菌条件下将试管苗1株扦插到已灭菌处理的营养钵生根基质中；在组培室培养(温度23-25℃，光照36μmol/m2/s，16h/d，醋酸纤维膜过滤通风)约25天，植株顶芽萌动生长，随机抽样检查确认试管苗已生根形成容器苗。(2)容器苗过渡炼苗，将组织培养容器苗从组培室转移至散射光照射的室内培养2-3天，依次打开1/4，2/4，3/4培养瓶盖各培养2天，至全打开瓶盖培养5天；(3)容器苗驯化炼苗，将过渡锻炼的组织培养容器苗转移至温室条件下养护(夏季需要遮阴)，控制小植株容器内水分使之逐渐减低至田间正常持水量，每7天喷施一次1/5-1/5WPL无机盐水溶液，其间喷施一次2‰的KH2PO4水溶液。小植株培养25-30天已木质化，可适应田间自然环境独立存活生长；容器苗按正常田间日常管理养护，根据植株大小随时可更换较大营养钵，移栽到田间或出圃应用。
其特征在于试管苗(不定芽)在无菌条件下扦插生根形成无菌容器苗；试管苗不经过常规组织培养的移栽和缓苗过程，通过移动容器苗至不同环境下驯化小植株的环境适应性；克服了传统组织培养的小植株在移栽驯化过程中不可避免地断根、伤根和脱落导致植株死亡的缺陷，最大限度保持植株根系完整性，小植株从实验条件驯化到适应田间自然条件独立存活、生长发育；克服牡丹移栽的季节限制，随时随地根据生产需要移栽或造林；为广袤地区绿化美化和牡丹籽油原料生产提供组织培养优质种苗。

Claims (6)

1.一种牡丹“风丹(Paenoia ostii)”或“明星(Paenoia suffruticosa Andr.)”组织培养容器苗方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)选择母株外植体进行表面消毒；
b)试管苗(不定芽)增殖培养；
将表面消毒的外植体进行不定芽增殖培养，获得试管苗，其中所述增殖培养的培养基由WPL基本培养基、有机物和植物生长调节剂组成，滴加1M的HCl或NaOH水溶液调节培养基pH值至6.3；
其中：所述WPL基本培养基的组成为：每升培养基含NH4NO3 680-720mg，KH2PO4 136-170mg，KNO3 808-948mg，Ca(NO3)·7H2O 440-570mg，CaCl2·2H2O 404-516mg，MgSO4·7H2O340-406mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，H3BO3 6.2-8mg，MnSO4·4H2O 22.3mg，ZnSO4·7H2O 8.6-12mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，KI 0.83mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，其余为水；所述有机物的添加量为每升培养基含肌醇80-100mg、烟酸0.5-1mg、盐酸硫胺素0.5-1mg、盐酸吡哆醇0.1-0.5mg、甘氨酸2g、PVP 0.5mg，核黄素20-30mg，AC 100-200mg，蔗糖20-25g，琼脂6-8g；所述植物生长调节剂的用量为每升培养基含吲哚乙酸或吲哚丁酸0.05-3mg/L或萘乙酸0.05-0.1mg/L，细胞分裂素类的6-苄氨基腺嘌呤0-2mg/L；
c)牡丹组织培养小植株容器苗培养、驯化。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a)中所述外植体表面消毒按照如下方法进行：
a-1)配制消毒液
将20％-30％过氧化氢或次氯酸钙5％－15％或次氯酸钠1％－5％和70％-80％乙醇，按3:1(v:v，体积比)混合，然后每100ml混合液加入吐温20或吐温800.4-1ml；
a-2)外植体经表面清洁，预处理后直接用消毒液处理10-25min、无菌水洗、沥干，建立用于接种在培养基上的无菌培养体系。
3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤c)中所述牡丹组织培养小植株容器苗培养、驯化过程中生根培养的培养基由混合基质和生根营养液组成，其中所述混合基质由木炭或珍珠岩与泥炭、活性炭组成，其中所述木炭的粒径≤5mm，所述木炭或珍珠岩与泥炭的体积之比为2:1，每升混合基质中含活性炭1g；所述生根营养液为1/3-1/2WPL基本培养基+吲哚丁酸(IBA)1-3mg，其余为水。
4.一种牡丹“风丹(Paenoia ostii)”或“明星(Paenoia suffruticosa Andr.)”容器苗组织培养方法，其特征在于，包括3个组织培养连续阶段，
⑴牡丹无菌培养体系建立
外植体用氯间二苯酚预处理之后，将外植体用消毒液处理10-25min后，无菌水洗、沥干，进行表面消毒，接着将表面消毒后的外植体接种在WPL增殖培养基上，筛选获得无微生物污染的培养物，其中，所述消毒液按照如下方法配制：将20％-30％过氧化氢或次氯酸钙5％－15％或次氯酸钠1％－5％和70％-80％乙醇，按3:1(v:v，体积比)混合，然后每100ml混合液加入吐温20或吐温80 0.4-1ml；
⑵试管苗(不定芽)扩繁
无微生物污染的培养物在WPL增殖培养基上在组培室进行不受环境季节等影响的无菌继代培养，获得持续按几何指数扩大繁殖的试管苗，其中所述WPL增殖培养基每升含NH4NO3680mg，KH2PO4 170mg，KNO3 808mg，Ca(NO3)·7H2O 470mg，CaCl2·2H2O 440mg，MgSO4·7H2O 370mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，H3BO3 6.2mg，MnSO4·4H2O 22.3mg，ZnSO4·7H2O8.6mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，KI 0.83mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，肌醇100mg、烟酸0.5mg、盐酸硫胺素1mg、盐酸吡哆醇0.5mg、甘氨酸2g、PVP 0.5-1mg，核黄素20-30mg，AC 100-200mg，6－BA0.3-2mg，IAA0.05-2.2mg，20-30g，琼脂6-8g，其余为水，pH6.3；
⑶容器苗培养与驯化
首先将扩繁培养的试管苗在装有无菌营养钵基质的营养钵中，进行诱导生根培养，形成小植株容器苗；接着进行小植株容器苗驯化：只将容器苗转移至散射光、温室等环境下养护驯化至适应自然环境自立生活，生长发育。
5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述增殖培养基为WPL基本培养基+吲哚乙酸0.05mg/L+6-BA 0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L，pH以HCl或NaOH的1mol每升水溶液调节至6.3。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述诱导生根培养的培养基选择由混合基质和生根营养液组成，其中所述混合基质由木炭或珍珠岩与泥炭、活性炭组成，其中所述木炭的粒径≤5mm，所述木炭或珍珠岩与泥炭的体积之比为2:1，每升混合基质中含活性炭1g；所述生根营养液为1/3-1/2WPL基本培养基+吲哚丁酸(IBA)1-3mg，其余为水。
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