CN108207621A - 一种铁线莲属植物直接不定芽离体发生的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种铁线莲属植物直接不定芽离体发生的方法，具体地，本发明提供了一种铁线莲属植物的繁殖方法，包括步骤：(a)将所述铁线莲属植物的茎段无菌培养获得带腋芽的茎段；(b)切除所述步骤(a)获得的茎段的腋芽后进行诱导培养，长出不定芽；(c)对所述步骤(b)获得的不定芽进行培养，生根获得植株。本发明首次以铁线莲属植物无菌萌发的茎段为起始外植体，进行离体繁殖，不经过愈伤组织形成阶段的直接诱导不定芽发生,并经过再生芽苗的伸长、生根及移栽成苗后，可获得大量再生植株表型一致性高、遗传稳定性好的铁线莲属植物。

Description

一种铁线莲属植物直接不定芽离体发生的方法
技术领域
本发明涉及铁线莲属植物栽培领域，具体涉及一种铁线莲属植物直接不定芽离体发生的方法。
背景技术
铁线莲属(Clematis)为多年生木质或草质藤本，或为直立灌木或草本，全世界约300种，分布于热带及亚热带地区，我国约有108种，全国各地都有分布。铁线莲属植物兼具药用与观赏功能，植株含有三萜皂苷、生物碱、香豆素、木脂素和黄酮类化学成分，具有抗菌、消炎、抗肿瘤和镇痛等药理作用。其花型多样，色彩缤纷，素有“藤本皇后”的美誉，现有的栽培品种600余种，在城市园林中已有应用，深受家庭园艺爱好者的推崇。铁线莲可点缀于围墙、栅栏、棚架或作绿篱，在日本和欧美等国家被广泛用于庭园中，相比之下目前我国铁线莲属植物在园林中的应用不多，引种栽培的范围也较小。目前国内市场销售的铁线莲栽培种类多来自欧洲，没有我国自主产权的品种，同时，许多国外品种在栽培过程中不能适应江南地区夏季湿热气候，出现枝叶大量枯萎的情况，严重影响了观赏效果。国内有关铁线莲属植物育种及繁殖技术的报道很少，仅涉及东北铁线莲、钝萼铁线莲等少数几种。
目前国内对铁线莲属植物的研究主要集中在种质资源调查、系统分类研究和栽培繁殖等方面。铁线莲属植物存在结实少或萌发时间长、发芽率低等问题，不宜采用有性繁殖，园林栽培应用受到限制。
通常情况下，铁线莲属直接不定芽诱导不定芽发生频率低下，且未见报道。
因此，本领域迫切需要开发一种新型的、可以实现铁线莲属植物的大规模种植的直接不定芽离体发生的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的、可以实现铁线莲属植物的大规模种植的直接不定芽离体发生的方法。
本发明第一方面提供了一种铁线莲属植物的繁殖方法，包括步骤：
(a)将所述铁线莲属植物的茎段无菌培养获得带腋芽的茎段；
(b)切除所述步骤(a)获得的茎段的腋芽后，将所述茎段进行诱导培养，长出不定芽；和
(c)对所述步骤(b)获得的不定芽进行培养，生根获得植株。
在另一优选例中，所述步骤(a)中，所述茎段的长度为0.3-5cm，较佳地，0.5-4cm，更佳地，0.6-2cm。
在另一优选例中，所述步骤(a)中，将所述茎段置于含0.1-10mg/L BA和0.01-1mg/L NAA)的ML培养基上，于23±1℃无菌培养，所述茎段萌发获得所述带腋芽的茎段。
在另一优选例中，所述步骤(a)中，将所述种子置于含0.5-8mg/L BA和0.05-0.8mg/L NAA的ML培养基上，于23±1℃无菌培养，所述茎段萌发获得所述带腋芽的茎段。
在另一优选例中，所述步骤(a)中，将所述种子置于含0.8-2mg/L BA和0.08-0.3mg/L NAA的ML培养基上，于23±1℃无菌培养，所述茎段萌发获得所述带腋芽的茎段。
在另一优选例中，所述步骤(a)中，培养20-30天后茎段开始萌发，茎节开始抽出腋芽，4-6周后新抽出的腋芽开始重新分节，抽芽率为95-100％。
在另一优选例中，所述步骤(b)中，所述诱导培养是指在含0.1-10mg/L BA和0.01-5mg/L NAA的ML培养基上培养所述茎段。
在另一优选例中，所述步骤(b)中，腋芽切除后，所述茎段长度为0.3-5cm，较佳地，0.5-4cm，更佳地，0.6-2cm。
在另一优选例中，所述步骤(b)中，切除所述步骤(a)获得的茎段的腋芽后，转移至含0.1-10mg/L BA和0.01-5mg/L NAA的ML培养基上，于23±1℃进行诱导培养。
在另一优选例中，所述步骤(b)中，4-6周后茎节处开始有大量不定芽丛生。
在另一优选例中，所述步骤(c)包括步骤:
(c1)对所述步骤(b)获得的不定芽进行诱导培养至不定芽伸长分节；和
(c2)分离步骤(c1)获得的伸长分节的不定芽，继续培养至生根获得植株。
在另一优选例中，所述步骤(c1)中将所述不定芽置于含0.1-20mg/L BA、0.01-5mg/L NAA、和0.01-10mg/L GA3的ML培养基中，于23±1℃进行培养。
在另一优选例中，所述步骤(c1)中将所述不定芽置于含0.2-10mg/L BA、0.05-3mg/L NAA、和0.05-5mg/L GA3的ML培养基中，于23±1℃进行培养。
在另一优选例中，所述步骤(c1)中将所述不定芽置于含0.3-5mg/L BA、0.08-3mg/L NAA、和0.06-4mg/L GA3的ML培养基中，于23±1℃进行培养。
在另一优选例中，所述步骤(c1)中培养3-4周后诱导出形态清晰的不定芽并且不定芽明显伸长分节。
在另一优选例中，所述步骤(c2)中将伸长分节的不定芽(较佳地，分离的单株不定芽)置于含0.5-30mg/L(较佳地，0.8-20mg/L，更佳地，1-10mg/L)IBA的ML培养基中进行预培养。
在另一优选例中，所述步骤(c2)中，伸长分节的不定芽(较佳地，分离的单株不定芽)在ML培养基中预培养3-5天后，切除形态学下端茎段，在含0.01-5mg/L(较佳地，0.05-4mg/L，更佳地，0.08-3mg/L)IBA的1/2MS培养基中继续培养。
在另一优选例中，所述步骤(c2)中，所述切除的茎段的长度为0.3-5mm，较佳地，0.5-4mm，更佳地，0.6-2mm。
在另一优选例中，所述步骤(c2)中，在1/2MS培养基中继续培养4-6周，于24±1℃培养诱导得到不定根。
在另一优选例中，所述步骤(c2)中，将获得的不定根培养于28±2℃，培养1-2周后得到离体再生的完整小植株。
在另一优选例中，所述方法还包括将步骤c)获得的植株进行炼苗后，移植入栽培土中培养的步骤。
在另一优选例中，所述栽培土中培养的温度为28±2℃。
在另一优选例中，所述栽培土的基质包括泥炭、菜园土、和/或珍珠岩。
在另一优选例中，所述泥炭、菜园土、珍珠岩的比例为3:6:1。
在另一优选例中，所述铁线莲属植物选自下组：铁线莲、芹叶铁线莲、阔叶铁线莲、或其组合。
在另一优选例中，所述方法还包括在步骤a)前对所述种子进行消毒的步骤。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了铁线莲高效直接不定芽发生体系，其中，图A：入瓶的无菌外植体，bar:1cm；图B：伸长的腋芽，bar:2cm；图C：不定芽，bar:6mm；图D：伸长的丛芽，bar:1cm；图E：生根小苗，bar:2cm；图F：再生植株，bar:2cm。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次以铁线莲属植物无菌萌发的茎段为起始外植体，进行离体繁殖，不经过愈伤组织形成阶段的直接诱导不定芽发生,并经过再生芽苗的伸长、生根及移栽成苗后，可获得大量再生植株表型一致性高、遗传稳定性好的铁线莲属植物。在此基础上，完成了本发明。
ML培养基
本文所用的ML培养基是一种铁线莲属植物专性培养基，用于不定芽的诱导和伸长。除非另有说明，采用本发明的配方配制ML培养基或ML固体培养基。
1/2MS培养基
本文所用的MS培养基是本领域目前使用最普遍的培养基，Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要,因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基(Murashigeand Skoog A revised medium for rapid growth and bio assays with tobaccotissue cultures.Physiol Plant,1962.15(3):473.)。除非另有说明，采用本领域已知的配方配制MS培养基或MS固体培养基即可。(罗林会等，费菜的离体快速繁殖.特种经济动植物，2003，6(10)：24)
1/2MS基本培养基是指将MS培养基中大量元素质量减半。大量元素是指硝酸钾KNO3、硝酸铵NH4NO3、磷酸二氢钾KH2PO4、硫酸镁MgSO4.7H2O和氯化钙CaCl2.2H2O等五种化合物。
6-苄基腺嘌呤
如本文所用，术语“6-苄基腺嘌呤”、“6-苄腺嘌呤”、“6-苯甲基腺嘌呤”、“6-BA”、“苄基腺嘌呤”、“BA”等均可以与互换使用。
6-苄基腺嘌呤是一种广谱性植物生长调节剂，可促进植物细胞生长，抑制植物叶绿素、核酸、蛋白质的分解，提高氨基酸的含量，延缓叶片衰老，将氨基酸、生长素、无机盐等向处理部位调运等多种效能，广泛用在农业、果树和园艺作物的从发芽到收获的各个阶段。
本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得6-苄基腺嘌呤，如市场购买或用常规方法制取。
赤霉素
如本文所用，术语“赤霉素”可以与“GA”、“GA3”互换使用。
赤霉素是一类广泛存在的植物激素，化学结构比较复杂，属于二萜类酸，由四环骨架衍生而得。赤霉素都含有赤霉素烷骨架。在高等植物中赤霉素的最近前体一般认为是贝壳杉烯。赤霉素的基本结构是赤霉素烷，有4个环。在赤霉素烷上，由于双键、羟基数目和位置不同，形成了各种赤霉素，已知的赤霉素类至少有38种。不同的赤霉素生物活性不同，赤霉酸(GA3)的活性最高。活性高的化合物必须有一个赤霉环系统(环ABCD)，在C-7上有羧基，在A环上有一个内酯环。
赤霉素目前广泛应用于农业生产，如提高葡萄产量，或在杂交水稻制种中调节花期以使父母本花期相遇等；对水稻、棉花、蔬菜、瓜果、绿肥等有显著的增产效果。
本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得各种赤霉素，如市场购买或用常规方法制取。一种常规制取赤霉素的方法为用甲醇提取。不同的赤霉素可以用各种色谱分析技术分开。
萘乙酸
如本文所用，术语“萘乙酸”可以与“NAA”互换使用。
萘乙酸是广谱型植物生长调节剂，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根增加座果，防止落果，改变雌、雄花比率等。可经叶片、树枝的嫩表皮，种子进入到植株内，随营养流输导到全株。
本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得萘乙酸，如市场购买或用常规方法制取。
IBA
如本文所用，术语“IBA”、“吲哚丁酸”可互换使用。
吲哚丁酸(IBA)是专性生根激素，并且是一种广谱的吲哚类植物生长调节剂，是良好的生根剂，可促进草本和木本观赏植物插枝的生根。还可用于瓜果的座果，提高座果率。
在本发明中，添加IBA的目的与效果是为了促进生根，加快植物的生殖转换。
本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得IBA，如市场购买或用常规方法制取。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次对铁线莲的直接不定芽离体发生进行了研究，并获得了较高频率的再生植株。
(2)本发明首次以铁线莲属植物的茎段为起始外植体，进行离体繁殖，不经过愈伤组织形成阶段直接诱导不定芽发生,并经过再生芽苗的伸长、生根及移栽成苗后，可获得大量再生植株表型一致性高、遗传稳定性好、遗传保守性高的铁线莲属植物。
(3)本发明的方法可离体快速大量繁殖铁线莲属植物，重复性好。
(4)本发明的方法能够在短时间内生产大量的铁线莲优质种苗，而且这种种苗的发生不受季节限制，可以常年生产。
(5)本发明的方法可以迅速实现铁线莲的大规模种植。
(6)本发明首次使用茎段经专性配方培养，不经由愈伤组织形成阶段而直接再生成植株，按本发明的方法重复三次试验，平均每个带节间茎段能产生再生植株17.4株，且与亲本表型一致性高，并且繁殖系数高，不定芽诱导率高(100％)，生根率高(100％)，移栽存活率高(100％)。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
除非另有说明，否则本发明实施例中所用的材料和试剂均为市售产品。
实施例1
(1)基本培养基(Mulan basal medium,简称ML培养基)的制备：按照表1配制基本培养基，pH5.8，121℃灭菌15-25分钟。不定芽的诱导和伸长均使用该培养基。
表1ML培养基的组成成分一览表
(2)材料：三月初铁线莲新抽出的枝条(获自中国科学院上海生命科学院)，从顶端往下数2-3节的嫩枝。实地取材时要注意不能选取木质化程度太高的材料。
(3)将新鲜的枝条用自来水洗净，吸干表面水珠，在超净工作台上用70％的乙醇消毒30-90秒，0.1％的升汞浸泡10-14分钟，无菌水冲洗5-8次，无菌滤纸吸干无菌材料表面水珠，将茎秆去掉，保留茎节，制成长度约为1cm的茎段。
(4)将含有茎节的切段接种于附含1mg/l BA和0.1mg/l NAA的ML培养基中培养20-30天后，茎节处开始抽出新的腋芽(图1，A)，在此培养基上培养4-6周后，新抽出的腋芽伸长并开始重新分节(图1，B)。培养条件：光照(60μmol.m-2.s-1)16h/d培养，培养温度为23±1℃。
(5)将步骤(4)所得的伸长的腋芽切下，重新切成长度约为1cm的含有茎节的切段在附含0.5－3mg/l BA和0.1－0.5mg/l NAA的ML培养基上培养4-6周后，茎节处开始有大量的不定芽丛生(图1，C)。光照(60μmol.m-2.s-1)16h/d培养，培养温度为23±1℃，4周继代一次，培养基不变。
(6)将附带原始不定芽的茎段在附含0.5－3mg/l BA，0.1－0.5mg/l NAA和0.1-1mg/L GA的ML培养基上培养3-4周后，诱导出形态清晰的不定芽并且不定芽明显伸长分节(图1，D)。光照培养(60μmol.m-2.s-1)16h/d，培养温度为23±1℃。
(7)将伸长后的芽苗分离成单株，用5mg/l IBA的ML培养基预培养3-5d，切除形态学下端1mm茎段后，转入附含0.1－0.5mg/l IBA的1/2MS培养基中培养4-6周后不定根被诱导出来图1，E)。生根培养基附加蔗糖2％，且用0.25％gelrite(结冷胶)固化。培养条件：光照(80μmol.m-2.s-1)16h/d，培养温度24±1℃。
(8)将步骤(7)所得生根苗连同培养基(同上)、培养瓶等一起转入28±2℃、光照(80μmol.m-2.s-1)16h/d的培养条件下进行耐受培养1-2周后，打开培养瓶盖子，注入10-20ml无菌水或去离子水，炼苗5-8天。
(9)将生根小苗移栽到泥炭、菜园土和珍珠岩(3∶6∶1)的基质中，在28±2℃、自然光照的大棚中生长良好，成为与自然生长小苗一致的铁线莲再生植株(图1，F)。
上述实验步骤重复三次，对于铁线莲植物来说，平均每个带节间茎段能产生再生植株17.4株，且与亲本表型一致性高，并且每个节段的繁殖系数为20-30株苗/外植体，不定芽诱导率100％，生根率100％，移栽存活率100％；
并且，1个原始节段，经20天无菌培养后，第一月的繁殖数为2(个)×2(节)×20＝80株，伸长15天；第二月的繁殖数量为2(个)×2(节)×20×20×3(节)＝4800株。
采用常规的方法，铁线莲的不定芽诱导率为90％，生根率为90％，移栽存活率为90％。因此，本发明的方法所培育的铁线莲具有非常高的不定芽诱导率、生根率以及移栽存活率，高达100％。
实施例2
本实施例的步骤与实施例1基本相同，不同之处采用芹叶铁线莲。
实验步骤重复三次，平均每个带节间茎段产生的再生植株数量与本发明实施例1的铁线莲所而到的再生植株数量相似，且与亲本表型一致性高，并且每个节段的繁殖系数、不定芽诱导率、生根率、移栽存活率均可达到本发明实施例1的铁线莲相似的结果。
因此，本发明的方法所培育的芹叶铁线莲具有非常高的不定芽诱导率、生根率以及移栽存活率。
实施例3
本实施例的步骤与实施例1基本相同，不同之处采用阔叶铁线莲(又名全缘铁线莲)。
实验步骤重复三次，平均每个带节间茎段产生的再生植株数量与本发明实施例1的铁线莲所而到的再生植株数量相似，且与亲本表型一致性高，并且每个节段的繁殖系数、不定芽诱导率、生根率、移栽存活率均可达到本发明实施例1的铁线莲相似的结果。
因此，本发明的方法所培育的阔叶铁线莲具有非常高的不定芽诱导率、生根率以及移栽存活率。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种铁线莲属植物的繁殖方法，其特征在于，包括步骤：
(a)将所述铁线莲属植物的茎段无菌培养获得带腋芽的茎段；
(b)切除所述步骤(a)获得的茎段的腋芽后，将所述茎段进行诱导培养，长出不定芽；和
(c)对所述步骤(b)获得的不定芽进行培养，生根获得植株。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，将所述茎段置于含0.1-10mg/L BA和0.01-1mg/L NAA的ML培养基上，于23±1℃无菌培养，所述茎段萌发获得所述带腋芽的茎段。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，所述诱导培养是指在含0.1-10mg/L BA和0.01-5mg/L NAA的ML培养基上培养所述茎段。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)包括步骤：
(c1)对所述步骤(b)获得的不定芽进行诱导培养至不定芽伸长分节；和
(c2)分离步骤(c1)获得的伸长分节的不定芽，继续培养至生根获得植株。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(c1)中将所述不定芽置于含0.1-20mg/L BA、0.01-5mg/L NAA、和0.01-10mg/L GA3的ML培养基中，于23±1℃进行培养。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(c2)中将伸长分节的不定芽置于含0.5-30mg/L IBA的ML培养基中进行预培养。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(c2)中，伸长分节的不定芽在ML培养基中预培养3-5天后，切除形态学下端茎段，在含0.01-5mg/L IBA的1/2MS培养基中继续培养。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将步骤c)获得的植株进行炼苗后，移植入栽培土中培养的步骤。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述铁线莲属植物选自下组：铁线莲、芹叶铁线莲、阔叶铁线莲、或其组合。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤a)前对所述种子进行消毒的步骤。
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