CN107484665A - 一种利用黑果枸杞休眠枝条成苗的方法 - Google Patents

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殷东生
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    • A01H4/008Methods for regeneration to complete plants

Abstract

本发明提供了一种利用黑果枸杞休眠枝条成苗的方法,将黑果枸杞休眠枝条的嫩芽经乙醇溶液涮洗、氯化汞溶液浸泡和无菌水冲洗后,得到外植体;将外植体置于初代培养基内进行初代培养,得到初代培养物;将初代培养物置于生根培养基内进行生根培养,得到黑果枸杞苗。采用本发明的方法,60d就可以得到黑果枸杞苗,而采用对比例的方法,需要90d才能够得到黑果枸杞苗,与对比例相比,本发明得到黑果枸杞苗的时间缩短了30d。

Description

一种利用黑果枸杞休眠枝条成苗的方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及植物组织培养技术领域,具体涉及一种利用黑果枸杞休眠枝条成苗的 方法。
背景技术
[0002]黑果枸杞,茄科、枸杞属多棘刺灌木,在我国宁夏贺兰山、青海东部、新疆北部、内 蒙古西部、陕西北部、甘肃和西藏等地皆有零星分布。它生长在人类无法生存的荒山野岭、 河床沙滩,拥有着极强的生命力。但随着人类对大自然的开发,黑果枸杞的生存空间愈来愈 少,造就了黑果枸杞这一珍稀珍贵的原生态高档滋补佳品。因黑果枸杞潜在的营养价值、药 用价值和商用价值,作为一种世界珍稀的、纯天然的、绿色的可食用浆果,具有极为广阔的 国内外1场,进一步扩大和开发黑果枸杞的产品具有十分广阔的前景。然而,由于无计划掠 夺式的采摘,致使黑果枸杞忍冬遭到严重破坏,自然修复能力降低,蕴藏量和可采量锐减。 [0003]因此为了满足需求,需要对黑果枸杞进行人工养殖。目前,黑果枸杞的育苗技术主 要有实生种子繁殖,由于种子育苗变异性很大,选育出的优良品种无法保持优良的特性,而 无性繁殖中的分株、压条、硬枝扦插、绿枝扦插等技术需要的原材料多,占地面积大,需要控 制的水份温度也有要求。在无性繁殖中组织培养技术被众多人员所利用,近几年来很多学 者研究了黑果枸杞的组培技术,通过“不定芽诱导-芽增殖-壮苗-生根”多个阶段实施,而且 每个步骤的培养基都不一致,因此导致每个阶段培养的时间不同,最终导致总培养时间长。
发明内容
[0004]有鉴于此,本发明的目的在于提供一种利用黑果枸杞休眠枝条成苗的方法,缩短 培养黑果枸杞苗的时间。
[0005]为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
[0006]本发明提供了一种利用黑果枸杞休眠枝条成苗的方法,包括以下步骤:
[0007] 1)将黑果枸杞休眠枝条的嫩芽经乙醇溶液涮洗、氯化汞溶液浸泡和无菌水冲洗 后,得到外植体;
[0008] 2)将所述步骤1)得到的外植体置于初代培养基内进行初代培养,得到初代培养 物;
[0009] 所述初代培养基以水为溶剂,包括以下浓度的组分:
[0010] NH4NO3 1600〜1700mg/L、KN03 1800〜2000mg/L、CaCl2 400〜480mg/L、MgS〇4 350 〜400mg/L、KH2P〇4 650〜750mg/L、KI 0.5〜l_Omg/L、H3B〇3 5〜8mg/L、MnS〇4 15〜25mg/L、 ZnS〇4 5〜10mg/L、NaMn〇4 0.1〜0_3mg/L、CuS〇4 0_01〜0.03mg/L、CoCl2 0.01〜0.03mg/L、 FeS(k 20〜35mg/L、Na2EDTA30〜45mg/L、肌醇80〜120mg/L、烟酸0 • 4〜0.6mg/L、盐酸卩比哆醇 0.4〜0_611^/1、盐酸硫胺素0.4〜0.611^几、甘氨酸1.5~2.511^/1^、6-节基氨基嘌呤0.3〜 0 • 8mg/L、a-萘乙酸0 • 1〜0.3mg/L、蔗糖250〜350g/L和琼脂5〜10g/L;所述初代培养基的PH 值为6〜7;
[0011] 3)将所述步1*2)中的初代培养物置于生根培养基内进行生根培养,得到黑果枸杞 苗;
[0012] 所述生根培养基以水为溶剂,包括以下浓度的组分:
[0013] NH4N〇3 1600〜1700mg/L、KN03 1800〜2000mg/L、CaCl2 400〜480mg/L、MgS〇4 350 〜400mg/L、KH2P〇4 650〜750mg/L、KI 0_5〜l_0mg/L、H3B03 5〜8mg/L、MnS〇4 15〜25mg/L、 ZnS〇4 5〜10mg/L、NaMn04 0.1〜〇_3mg/L、CuS〇4 0_01〜0.03mg/L、CoCl2 0.01〜0.03mg/L、 FeSCU 20〜35mg/L、Na2EDTA30〜45mg/L、肌醇80〜120mg/L、烟酸0.4〜0.6mg/L、盐酸吡哆醇 0 • 4〜0 • 6mg/L、盐酸硫胺素0 • 4〜0 • 6mg/L、甘氨酸 1 • 5〜2 • 5mg/L、a-萘乙酸〇. 1 〜〇. 3mg/L、 蔗糖250〜350g/L和琼脂5〜10g/L;所述生根培养基的pH值为6〜7。
[0014]优选的,所述步骤1)中嫩芽的长度为2〜3cm。
[0015]优选的,所述步骤2)中,所述初代培养的条件包括:所述初代培养的温度为25〜29 °C,所述初代培养的光照周期为12〜2〇h/d,所述初代培养的光照强度为1500〜25001UX,所 述初代培养的时间为25〜35d。
[0016]优选的,所述步骤3)中,所述生根培养的条件包括:所述生根培养的温度为为25〜 29°C,所述生根培养的光照周期为12〜20h/d,所述生根培养的光照强度为1500〜25001UX, 所述生根培养的时间为25〜35d。
[0017]优选的,所述步骤1)中,所述乙醇溶液的体积浓度为70〜75%,所述乙醇溶液涮洗 的时间为20〜40s。
[0018]优选的,所述步骤1)中,所述氯化汞溶液的质量浓度为0.05〜0.15%,所述氯化汞 溶液浸泡的时间为6〜8m i n。
[0019]优选的,所述步骤1)中无菌水冲洗的次数为4〜5次。
[0020] 优选的,所述步骤1)中黑果枸杞休眠枝条的长度为45〜55cm。
[0021]优选的,还包括:将所述步骤3)得到的黑果枸杞苗进行炼苗后移栽。
[0022]优选的,所述炼苗的条件包括:在自然光下炼苗5〜7天;
[0023] 所述移栽用的基质包括草炭土和河砂,所述草炭土和河砂的质量比为(1.5〜 2.5) : (0.5〜1.5)。
[0024]本发明提供的是一种利用黑果枸杞休眠枝条成苗的方法,将黑果枸杞休眠枝条的 嫩芽经乙醇溶液涮洗、氯化汞溶液浸泡和无菌水冲洗后,得到外植体;将外植体置于初代培 养基内进行初代培养,得到初代培养物;将初代培养物置于生根培养基内进行生根培养,得 到黑果枸杞苗。
[0025] 在本发明中,所述黑果枸杞休眠枝条的嫩芽经氯化汞溶液浸泡后,减少培养过程 中的污染率,再在初代培养基中培养,初代培养基中6-苄基氨基嘌呤和萘乙酸使嫩芽的 增殖倍数为5.9,再经过在生根培养基内培养,生根培养基中的a_萘乙酸使初代培养物的生 根率达到95%,主根的长度达到4〜5cm,有须根3〜4根,得到黑果枸杞苗。本发明提供的方 法以休眠枝条的嫩芽作为外植体,经过初代培养和生根培养,即可得到黑果枸杞苗,缩短了 培养时间。
[0026]本发明实施例的结果显示:采用本发明的方法,60d就可以得到黑果枸杞苗,而采 用对比例的方法,需要90d才能够得到黑果枸杞苗,与对比例相比,本发明得到黑果枸杞苗 的时间缩短了 30d。
具体实施方式
[0027]本发明提供了一种利用黑果枸杞休眠枝条成苗的方法,包括以下步骤:D将黑果 枸杞休眠枝条的嫩芽经乙醇溶液涮洗、氯化汞溶液浸泡和无菌水冲洗后,得到外植体;2)将 所述步骤1)得到的外植体置于初代培养基内进行初代培养,得到初代培养物;所述初代培 养基以水为溶剂,包括以下浓度的组分:NH4N〇3 1600〜1700mg/L、KN03 1800〜2000mg/L、 CaCl2 400〜480mg/L、MgS〇4 350〜400mg/L、KH2P〇4 650〜750mg/L、KI 0.5〜l_〇mg/L、H3B〇3 5〜8mg/L、MnS〇4 15〜25mg/L、ZnS〇4 5〜10mg/L、NaMn〇4 0_1〜0.3mg/L、CuS〇4 0.01〜 0 • 03mg/L、CoCl2 0 • 01 〜0 • 〇3mg/L、FeS〇4 20〜35mg/L、Na2EDTA30〜45mg/L、肌醇80〜 120mg/L、烟酸0 • 4〜0 • 6mg/L、盐酸吡哆醇0 • 4〜0 • 6mg/L、盐酸硫胺素0 • 4〜0 • 6mg/L、甘氨酸 1 • 5〜2 • 5mg/L、6-节基氨基噪呤0 • 3〜0 • 8mg/L、a-萘乙酸〇 • 1 〜〇 • 3mg/L、薦糖250〜350g/L 和琼脂5〜10g/L;所述初代培养基的pH值为6〜7;3)将所述步骤2)中的初代培养物置于生 根培养基内进行生根培养,得到黑果枸杞苗;所述生根培养基以水为溶剂,包括以下浓度的 组分:NH4NO3 1600〜1700mg/L、KN〇3 1800〜2000mg/L、CaCl2 400〜480mg/L、MgS〇4 350〜 400mg/L、KH2P〇4 650〜750mg/L、KI 0_5〜1.0mg/L、H3B〇3 5〜8mg/L、MnS〇4 15〜25mg/L、 ZnS〇4 5〜10mg/L、NaMn〇4 0_1〜0_3mg/L、CuS〇4 0.01〜0.03mg/L、CoCl2 0.01〜0.03mg/L、 FeS〇42 0〜35mg/L、Na2EDTA30〜45mg/L、肌醇80〜120mg/L、烟酸0_4〜0.6mg/L、盐酸卩比卩多醇 0 • 4〜0 • 6mg/L、盐酸硫胺素0 • 4〜0 • 6mg/L、甘氨酸 1 • 5〜2 • 5mg/L、a-萘乙酸〇. 1 〜〇 • 3mg/L、 蔗糖250〜350g/L和琼脂5〜10g/L;所述生根培养基的pH值为6〜7。
[0028]本发明将黑果枸杞休眠枝条的嫩芽经乙醇溶液涮洗、氯化汞溶液浸泡和无菌水冲 洗后,得到外植体。
[0029]在本发明中,所述黑果枸杞休眠枝条的长度优选为45〜55cm,更优选为48〜52cm, 最优选为50cm。在本发明中,所述枝条的长度在水培时既能够获得充足的营养,又不会使得 枝条烂掉萎蔫死亡。
[0030] 在本发明中,所述黑果枸杞休眠枝条的嫩芽的长度优选为2〜3an,更优选为2.2〜 2.8cm,最优选为2.5cm。
[0031] 在本发明中,所述黑果枸杞休眠枝条的嫩芽优选经过水培得到,所述水培的条件 优选包括:所述水培的温度优选为16〜24°C,更优选为18〜22°C,最优选为20°C。在本发明 中,所述黑果枸杞休眠枝条的采集方法优选为:从11月份至次年4月份,每个月采集带有饱 满休眠芽的枝条,喷水后用报纸或者牛皮纸包裹,用流水冲洗2h,洗去浮土,然后将枝条剪 成45〜55cm,放入水培罐中水培。
[0032] 在本发明中,所述乙醇溶液的体积浓度优选为70〜75%,更优选为72〜74% ;所述 乙醇溶液涮洗的时间优选为20〜40s,更优选为25〜35s,最优选为30s。在本发明中,所述乙 醇溶液作为表面消毒剂,对所述黑果枸杞休眠枝条的嫩芽进行表面消毒,杀死嫩芽表面的 微生物。
[0033] 在本发明中,所述氯化汞溶液的质量浓度优选为0 • 05〜0 • 15%,更优选为〇. 07〜 0• I2%,最优选为0• 1% ;所述氯化萊溶液浸泡的时间优选为6〜8min,更优选为7min。在本 发明中,所述氯化汞溶液作为消毒剂,对所述黑果枸杞休眠枝条的嫩芽进行消毒,杀死嫩芽 表面的微生物。
[0034]在本发明中,所述无菌水冲洗的次数优选为4〜5次。 t〇〇35]本发明将得到的外植体置于初代培养基内进行初代培养,得到初代培养物。
[0036] 在本发明中,所述初代培养基以水为溶剂,包括以下浓度的组分:NH4N03 1600〜 1700mg/L、KN03 1 800 〜2000mg/L、CaCl2 400〜480mg/L、MgS〇4 350〜400mg/L、KH2P〇4 650〜 750mg/L、KI 0_5〜1.0mg/L、H3B〇3 5〜8mg/L、MnS〇4 15〜25mg/L、ZnS〇4 5〜10mg/L、NaMn〇4 0.1〜0.3mg/L、CuS〇4 0_01〜0_03mg/L、CoCl2 0_01〜0_03mg/L、FeS〇4 20〜35mg/L、 NasEDTA 30 〜45mg/L、肌醇80 〜120mg/L、烟酸0.4〜0 • 6mg/L、盐酸吡哆醇0 • 4〜0 • 6mg/L、盐 酸硫胺素0.4〜0 • 6mg/L、甘氨酸1 • 5〜2.5mg/L、6-苄基氨基嘌呤0.3〜0.8mg/L、a-萘乙酸 0.1 〜0 • 3mg/L、蔗糖 250 〜350g/L 和琼脂 5 〜10g/L;优选包括:NH4N03 1620 〜1680mg/L、KN03 1850〜1950mg/L、CaCl2 420〜460mg/L、MgS〇4 360〜380mg/L、KH2P〇4 680〜720mg/L、KI 0.7〜0_9mg/L、H3B〇3 5.8〜7mg/L、MnS〇4 20〜23mg/L、ZnS〇4 7〜9mg/L、NaMn〇4 0.2〜 0.28mg/L、CuS〇4 0.015〜0.028mg/L、CoCl2 0.015〜0_028mg/L、FeS〇4 25〜30mg/L、 Na2EDTA35 〜40mg/L、肌醇 90 〜110mg/L、烟酸0 • 45 〜0 • 55mg/L、盐酸吡哆醇0.45 〜0.55mg/ L、盐酸硫胺素0 • 45〜0.55mg/L、甘氨酸1 • 8〜2.2mg/L、6-苄基氨基嘌呤0 • 4〜0.7mg/L、a-萘 乙酸0.15〜0.25mg/L、蔗糖280〜320g/L和琼脂6〜8g/L;更优选包括:NH4NO3 1650mg/L、 KNO3 1900mg/L、CaCl2 440mg/L、MgS04 370mg/L、KH2P〇4 700mg/L、KI 0.83mg/L、H3B03 6.2mg/L、MnS〇4 22.3mg/L、ZnS〇4 8.6mg/L、NaMn〇4 〇.25mg/L、CuS〇4 0.025mg/L、CoCl2 0 • 〇25mg/L、FeS04 27 • 8mg/L、Na2m)TA 37.3mg/L、肌醇 100mg/L、烟酸0 • 5mg/L、盐酸吡哆醇 0 • 5mg/L、盐酸硫胺素〇 • 5mg/L、甘氨酸2mg/L、6-苄基氨基嘌呤0.5mg/L、a-萘乙酸〇. 2mg/L、 蔗糖300g/L和琼脂7g/L。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定,采用本领域技术人员常 规选用的试剂即可。
[0037]在本发明中,所述初代培养基的pH值为6〜7,优选为6.2〜6.8,更优选为6.5。
[0038]在本发明中,所述外植体置于初代培养基内进行初代培养,所述初代培养的温度 优选为2f5〜29°C,更优选为26〜28°C,最优选为27°C ;所述初代培养的光照周期优选为12〜 2〇h/d,更优选为14〜18h/d,最优选为16h/d;所述初代培养的光照强度优选为1500〜 25〇01ux,更优选为1800〜22001ux,最优选为20001ux;所述初代培养的时间优选为25〜 35d,更优选为28〜32d,最优选为30d。
[OO39]本发明对所述外植体进行初代培养使用的仪器没有特殊限定,采用本领域技术人 员常规选用的即可,如培养瓶。
[0040]本发明将初代培养物置于生根培养基内进行生根培养,得到黑果枸杞苗。
[0041] 在本发明中,所述生根培养基以水为溶剂,包括以下浓度的组分:冊4冊3 1600〜 1700mg/L、KN03 1800〜2000mg/L、CaCl2 400〜480mg/L、MgS〇4 350〜400mg/L、KH2P〇4 650〜 750mg/L、KI 0.5〜l_0mg/L、H3B〇3 5〜8mg/L、MnS〇4 15〜25mg/L、ZnS〇4 5〜10mg/L、NaMn〇4 0.1〜0.3mg/L、CuS〇4 0.01〜0.03mg/L、CoCl2 0.01〜〇.〇3mg/L、FeS〇4 20〜35mg/L、 Na〗EDTA 30〜45mg/L、肌醇80〜120mg/L、烟酸0 • 4〜0 • 6mg/L、盐酸卩比卩多醇0 • 4〜0 • 6mg/L、盐 酉支硫胺素0 • 4〜0 • 6mg/L、甘氨酸1 • 5〜2.5mg/L、a-萘乙酸0 • 1〜0 • 3mg/L、鹿糖250〜350g/L 和琼脂5〜10g/L;优选包括:NH4NO3 1620〜1680mg/L、KN03 1850〜1950mg/L、CaCl2 420〜 460mg/L、MgS〇4 360〜380mg/L、KH2P〇4 680〜720mg/L、KI0.7〜0.9mg/L、H3B〇3 5.8〜7mg/L、 MnS〇4 20〜23mg/L、ZnS〇4 7〜9mg/L、NaMn04 0.2〜0.28mg/L、CuS〇4 0_015〜0.028mg/L、 CoCl2 0.015〜0.028mg/L、FeS〇4 25〜30mg/L、Na2EDTA35〜40mg/L、肌醇90〜110mg/L、烟酸 0.45〜0 • 55mg/L、盐酸吡哆醇0 • 45〜0.55mg/L、盐酸硫胺素0.45〜0 • 55mg/L、甘氨酸1.8〜 2.211^凡、(1-萘乙酸〇.15〜0.2511^几、蔗糖280〜32(^凡和琼脂6〜88凡;更优选包括:.4购3 1650mg/L、KN03 1900mg/L、CaCl2 440mg/L、MgS04 370mg/L、KH2P〇4 700mg/L、KI 0_83mg/L、 H3BO3 6_2mg/L、MnS〇4 22.3mg/L、ZnS〇4 8_6mg/L、NaMn〇4 〇.25mg/L、CuS〇4 0_025mg/L、 C0CI2 0.025mg/L、FeS〇4 27•8mg/L、Na2EDTA37•3mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0•5mg/L、盐酸吡 哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.5mg/L、甘氨酸2mg/L、a-萘乙酸0 • 2mg/L、蔗糖3〇Og/L和琼脂7g/ L。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定,采用本领域技术人员常规选用的试剂即可。 [0042] 在本发明中,所述生根培养基的pH值为6〜7,优选为6 • 2〜6 • 8,更优选为6 • 5。
[0043] 在本发明中,所述初代培养物置于生根培养基内进行生根培养,所述生根培养的 温度优选为25〜29°C,更优选为26〜28°C,最优选为27°C ;所述生根培养的光照周期优选为 12〜20h/d,更优选为14〜18h/d,最优选为16h/d;所述生根培养的光照强度优选为1500〜 25001ux,更优选为1800〜22001ux,最优选为20001ux;所述生根培养的时间优选为25〜 35d,更优选为28〜32d,最优选为30d。
[0044] 本发明对所述初代培养物进行生根培养使用的仪器没有特殊限定,采用本领域技 术人员常规选用的即可,如培养瓶。
[0045]得到黑果枸杞苗后,本发明优选将所述黑果枸杞苗进行炼苗后移栽。在本发明中, 所述炼苗在自然光条件下进行;所述炼苗的时间为5〜7。
[0046]在本发明中,所述移栽前,优选将所述炼苗后的黑果枸杞苗用清水洗去根部培养 基,用质量浓度为〇. 1 %的高锰酸钾溶液浸泡30〜60s,清水洗去残留在根部的高锰酸钾溶 液。
[0047] 在本发明中,所述移栽用基质优选包括草炭土和河砂;所述草炭土和河砂的质量 比优选为(1.5〜2.5) : (0.5〜1.5),更优选为(1.8〜2.2) : (0.8〜1.2),最优选为2:1;所述 草炭土和河砂经质量浓度为〇. 1 %的高锰酸钾溶液消毒后使用。
[0048] 在本发明中,所述移栽后,优选每天12h/d对黑果枸杞苗进行自然光照,定期浇施 营养液。在本发明中,所述营养液每隔7天浇施一次,所述营养以水为溶剂,优选包括以下浓 度的组分:顺41^〇3 400〜42511^几、刪〇3 450〜50〇11^几、〇&(312 100〜12〇11^几、1^8〇4 87.5〜 100mg/L、KH2P〇4 162.5〜187_5mg/L,更优选为NH4NO3 405〜415mg/L、KN〇3 460〜490mg/L、 CaCl2 105〜115mg/L、MgS〇4 90〜96mg/L、KH2P〇4 170〜180mg/L,最优选为NH4NO3 410mg/L、 KNO3 480mg/L、CaCl2 110mg/L、MgS〇4 94mg/L、KH2P〇4 175mg/L。本发明对上述试剂的来源没 有特殊限定,采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。
[0049]下面结合本发明的实施例,对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本 发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实 施例,都属于本发明保护的范围。
[0050] 实施例1
[0051]黑果枸杞休眠枝条的采集:从11月份至次年4月份,每个月采集带有饱满休眠芽的 枝条,喷水后用报纸包裹回实验室,用流水冲洗2h,洗去浮土,然后将枝条剪成50cm,放入水 培罐中水培,水培的温度为16°C,水培能够促进休眠芽的生长。
[0052]外植体的制备:水培使黑果枸杞休眠枝条的嫩芽长至2cm时,剪下,用体积浓度 75 %的乙醇溶液涮洗30s,移至质量浓度0 • 1 %的氯化汞溶液中浸泡6min,再无菌水冲洗4 次,得到外植体。
[0053]初代培养:将外植体置于初代培养基上进行初代培养,得到初代培养物;初代培养 的温度为27°C,初代培养的光照周期为l6h/d,初代培养的光照强度为20001ux,初代培养的 时间为30d;初代培养基以水为溶剂,包括以下浓度的组分:NH4N03 1650mg/L、KN03 1 900mg/ L、CaCl2 440mg/L、MgS〇4 37〇mg/L、KH2P〇4 7〇Omg/L、KI 0_83mg/L、H3B〇3 6.2mg/L、MnS〇4 22_3mg/L、ZnS〇4 8_6mg/L、NaMn〇4 0.25mg/L、CuS〇4 0.025mg/L、CoCl2 0.025mg/L、FeS〇4 27 • 8mg/L、NasEDTA37 • 3mg/L、肌醇 1 〇〇mg/L、烟酸0 • 5mg/L、盐酸吡哆醇〇 • 5mg/L、盐酸硫胺素 0 • 5mg/L、甘氨酸2mg/L、6-苄基氨基嘌呤0 • 5mg/L、a-萘乙酸〇. 2mg/L、蔗糖300g/L和琼脂7g/ L;初代培养基的pH值为6.5。
[OOM]生根培养:将初代培养物置于生根培养基上进行生根培养,得到黑果枸杞苗;生根 培养的温度为27°C,生根培养的光照周期为16h/d,生根培养的光照强度为20001uX,生根培 养的时间为30d;生根培养基以水为溶剂,包括以下浓度的组分:NH4NO3 165Omg/L、KN〇3 l9〇Omg/L、CaCl2 440mg/L、MgS〇4 370mg/L、KH2P〇4 7〇Omg/L、KI 0_83mg/L、H3B03 6.2mg/L、 MnS〇4 22.3mg/L、ZnS〇4 8.6mg/L、NaMn〇4 0.25mg/L、CuS04 0.025mg/L、CoCl2 0.025mg/L、 FeS〇4 27.8mg/L、Na2EDTA37 • 3mg/L、肌醇 100mg/L、烟酸0 • 5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸 硫胺素0.5mg/L、甘氨酸2mg/L、a-萘乙酸〇 • 2mg/L、蔗糖300g/L和琼脂7g/L;生根培养基的pH 值为6.5。
[0055]得到黑果枸杞苗后,打开培养瓶的瓶盖,使黑果枸杞苗在自然光下炼苗5d,将黑果 枸杞苗从培养瓶中取出,移栽至经消毒过的含有草炭土和河砂的基质中,草炭土的质量与 河砂的质量比为2:1,控制温度为25°C,每天12h/d的自然光照。移栽后半个月判断黑果枸杞 苗是否成活,移栽苗不萎蔫、长高、萌发新的绿叶。
[0056]采用0 • 1 %氯化汞溶液消毒6min,培养过程中的污染率为6• 7%,经30天初代培养 后,外植体的增殖倍数达到5 • 9,经3〇天生根培养后,初代培养物的生根率达到95%,主根长 5cm,有须根4根,将黑果枸杞苗移栽至基质中,黑果枸杞苗的成活率为92%。
[0057] 实施例2
[0058]黑果枸杞休眠枝条的采集:从11月份至次年4月份,每个月采集带有饱满休眠芽的 枝条,喷水后用报纸或者牛皮纸包裹回来,用流水冲洗2h,洗去浮土,然后将枝条剪成50cm, 放入水培罐中水培,水培的温度为24°C,水培能够促进嫩芽的生长。
[0059]外植体的制备:水培使黑果枸杞休眠枝条的嫩芽长至3cm时,剪下,用体积浓度 70 %的乙醇溶液涮洗30s,移至质量浓度〇 • 1 %的氯化汞溶液中浸泡8min,再无菌水冲洗5 次,得到外植体。
[0060]初代培养:将外植体置于初代培养基上进行初代培养,得到初代培养物;初代培养 的温度为27°C,初代培养的光照周期为l6h/d,初代培养的光照强度为20001UX,初代培养的 时间为30d;初代培养基以水为溶剂,包括以下浓度的组分:NH4N〇3 1650mg/L、KN〇3 1900mg/ L、CaCl2 440mg/L、MgS04 370mg/L、KH2P〇4 700mg/L、KI 0_83mg/L、H3B03 6.2mg/L、MnS04 22.3mg/L、ZnS〇4 8_6mg/L、NaMn04 0_25mg/L、CuS〇4 0_025mg/L、CoCl2 0.025mg/L、FeS〇4 27.8mg/L、Na2EDTA37 • 3mg/L、肌醇 1 OOmg/L、烟酸0 • 5mg/L、盐酸吡咳醇〇 • 5mg/L、盐酸硫胺素 0 • 5mg/L、甘氨酸2mg/L、6-苄基氨基嘌呤〇 • 5mg/L、a-萘乙酸〇 • 2mg/L、蔗糖300g/L和琼脂7g/ L;初代培养基的pH值为6.5。
[0061]生根培养:将初代培养物置于生根培养基上进行生根培养,得到黑果枸杞苗;生根 培养的温度为27°C,生根培养的光照周期为16h/d,生根培养的光照强度为20001UX,生根培 养的时间为30d;生根培养基以水为溶剂,包括以下浓度的组分:NH4NO3 1650mg/L、KN〇3 1900mg/L、CaCl2 440mg/L、MgS〇4 370mg/L、KH2P〇4 700mg/L、KI 0.83mg/L、H3B03 6.2mg/L、 MnS〇4 22.3mg/L、ZnS〇4 8.6mg/L、NaMn〇4 0.25mg/L、CuS〇4 0_025mg/L、CoCl2 0.025mg/L、 FeS〇4 27• 8mg/L、Na2EDTA37• 3mg/L、肌醇 100mg/L、烟酸0• 5mg/L、盐酸吡哆醇0• 5mg/L、盐酸 硫胺素〇. 5mg/L、甘氨酸2mg/L、a-萘乙酸〇. 2mg/L、蔗糖300g/L和琼脂7g/L;生根培养基的pH 值为6.5。
[0062]得到黑果枸杞苗后,打开培养瓶的瓶盖,使黑果枸杞苗在自然光照下炼苗7d,将黑 果枸杞苗从培养瓶中取出,移栽至经消毒过的含有草炭土和河砂的基质中,草炭土的质量 与河砂的质量比为2:1,控制温度为25°C,每天12h/d的自然光照。
[0063] 采用0.1%氯化汞溶液消毒8min,培养过程中的污染率为10%,经30天初代培养 后,外植体的增殖倍数达到5 • 9,经30天生根培养后,初代培养物的生根率达到95%,主根长 4cm,有须根3根,将黑果枸杞苗移栽至基质中,黑果枸杞苗的成活率为92%。
[0064] 对比例1
[0065]以李小艳等发表的《黑果枸杞的组织培养快速繁殖技术》(贵州农业科学2017,45 (6) : 12〜14)中繁殖黑果枸杞苗的方法为对比例。
[0066]为黑果枸杞野生种质资源的保存和优良株系的快速繁殖提供技术支持,以黑果枸 杞的带芽茎段为外植体,在MS、1/2MS培养基中添加不同种类和浓度的激素,进行组织培养 快速繁殖试验,研究黑果枸杞的组织培养快速繁殖技术。结果表明:MS+6-BA 1 .Omg/L+IBA 0.5!^/1+0.7%琼脂+3%蔗糖为最佳诱导芽分化的培养基,培养的时间为30心最适继代增 殖培养基为MS+0 • 7 %琼脂+3 %蔗糖,培养的时间为30d;生根培养基选用1/2MS+IBA0 • 3mg/L +0.7 %琼脂+3 %蔗糖,培养的时间为30d,移栽成活率为90%。
[0067]由此可以得出,采用本发明的方法,60d就可以得到黑果枸杞苗,而采用对比例的 方法,需要90d才能够得到黑果枸杞苗,与对比例相比,本发明得到黑果枸杞苗的时间缩短 了 30d。
[0068]以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人 员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若千改进和润饰,这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种利用黑果枸杞休眠枝条成苗的方法,包括以下步骤: 1) 将黑果枸杞休眠枝条的嫩芽经乙醇溶液涮洗、氯化汞溶液浸泡和无菌水冲洗后,得 到外植体; 2) 将所述步骤1)得到的外植体置于初代培养基内进行初代培养,得到初代培养物; 所述初代培养基以水为溶剂,包括以下浓度的组分: NH4NO3 1600〜1700mg/L、KN〇3 1800〜2000mg/L、CaCl2 400〜480mg/L、MgS〇4 350〜 400mg/L、KH2P〇4 650〜750mg/L、KI 0_5〜l_Omg/L、H3B〇3 5〜8mg/L、MnS〇4 15〜25mg/L、 ZnS〇4 5〜10mg/L、NaMn〇4 0_1〜0_3mg/L、CuS〇4 0_01〜0_03mg/L、CoCl2 0.01〜0_03mg/L、 FeS〇4 20〜35mg/L、Na2EDTA 30〜45mg/L、肌醇80〜120mg/L、烟酸0.4〜0.6mg/L、盐酸P比P多 醇0 • 4〜0.6mg/L、盐酸硫胺素0 • 4〜0.6mg/L、甘氨酸1.5〜2.5mg/L、6-节基氨基曙呤0 • 3〜 0.81^/1、〇-萘乙酸0.1〜0.311^凡、蔗糖250〜35(^几和琼脂5〜1(^几;所述初代培养基的邱 值为6〜7; 3) 将所述步骤2)得到的初代培养物置于生根培养基内进行生根培养,得到黑果枸杞 苗; 所述生根培养基以水为溶剂,包括以下浓度的组分: NH4NO3 1600〜1700mg/L、KN〇3 1800〜2000mg/L、CaCl2 400〜480mg/L、MgS〇4 350〜 400mg/L、KH2P〇4 650〜750mg/L、KI 0.5〜1.0mg/L、H3B〇3 5〜8mg/L、MnS〇4 15〜25mg/L、 ZnS〇4 5〜10mg/L、NaMn〇4 0.1〜0_3mg/L、CuS〇4 0.01〜0.03mg/L、CoCl2 0.01〜0.03mg/L、 FeSCk 2〇〜35mg/L、Na2EDTA 30〜45mg/L、肌醇8〇〜120mg/L、烟酸0.4〜0.6mg/L、盐酸卩比唆 醇0 • 4〜0 • 6mg/L、盐酸硫胺素0 • 4〜0.6mg/L、甘氨酸1 • 5〜2.5mg/L、a-萘乙酸〇 • 1〜〇 • 3mg/ L、蔗糖250〜350g/L和琼脂5〜10g/L;所述生根培养基的pH值为6〜7。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤1)嫩芽的长度为2〜3cm。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤2)中,所述初代培养的条件包括: 所述初代培养的温度为25〜29°C,所述初代培养的光照周期为12〜20h/d,所述初代培养的 光照强度为1500〜25001ux,所述初代培养的时间为25〜35d。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤3)中,所述生根培养的条件包括: 所述生根培养的温度为25〜29°C,所述生根培养的光照周期为12〜20h/d,所述生根培养的 光照强度为1500〜25001ux,所述生根培养的时间为25〜35d。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤1)中黑果枸杞休眠枝条的长度为 45〜55cm〇
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤1)中,所述乙醇溶液的体积浓度 为70〜75%,所述乙醇溶液涮洗的时间为20〜40s。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤1)中,所述氯化萊溶液的质量浓 度为0.05〜0.15%,所述氯化莱溶液浸泡的时间为6〜8min。
8. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤1)中无菌水冲洗的次数为4〜5 次。
9. 根据权利要求1〜8任意一项所述的方法,其特征在于,还包括:将所述步骤3)得到的 黑果枸杞苗进行炼苗后移栽。 1〇 •根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述炼苗的条件包括:在自然光下炼苗5 〜7天; 所述移栽用的基质包括草炭土和河砂,所述草炭土和河砂的质量比为(1.5〜2.5): (0.5〜1.5)〇
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