CN108849510A - 铁线莲品种‘Avant-Garde’组培苗瓶内生根方法 - Google Patents

铁线莲品种‘Avant-Garde’组培苗瓶内生根方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种铁线莲品种‘Avant‑Garde’组培苗瓶内生根方法，包括以下步骤：（1）选材及消毒处理；（2）试管苗培养；（3）生根培养；（4）组培苗移栽。本发明建立了有效的铁线莲组培苗瓶内生根技术，优化了其组培快繁体系。该技术经过组培瓶内生根程序，生根率为50%，提高了移栽成活率和移栽苗质量，移栽成活率大于90%，成苗一致性好，对于铁线莲组培产业化水平提升具有重要意义。

Description

铁线莲品种‘Avant-Garde’组培苗瓶内生根方法
技术领域
本发明涉及铁线莲的育苗方法，具体地说是涉及铁线莲品种‘Avant-Garde’组培苗快速瓶内生根的方法。
背景技术
铁线莲（Clematis florida Thunb.）是毛茛科（Ranunculaceae）、铁线莲属（Clematis L.）植物，多数为落叶或常绿草质藤本，有“藤本皇后”的美称。在我国主要分布于广西、广东、湖南、江西等地区。生于阳光充足、湿润、开阔的地方，喜肥沃、排水良好的碱性壤土。铁线莲的花期从早春到晚秋，果期夏季，花色艳丽、花形独特，具有较高的观赏价值。此外，铁线莲植物一直作为传统中药材使用，根和全株都可入药。
欧洲的铁线莲品种‘Avant-Garde’属于晚花大花型（Late Large-floweredGroup）类群，有很高的观赏价值和经济价值。花红色，大而漂亮。花朵星形，花瓣深粉红色，花朵中部为重瓣花，浅粉红色，花药黄色。‘Avant-Garde’的种子繁殖非常困难，只能采用无性繁殖手段，但是扦插繁殖的成活率较低，难以满足规模化生产的需要，采用组培技术可以有效地解决这些问题。
近年来，国内对铁线莲组培苗瓶内生根已有诸多报道，涉及铁线莲品种‘henryi’（浙江农业学报, 2011(4):731-735）、铁线莲品种‘Multi-Blue’（植物资源与环境学报,2010, 19(1):80-85）、铁线莲品种‘Gispy Queen’（亚热带植物科学, 2011, 40(2):69-69）等，但未见铁线莲品种‘Avant-Garde’瓶内生根技术的报道。
发明内容
发明目的：本发明提供了一种铁线莲组培苗瓶内生根方法，为铁线莲优良品种规模化快繁提供技术支撑。
技术方案：为实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种铁线莲品种‘Avant-Garde’组培苗瓶内生根的方法，包括以下步骤：
（1）选材及消毒处理：选取生长健壮、无病虫害的当年生铁线莲的嫩茎作为外植体，然后将所选取的外植体剪切成10 cm长的带芽茎段；
（2）将步骤（1）所选取的外植体用洗洁精消毒10分钟，再用1%的次氯酸钠消毒10分钟，最后用无菌水冲洗5次；
（3）将步骤（2）中消毒处理后的外植体剪去接触消毒液的伤口部位，留1~2 cm带芽茎段接种在含有诱导培养基的培养瓶中，在该培养基中可以获得健壮的增殖苗。一个周期20天的繁殖倍数为2.83倍，20天后长成6~8 cm的健壮无菌试管苗可进入下一步骤；
（4）将步骤（3）中长成的试管苗，剪切成长度为4~5 cm带有顶芽的茎段，转接到生根培养基中进行生根培养；培养20天长成6~8 cm高的无菌试管苗，进入下一步骤；
（5）将步骤（4）中株高达6~8 cm、根系发达且叶片展开的再生植株开瓶培养2天进行炼苗，取出试管苗，洗净，移栽到含有泥炭和黄心土的基质中，浇透水，用塑料薄膜覆盖容器口，保持温度25~28℃，相对湿度80%~85%，适当遮荫，培养20天至长出的新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，获得铁线莲幼苗。
以上步骤（2）~（4）消毒接种工作均在超净工作台中操作，试管苗的培养均在组织培养室内进行，其培养条件为：温度20±2 ℃，光照2000 Lx，光照时间16 h/d，相对湿度60%~65%。
所述方法的步骤（3）诱导培养基为WPM培养基+0.1 mg/L NAA + 1.0 mg/L 6-BA +30g/L蔗糖+ 6.3 g/L卡拉胶，pH值为5.7~5.8。
所述方法的步骤（4）生根培养基为1/2 WPM培养基+ 0.15 mg/L NAA + 0.2 mg/LIBA + 30 g/L 蔗糖+ 6.3 g/L 卡拉胶，pH值为5.7~5.8。
所述方法的步骤（5）移栽基质的配方为泥炭：珍珠岩，体积比为3:1。
进一步，所述的WPM培养基即木本植物组织培养基的具体配方如下：
硝酸铵NH4NO3 400 mg/L
硝酸钙 Ca(NO3)2·4H2O 556 mg/L
氯化钙CaCl2·2H2O 96 mg/L
硫酸镁MgSO4·7H2O 370 mg/L
磷酸二氢钾 KH2PO4 170 mg/L
硫酸钾K2SO4 990 mg/L
乙二胺四乙酸二钠Na2·EDTA 37.3 mg/L
硫酸亚铁FeSO4·7H2O 27.8 mg/L
硫酸锰MnSO4·H2O 22.3 mg/L
硫酸锌ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L
硼酸H3BO3 6.2 mg/L
钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L
硫酸铜CuSO4·5H2O 0.025 mg/L
氯化钴 CoCl2.6 H2O 2 0.025 mg/L
肌醇C6H12O6·2H2O 100 mg/L
甘氨酸 NH2·CH2·COOH 2 mg/L
盐酸硫胺素C12H17ClOS·2HCl 1 mg/L
盐酸吡哆醇C8H10NO5P 0.5 mg/L
烟酸NC5H4COOH 0.5 mg/L
1/2WPM培养基的具体配方如下：
硝酸铵NH4NO3 200 mg/L
硝酸钙 Ca(NO3)2·4H2O 278 mg/L
氯化钙CaCl2·2H2O 48 mg/L
硫酸镁MgSO4·7H2O 185 mg/L
磷酸二氢钾 KH2PO4 85 mg/L
硫酸钾K2SO4 495 mg/L
乙二胺四乙酸二钠Na2·EDTA 37.3 mg/L
硫酸亚铁FeSO4·7H2O 27.8 mg/L
硫酸锰MnSO4·H2O 22.3 mg/L
硫酸锌ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L
硼酸H3BO3 6.2 mg/L
钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L
硫酸铜CuSO4·5H2O 0.025 mg/L
氯化钴 CoCl2.6 H2O 2 0.025 mg/L
肌醇C6H12O6·2H2O 100 mg/L
甘氨酸 NH2·CH2·COOH 2 mg/L
盐酸硫胺素C12H17ClOS·2HCl 1 mg/L
盐酸吡哆醇C8H10NO5P 0.5 mg/L
烟酸NC5H4COOH 0.5 mg/L。
本发明专利结合多年的研究和生产经验，总结了铁线莲组培苗瓶内生根技术，该技术能够提高组培苗的移栽成活率和成苗质量，对铁线莲组培快繁体系的优化具有重要技术意义。
本发明的有益效果是：
本发明为铁线莲品种‘Avant-Garde’组培苗快速瓶内生根提供了一种可参照的技术和方法，具有以下优点：
1、便于良种保存及开展遗传改良研究：与扦插繁殖相比，本发明方法节约占地空间，繁殖时间不受季节限制，取材对母体伤害小，继代周期短，无病虫害困扰，更加适合用于铁线莲品种保存以及快速高效的繁殖。
2、繁殖效率高：采用本发明组织培养方法，铁线莲20天增殖倍数达到2-3倍，与常规的组织培养方法相比，生长时间缩短了一半。
3、苗木质量好：本发明方法配方组分简单，幼苗生长健壮，不易玻璃化，移栽成活率大于90%，成苗一致性好。
具体实施方式
下面将结合具体实例，详细说明本发明的具体实施方式：
实施例1：一种铁线莲品种‘Avant-Garde’组培苗瓶内生根的方法，该方法按如下步骤进行：
WPM培养基的配置：
常量元素的组分和其对应的使用浓度如下：硝酸铵（NH4NO3）400 mg/L、硝酸钙（Ca(NO3)2·4H2O）556 mg/L、氯化钙（CaCl2·2H2O）96 mg/L、硫酸镁（MgSO4·7H2O）370 mg/L、磷酸二氢钾（KH2PO4）170 mg/L、硫酸钾（K2SO4）990 mg/L；
微量元素的组分和其对应的使用浓度如下：硫酸锰（MnSO4·H2O）22.3 mg/L、硫酸锌（ZnSO4·7H2O）8.6 mg/L、硼酸（H3BO3）6.2 mg/L、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）0.25 mg/L、硫酸铜（CuSO4·5H2O）0.025 mg/L、氯化钴 （CoCl2.62 ）0.025 mg/L；
铁盐的组分和其对应的使用浓度如下：乙二胺四乙酸二钠（Na2·EDTA ）37.3 mg/L、硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）27.8 mg/L；
有机成分的组分和其对应的浓度如下：肌醇100 mg/L、甘氨酸（Gly）2 mg/L、盐酸硫胺素（VB1）1 mg/L、盐酸吡哆醇（VB6）0.5 mg/L、烟酸（VPP）0.5 mg/L。
1/2WPM培养基的配置：
常量元素的组分和其对应的使用浓度如下：硝酸铵（NH4NO3）200 mg/L、硝酸钙（Ca(NO3)2·4H2O）278 mg/L、氯化钙（CaCl2·2H2O）48 mg/L、硫酸镁（MgSO4·7H2O）185 mg/L、磷酸二氢钾（KH2PO4）85 mg/L、硫酸钾（K2SO4）495 mg/L；
微量元素的组分和其对应的使用浓度如下：硫酸锰（MnSO4·H2O）22.3 mg/L、硫酸锌（ZnSO4·7H2O）8.6 mg/L、硼酸（H3BO3）6.2 mg/L、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）0.25 mg/L、硫酸铜（CuSO4·5H2O）0.025 mg/L、氯化钴 （CoCl2.62 ）0.025 mg/L；
铁盐的组分和其对应的使用浓度如下：乙二胺四乙酸二钠（Na2·EDTA ）37.3 mg/L、硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）27.8 mg/L；
有机成分的组分和其对应的浓度如下：肌醇100 mg/L、甘氨酸（Gly）2 mg/L、盐酸硫胺素（VB1）1 mg/L、盐酸吡哆醇（VB6）0.5 mg/L、烟酸（VPP）0.5 mg/L。
利用上述的培养基分别配置诱导培养基和生根培养基。
其中，诱导培养基：每升WPM培养基+ 0.1 mg 萘乙酸（NAA） + 1.0 mg 6-苄基腺嘌呤（6-BA） + 30 g蔗糖+6.3 g卡拉胶，pH值为5.7~5.8；
生根培养基：每升1/2WPM养基+ 0.15 mg 萘乙酸（NAA）+ 0.2 mg 吲哚乙酸（IBA） + 30g蔗糖+ 6.3 g卡拉胶，pH值为5.7~5.8；
将上述配置好的培养基注入玻璃瓶中，经高温高压消毒20分钟，待用，其中，温度为120-125 ℃，压力为1.1 KG/CM2。
铁线莲组织培养快繁方法，按以下步骤进行：
（1）选材及消毒处理：选取生长健壮、无病虫害的当年生铁线莲的嫩茎作为外植体，然后将所选取的外植体剪切成10 cm长的带芽茎段，经洗洁精消毒10分钟，再用1%的次氯酸钠消毒10分钟，最后用无菌水冲洗5次；
（2）试管苗培养：在超净工作台上和无菌条件下，将步骤（1）中消毒处理后的外植体剪去接触消毒液的伤口部位，留1~2 cm带芽茎段接种在含有诱导培养基的培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，光照强度为1500~2000 Lx，每日光照时间为16小时，温度20±2 ℃，相对湿度60%~65%，在该培养基中可以获得健壮的增殖苗。一个周期20天的繁殖倍数为2.83倍，20天后长成6~8 cm的健壮无菌试管苗可进入下一步骤；
（3）生根培养：将步骤（2）中长成的试管苗，剪切成长度为4~5 cm带有顶芽的茎段，转接到生根培养基中进行生根培养，培养条件为光照强度1500~2000 Lx，每日光照时间为16小时，温度20±2 ℃，相对湿度60%~65%。一个周期20天的生根率为50%，直至达到所需要的繁殖生产规模时进入下一步骤；
（4）组培苗移栽：将步骤（3）中株高达6~8 cm、根系发达且叶片展开的再生植株开瓶培养2天进行炼苗，取出试管苗，洗净，移栽到含有泥炭和珍珠岩的基质中，其中泥炭与珍珠岩的体积比为3:1，然后浇透水，用塑料薄膜覆盖容器口，保持温度25~28℃，相对湿度80%~85%，适当遮荫，培养20天至长出的新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，获得铁线莲幼苗。铁线莲幼苗生根率为50%，提高了移栽成活率和移栽苗质量，移栽成活率90%，成苗一致性好。
实施例2：一种铁线莲品种‘Avant-Garde’组培苗瓶内生根的方法，该方法按如下步骤进行：
WPM培养基的配置：
常量元素的组分和其对应的使用浓度如下：硝酸铵（NH4NO3）400 mg/L、硝酸钙（Ca(NO3)2·4H2O）556 mg/L、氯化钙（CaCl2·2H2O）96 mg/L、硫酸镁（MgSO4·7H2O）370 mg/L、磷酸二氢钾（KH2PO4）170 mg/L、硫酸钾（K2SO4）990 mg/L；
微量元素的组分和其对应的使用浓度如下：硫酸锰（MnSO4·H2O）22.3 mg/L、硫酸锌（ZnSO4·7H2O）8.6 mg/L、硼酸（H3BO3）6.2 mg/L、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）0.25 mg/L、硫酸铜（CuSO4·5H2O）0.025 mg/L、氯化钴 （CoCl2.62 ）0.025 mg/L；
铁盐的组分和其对应的使用浓度如下：乙二胺四乙酸二钠（Na2·EDTA ）37.3 mg/L、硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）27.8 mg/L；
有机成分的组分和其对应的浓度如下：肌醇100 mg/L、甘氨酸（Gly）2 mg/L、盐酸硫胺素（VB1）1 mg/L、盐酸吡哆醇（VB6）0.5 mg/L、烟酸（VPP）0.5 mg/L。
1/2WPM培养基的配置：
常量元素的组分和其对应的使用浓度如下：硝酸铵（NH4NO3）200 mg/L、硝酸钙（Ca(NO3)2·4H2O）278 mg/L、氯化钙（CaCl2·2H2O）48 mg/L、硫酸镁（MgSO4·7H2O）185 mg/L、磷酸二氢钾（KH2PO4）85 mg/L、硫酸钾（K2SO4）495 mg/L；
微量元素的组分和其对应的使用浓度如下：硫酸锰（MnSO4·H2O）22.3 mg/L、硫酸锌（ZnSO4·7H2O）8.6 mg/L、硼酸（H3BO3）6.2 mg/L、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）0.25 mg/L、硫酸铜（CuSO4·5H2O）0.025 mg/L、氯化钴 （CoCl2.62 ）0.025 mg/L；
铁盐的组分和其对应的使用浓度如下：乙二胺四乙酸二钠（Na2·EDTA ）37.3 mg/L、硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）27.8 mg/L；
有机成分的组分和其对应的浓度如下：肌醇100 mg/L、甘氨酸（Gly）2 mg/L、盐酸硫胺素（VB1）1 mg/L、盐酸吡哆醇（VB6）0.5 mg/L、烟酸（VPP）0.5 mg/L。
利用上述的培养基分别配置诱导培养基和生根培养基。
其中，诱导培养基：每升WPM培养基+ 0.05 mg 萘乙酸（NAA） + 1.0 mg 6-苄基腺嘌呤（6-BA） + 30 g蔗糖+6.3 g卡拉胶，pH值为5.7~5.8；
生根培养基：每升1/2WPM培养基+ 0.15 mg 萘乙酸（NAA）+ 0.5 mg 吲哚乙酸（IBA） +30 g蔗糖+ 6.3 g卡拉胶，pH值为5.7~5.8；
将上述配置好的培养基注入玻璃瓶中，经高温高压消毒20分钟，待用，其中，温度为120-125 ℃，压力为1.1 KG/CM2。
铁线莲组织培养快繁方法，按以下步骤进行：
（1）选材及消毒处理：选取生长健壮、无病虫害的当年生铁线莲的嫩茎作为外植体，然后将所选取的外植体剪切成10 cm长的带芽茎段，经洗洁精消毒10分钟，再用1%的次氯酸钠消毒10分钟，最后用无菌水冲洗5次；
（2）试管苗培养：在超净工作台上和无菌条件下，将步骤（1）中消毒处理后的外植体剪去接触消毒液的伤口部位，留1~2 cm带芽茎段接种在含有诱导培养基的培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，光照强度为1500~2000 Lx，每日光照时间为16小时，温度20±2 ℃，相对湿度60%~65%，在该培养基中可以获得健壮的增殖苗，一个周期20天的繁殖倍数为2.83倍，20天后长成6~8 cm的健壮无菌试管苗可进入下一步骤；
（3）生根培养：将步骤（2）中长成的试管苗，剪切成长度为4~5 cm带有顶芽的茎段，转接到生根培养基中进行生根培养，培养条件为光照强度1500~2000 Lx，每日光照时间为16小时，温度20±2 ℃，相对湿度60%~65%。一个周期20天的生根率为50%，直至达到所需要的繁殖生产规模时进入下一步骤；
（4）组培苗移栽：将步骤（3）中株高达6~8 cm、根系发达且叶片展开的再生植株开瓶培养2天进行炼苗，取出试管苗，洗净，移栽到含有泥炭和珍珠岩的基质中，其中泥炭与珍珠岩的体积比为3:1，然后浇透水，用塑料薄膜覆盖容器口，保持温度25~28℃，相对湿度80%~85%，适当遮荫，培养20天至长出的新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，获得铁线莲幼苗，铁线莲幼苗生根率为50%，提高了移栽成活率和移栽苗质量，移栽成活率92%，成苗一致性好。
以上以较佳实例公开了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采用等同替换或等效变换方式获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种铁线莲品种‘Avant-Garde’组培苗瓶内生根方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）选材及消毒处理：选取生长健壮、无病虫害的当年生铁线莲的嫩茎作为外植体，然后将所选取的外植体剪切成10 cm长的带芽茎段，经洗洁精消毒10分钟，再用1%的次氯酸钠消毒10分钟，最后用无菌水冲洗5次；
（2）试管苗培养：在超净工作台上和无菌条件下，将步骤（1）中消毒处理后的外植体剪去接触消毒液的伤口部位，留1~2 cm带芽茎段接种在含有诱导培养基的培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，光照强度为1500~2000 Lx，每日光照时间为16小时，温度20±2 ℃，相对湿度60%~65%，在该培养基中可以获得健壮的增殖苗；
一个周期20天后长成6~8 cm的健壮无菌试管苗可进入下一步骤；
（3）生根培养：将步骤（2）中长成的试管苗，剪切成长度为4~5 cm带有顶芽的茎段，转接到生根培养基中进行生根培养，培养条件为光照强度1500~2000 Lx，每日光照时间为16小时，温度20±2 ℃，相对湿度60%~65%；一个周期20天的生根率为50%，直至达到所需要的繁殖生产规模时进入下一步骤；
（4）组培苗移栽：将步骤（3）中株高达6~8 cm、根系发达且叶片展开的再生植株开瓶培养2天进行炼苗，取出试管苗，洗净，移栽到含有泥炭和珍珠岩的基质中，其中泥炭与珍珠岩的体积比为3:1，然后浇透水，用塑料薄膜覆盖容器口，保持温度25~28℃，相对湿度80%~85%，适当遮荫，培养20天至长出的新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，获得铁线莲幼苗。
2.根据权利要求1所述的铁线莲的组织培养方法，其特征在于：所述步骤（2）中的诱导培养基为：每升WPM培养基 + 0.1 mg 萘乙酸+ 1.0 mg 6-苄基腺嘌呤。
3.根据权利要求1所述的铁线莲的组织培养方法，其特征在于：所述步骤（3）中的生根培养基为：每升1/2 WPM培养基+ 0.15 mg 萘乙酸+ 0.2 mg 吲哚乙酸。
4.根据权利要求1所述的铁线莲的组织培养方法，步骤（3）中的带芽茎段为带有顶芽且长度为4~5 cm的茎段。
5.根据权利要求2或者3所述的铁线莲的组织培养方法，其特征在于：WPM培养基和1/2WPM培养基由常量元素、微量元素、铁盐和有机成分组成。
6.根据权利要求5所述的铁线莲的组织培养方法，其特征在于:所述 WPM培养基具体由以下组分组成：
所述的常量元素为：NH4NO3 400 mg/L、Ca(NO3)2·4H2O 556mg/L、CaCl2·2H2O 96 mg/L、MgSO4·7H2O 370 mg/L、KH2PO4 170 mg/L、K2SO4 990 mg/L；
所述的微量元素为：MnSO4·H2O 22.3 mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L、H3BO3 6.2 mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L、CuSO4·5H2O 0.025 mg/L、CoCl2.6 H2O0.025 mg/L；
所述的铁盐为： Na2·EDTA 37.3 mg/L、FeSO4·7H2O 27.8 mg/L；
所述的有机成分为：肌醇100 mg/L、甘氨酸2 mg/L、盐酸硫胺素1 mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5 mg/L。
7.根据权利要求3所述的铁线莲的组织培养方法，其特征在于: 所述1/2WPM培养基具体由以下组分组成：
所述的常量元素为：NH4NO3 200 mg/L、Ca(NO3)2·4H2O 278 mg/L、CaCl2·2H2O 58 mg/L、MgSO4·7H2O 46.25 mg/L、KH2PO4 85 mg/L、K2SO4 495 mg/L；
所述的微量元素为：MnSO4·H2O 22.3 mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L、H3BO3 6.2 mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L、CuSO4·5H2O 0.025 mg/L、CoCl2.6 H2O0.025 mg/L；
所述的铁盐为： Na2·EDTA 37.3 mg/L、FeSO4·7H2O 27.8 mg/L；
所述的有机成分为：肌醇100 mg/L、甘氨酸2 mg/L、盐酸硫胺素1 mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5 mg/L。
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