CN103430854A - 铁线莲奶油的组织培养方法 - Google Patents

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方炎明
程莹
刘畅
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Abstract

本发明是一种铁线莲栽培品种“奶油”的组织培养方法，包括如下步骤：1）外植体消毒处理；2）芽诱导和芽增殖，包括①诱导培养；②不定芽增殖培养；③壮苗培养；④生根培养；⑤炼苗和移栽。本发明的有益效果：应用组织培养方法，能较好地保持母本的观赏价值，有效地提高铁线莲“奶油”的繁殖系数；与扦插繁殖相比，生长周期大幅缩短，组织培养法的繁殖系数为扦插繁殖的50~60倍；快速繁殖、品种优质、产量可观和便于实地推广。

Description

铁线莲奶油的组织培养方法
技术领域
本发明涉及的是一种铁线莲“奶油”（英文商品名为：Clematis ‘Guernsey Cream’）的组织培养方法，属于植物组织培养技术领域。
背景技术
铁线莲属(Clematis L.)隶属于毛茛科(Ranunculaceae)毛茛亚科(Subfam. Ranunculoideae)银莲花族(Trib. Anemoneae)铁线莲亚族(Subtrib. Clematidinae)，常为多年生木质藤本。世界约有355种，我国有147种，其中93种为我国特有种，特有率为63.3%。
其萼片花瓣状，色彩丰富，形态多变，茎蔓生，利用叶柄攀援，生长适应性强，园艺用途广泛，观赏价值高，在垂直绿化中具有重要地位，享有“攀援植物皇后”之美称。在日本和西方园林中，铁线莲已占有十分重要的地位，大部分植物园、公园和家庭花园都能见到它们绚丽多彩的身影。此外，该属植物中的许多种如女萎(Clematis apiifolia）、威灵仙(C. chinensis)等作为药用植物使用已久。
其种子较难发芽，多用扦插繁殖。采取组织培养法进行铁线莲“奶油”（英文商品名为：Clematis ‘Guernsey Cream’）的快速繁殖，建立丛生芽生根的无性繁殖体系, 有利于增大繁殖系数，对于铁线莲“奶油”走向园艺应用具有较强的生产应用价值。
发明内容
本发明提出的是一种铁线莲“奶油”的组织培养方法，其目的是克服铁线莲“奶油”现有繁殖技术存在的缺陷，提高其繁殖系数以适应其引种推广及园林应用的需求。
本发明的技术解决方案：一种铁线莲栽培品种Clematis‘Proteus’的组织培养方法，其特征是包括如下步骤：
1）外植体消毒处理；
2）芽诱导和芽增殖。
所述的步骤1）外植体消毒处理 ，具体包括：
取铁线莲“奶油”当年生的幼嫩茎节和顶芽，依次用自来水冲洗1 h，毛笔来回刷洗20次，于超净工作台上用质量浓度为75%乙醇灭菌20 s，无菌水冲洗2次，之后用质量浓度为0.1%氯化汞灭菌7 min，立即用无菌水冲洗4次。用灭菌滤纸吸干外植体表面水分，切除叶柄和两端受伤部位。实验统计的污染率分别为70%、64%，褐化率为25%、22%。
所述的步骤2）芽诱导和芽增殖，具体包括：
①诱导培养
将芽接种于已灭菌的诱导培养基1/2 MS+生长调节物质NAA 0.5 mg/L+生长调节物质TDZ 1.0 mg/L+质量浓度为3%的蔗糖20~30 g/L +质量浓度为0.7%的琼脂7 g/L，pH值为5.8，培养4周。培养温度25℃，光照16 h/d，照度2400 1x；
②不定芽增殖培养
将诱导的丛生芽分成单芽，继而将单芽接入1/2 MS+生长调节物质6-BA 0.2 mg/L +生长调节物质KT0.5 mg/L+生长调节物质NAA 0.05 mg/L+质量浓度为3%的蔗糖20~30 g/L +质量浓度为0.7%的琼脂7 g/L的培养基，pH值为5.8，培养4周。温度、光照条件同①丛生芽诱导；
③壮苗培养
将增殖培养基中叶色浓绿、长度为1~2 cm的不定芽逐个切下，接入MS基本培养基中培养4星期，光照条件同①丛生芽诱导；
④生根培养
将壮苗培养后长势旺盛的芽接入生根培养基1/2 MS+生长调节物质IBA 0.5 mg/L中，培养40天。温度、光照条件同①丛生芽诱导；
⑤炼苗和移栽
将生根的铁线莲“奶油”植株的培养瓶瓶盖打开，温室下炼苗6 d后，取出试管苗，洗净，移栽到准备好的珍珠岩：蛭石：泥炭(1:1:1)的营养钵中，保持湿度85%~95%，温度、光照条件同(2)丛生芽诱导，成活率达95%。
本发明的有益效果：应用组织培养方法，能较好地保持母本的观赏价值，有效地提高铁线莲“奶油”的繁殖系数。与扦插繁殖相比，生长周期大幅缩短，组织培养法的繁殖系数为扦插繁殖的50~60倍。快速繁殖、品种优质、产量可观和便于实地推广。
具体实施方式
实施例
一种铁线莲栽培品种Clematis‘Proteus’的组织培养方法，其培养步骤如下：
步骤一、外植体消毒处理
选取当年生幼嫩茎节和顶芽，依次进行 冲洗1.5 h，于超净工作台上用75%乙醇灭菌20 s，用无菌水冲洗2次，之后用0.1%升汞灭菌7 min，立即用无菌水冲洗3-4次。
步骤二、芽诱导和芽增殖
①诱导培养
冲洗后将外植体置于培养皿中，用剪刀、镊子切除叶柄、两端受伤部位后，将芽接种于已灭菌的诱导培养基1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+TDZ 1.0 mg/L上5周，质量浓度为3%的蔗糖20~30 g/L，质量浓度为0.7%的琼脂7 g/L，pH 5.7，培养温度25℃；光照条件：光照/黑暗，其中光照16 h/d，光照度为2400 1x。
②不定芽增殖培养
将诱导培养基中诱导出的丛生芽分成单芽，接入1/2 MS+生长调节物质6-BA 0.2 mg/L+生长调节物质KT 0.5 mg/L+生长调节物质NAA 0.05 mg/L增殖培养基中培养4周光照条件同①诱导培养。
③壮苗培养
将增殖培养基中叶色浓绿、长度为2 cm左右的不定芽逐个切下，接入MS基本培养基中培养25天，光照条件同①诱导培养。
④生根培养
将壮苗培养后长势旺盛的芽切去茎基部褐色物质后接入生根培养基1/2 MS+生长调节物质IBA 0.5 mg/L，培养6周后生根，光照条件同①诱导培养。
⑤炼苗和移栽
  将生根植株的培养瓶瓶盖打开，室温下炼苗6 d后，取出试管苗，洗净，移栽到准备好的珍珠岩、蛭石、泥炭，其重量比为珍珠岩：蛭石：泥炭=1:1:1苗床上，保持温度20~25℃，湿度85%~95%，适当遮荫，成活率达90%。
所述的MS基本培养基是由大量元素、微量元素、铁盐和有机成分所组成。
所述的大量元素为：硝酸钾KNO3，1900 mg·L-1,硝酸铵NH4NO3，1650 mg·L-1,磷酸二氢钾 KH2PO4，170 mg·L-1,硫酸镁MgSO4·7 H2O，370 mg·L-1,氯化钙CaCl2·4 H2O，440 mg·L-1。
所述的微量元素为：碘化钾KI，0.83 mg·L-1,硼酸H3BO3 ， 6.2 mg·L-1，或硫酸锰MnSO4·4 H2O, 22.3 mg·L-1或硫酸锌ZnSO4·7 H2O，8.6 mg·L-1或钼酸钠Na2MoO4·2 H2O，0.25 mg·L-1,硫酸铜CuSO4·5 H2O，0.025 mg·L-1,氯化钴CoCl2·6 H2O，0.025 mg·L-1。
所述的铁盐为：乙二胺二乙酸二钠Na2·EDTA，37.3 mg·L-1,硫酸亚铁FeSO4·7 H2O，27.8 mg·L-1。
所述的有机成分为：肌醇C6H12O6·2H2O，100 mg·L-1,甘氨酸  NH2CH2COOH，2 mg·L-1,盐酸硫胺素C12H17ClOS·2HCl，0.1 mg·L-1,盐酸吡哆醇C8H11O3N·HCl ，0.5 mg·L-1,烟酸NC5H4COOH，0.5 mg·L-1。
所述的1/2 MS基本培养基的成分为：大量元素是MS的一半，其余成分微量元素、铁盐,有机成分与MS的有机成分相同。
所述的生长调节物质6-BA为6-苄基腺嘌呤；NAA为萘乙酸；KT为激动素；IBA为吲哚丁酸, TDZ为噻二唑苯基脲。

Claims (7)

1.一种铁线莲栽培品种Clematis ‘Proteus’的组织培养方法，其特征是包括如下步骤：
1）外植体消毒处理；
2）芽诱导和芽增殖。
2.根据权利要求1所述的一种铁线莲栽培品种Clematis ‘Proteus’的组织培养方法，其特征是所述的步骤1）外植体消毒处理，具体包括：
取铁线莲“奶油”当年生的幼嫩茎节和顶芽，依次用自来水冲洗1 h，毛笔来回刷洗20次，于超净工作台上用质量浓度为75%乙醇灭菌20 s，无菌水冲洗2次，之后用质量浓度为0.1%氯化汞灭菌7 min，立即用无菌水冲洗4次；用灭菌滤纸吸干外植体表面水分，切除叶柄和两端受伤部位；实验统计的污染率分别为70%、64%，褐化率为25%、22%。
3.根据权利要求1所述的一种铁线莲栽培品种Clematis ‘Proteus’的组织培养方法，其特征是所述的步骤2）芽诱导和芽增殖，具体包括：
①诱导培养
将芽接种于已灭菌的诱导培养基1/2 MS+生长调节物质NAA 0.5 mg/L+生长调节物质TDZ 1.0 mg/L+质量浓度为3%的蔗糖20~30 g/L +质量浓度为0.7%的琼脂7 g/L，pH值为5.8，培养4周；培养温度25℃，光照16 h/d，照度2400 1x；
②不定芽增殖培养
将诱导的丛生芽分成单芽，继而将单芽接入1/2 MS+生长调节物质6-BA 0.2 mg/L +生长调节物质KT0.5 mg/L+生长调节物质NAA 0.05 mg/L+质量浓度为3%的蔗糖20~30 g/L +质量浓度为0.7%的琼脂7 g/L的培养基，pH值为5.8，培养4周；温度、光照条件同①丛生芽诱导；
③壮苗培养
将增殖培养基中叶色浓绿、长度为1~2 cm的不定芽逐个切下，接入MS基本培养基中培养4星期，光照条件同①丛生芽诱导；
④生根培养
将壮苗培养后长势旺盛的芽接入生根培养基1/2 MS+生长调节物质IBA 0.5 mg/L中，培养40天；温度、光照条件同①丛生芽诱导；
⑤炼苗和移栽
将生根的铁线莲“Clematis ‘Proteus’”植株的培养瓶瓶盖打开，温室下炼苗6 d后，取出试管苗，洗净，移栽到准备好的珍珠岩：蛭石：泥炭(1:1:1)的营养钵中，保持湿度85%~95%，温度、光照条件同(2)丛生芽诱导，成活率达95%。
4.根据权利要求3所述的一种铁线莲栽培品种Clematis ‘Proteus’的组织培养方法，其特征是所述的MS基本培养基是由大量元素、微量元素、铁盐和有机成分所组成。
5.根据权利要求4所述的一种铁线莲栽培品种Clematis ‘Betty Risdon’的组织培养方法，其特征是所述的大量元素为：硝酸钾KNO3，1900 mg·L-1,硝酸铵NH4NO3，1650 mg·L-1,磷酸二氢钾 KH2PO4，170 mg·L-1,硫酸镁MgSO4·7 H2O，370 mg·L-1,氯化钙CaCl2·4 H2O，440 mg·L-1；
所述的微量元素为：碘化钾KI，0.83 mg·L-1,硼酸H3BO3 ， 6.2 mg·L-1，或硫酸锰MnSO4·4 H2O, 22.3 mg·L-1或硫酸锌ZnSO4·7 H2O，8.6 mg·L-1或钼酸钠Na2MoO4·2 H2O，0.25 mg·L-1,硫酸铜CuSO4·5 H2O，0.025 mg·L-1,氯化钴CoCl2·6 H2O，0.025 mg·L-1；
所述的铁盐为：乙二胺二乙酸二钠Na2·EDTA，37.3 mg·L-1,硫酸亚铁FeSO4·7 H2O，27.8 mg·L-1；
所述的有机成分为：肌醇C6H12O6·2H2O，100 mg·L-1,甘氨酸  NH2CH2COOH，2 mg·L-1,盐酸硫胺素C12H17ClOS·2HCl，0.1 mg·L-1,盐酸吡哆醇C8H11O3N·HCl ，0.5 mg·L-1,烟酸NC5H4COOH，0.5 mg·L-1。
6.根据权利要求3所述的一种铁线莲栽培品种Clematis ‘Proteus’的组织培养方法，其特征是所述的1/2 MS基本培养基的成分为：大量元素是MS的一半，其余成分微量元素、铁盐,有机成分与MS的有机成分相同。
7.根据权利要求3所述的一种铁线莲栽培品种Clematis ‘Proteus’的组织培养方法，其特征是所述的生长调节物质6-BA为6-苄基腺嘌呤；NAA为萘乙酸；KT为激动素；IBA为吲哚丁酸, TDZ为噻二唑苯基脲。
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