CN110402818A - 一种优种板栗成熟胚组织培养快繁育苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种优种板栗成熟胚组织培养快繁育苗的方法，包括以下步骤：(1)优种板栗的选取、清洗及消毒；(2)板栗成熟胚的获取及接种；(3)外植体的培养；(4)组培苗的驯化炼苗。本发明提供的方法采用成熟胚作为外植体进行组织培养大大提高了板栗的萌发成苗率、缩短了育种周期、加速了良种繁育，提高了板栗种质创新和新品种选育效率，对推动国家质检总局地理标志产品“罗田板栗”产业发展具有重要意义。

Description

一种优种板栗成熟胚组织培养快繁育苗的方法

技术领域

本发明属于果树培植技术领域，具体涉及一种优种板栗成熟胚组织培养快繁育苗的方法。

背景技术

板栗(Castanea mollissima)为壳斗科(Fagaceae)栗属(Castanea moll)植物，同属植物有7种，分布于亚、欧、美、非4大洲，是重要的生态经济林树种。在栗属植物中，中国板栗在品质、抗病性等利用特性上占居重要的地位。大别山区湖北段地处该省东部，介于北纬30°10′～32°30′、东经112°40′～117°10′之间，该地所属的北亚热带季风气候区形成温暖湿润的气候非常适合板栗生长，板栗种质资源十分丰富。该区的罗田、麻城、大悟、英山4个县市为主产县市，占全区板栗产量的80％以上，其中罗田是板栗的原生地之一，是我国南方板栗的中心主产区。现有种植面积达5万公顷，年产量高达6万吨、系列年产值20亿元，是“全国板栗生产第一县”，产量占湖北省的1/3、全国的5％，系列产值占全县国内生产总值的20.58％。

“桂花香”是罗田板栗的主栽品种，果壳暗紫色，富有光泽，果肉黄色，味甜肉嫩，有桂醇香味，含蛋白质9.1％，淀粉42.7％，总糖含量35.4％。具有果实品质优良、丰产性好、成熟期早、耐旱及耐贮藏等特点，是罗田县最佳板栗品种之一。

湖北省栗园大都是在丘陵地带和山地，有的栗树与其他林木混植，这种复杂的生态环境以及粗放的生产管理容易导致多种病虫害混杂发生，从而影响板栗的质量和产量，造成严重的经济损失。因此，培育抗疫病性的板栗新品种具有重要的生态和经济意义。但实际生产过程中，由于板栗极难生根，扦插繁殖生根率很低，人们普遍沿用实生繁殖的方式，实生后代性状变异复杂，造成良种化程度低。

离体培养技术作为现代育种技术的基础和良种繁育的重要手段，受到了极大青睐。通过组织培养可以快速繁殖，可以克服传统板栗育苗周期长、生根率低、操作繁琐等一系列弊端，建立板栗良种繁育体系。研究表明，植物胚进行离体培养，可以不经过休眠而萌动，克服休眠种子在发育上的障碍，促进胚的生长和缩短育种周期；还能克服种子本身，特别是种皮对胚萌发的抑制作用；不仅如此，还能克服种子的自然不育性。尤其是成熟胚，其能吸收培养基中的无机盐和糖，经过自身代谢作用合成所必须的物质，是进行离体培养的最佳选择。然而，由孙立新等人发明的专利“优种板栗组培快速繁植方法”(CN200410092406.3)和由钟天路等人发明的专利“一种栗子的组织培养技术”(CN201811447190.6)，分别选择以生长活性较强的一年生板栗茎段和带芽茎段作为外植体进行组织培养，虽然最终都得到了板栗幼苗，但是高度分化的茎段需要经过脱分化和再分化才能得到完整植株，该处理过程不仅会增加组织培养的投入，而且其出芽率也会受到影响，从而无法真正实现板栗的高效快繁育苗。因此，亟需一种以板栗成熟胚作为外植体的、高效完善的快速育苗方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种以板栗成熟胚作为外植体的、高效完善的优种板栗成熟胚组织培养快繁育苗的方法。

本发明提供的技术方案如下：

一种优种板栗成熟胚组织培养快繁育苗的方法，包括以下步骤：

(1)优种板栗的选取、清洗及消毒；

(2)板栗成熟胚的获取及接种；

(3)外植体的培养；

(4)组培苗的驯化炼苗。

具体的，

所述步骤(1)中优种板栗为当季采收的饱满、大小一致、无病虫害的罗田“桂花香”板栗，贮藏于0～4℃冷藏柜中备用；

板栗种子的清洗包括以下步骤：选择新鲜健康无裂口的板栗种子在自来水下冲洗20-30min，同时淘汰漂浮的种子。在冲洗过程中轻轻用手搓洗或者用毛刷轻轻刷洗。

板栗种子的消毒包括以下步骤：在超净工作台里，先用75％的酒精充分浸泡2min，无菌水洗2次，再用5％次氯酸钠消毒6-10min，无菌水洗3-5次，用灭菌的吸水纸吸干表面。浸泡过程中需不断摇晃以使种子表面与消毒液充分接触。

具体的，

所述步骤(2)的板栗成熟胚的获取方法：将板栗种子经清洗和消毒处理后，用无菌解剖刀破开并去除表皮，把板栗果实置于75％的酒精充分浸泡2min(处理方法同板栗种子消毒)，用无菌水冲洗3遍；再放入5％的次氯酸钠中浸泡3-5min，浸泡完毕后用无菌水冲洗果实3-5遍，然后置于装有无菌吸水纸的平板中，吸干水分，以胚为中心切成带胚乳的小方块，作为外植体。优选的小方块的大小为0.3cm×0.5cm。

具体的，

所述步骤(2)的板栗成熟胚的接种方法：先将诱导培养基灭菌，用强碱溶液调pH至5.8～6.0，再将成熟胚接种至诱导培养基；所述诱导培养基为木本植物培养基(WPM)+1.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)+0.15mg/L萘乙酸(NAA)+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L。

具体的，所述步骤(3)的外植体培养包括初代培养、继代培养和生根培养。

具体的，

初代培养方法如下：将外植体接种至诱导培养基后，前两周进行暗培养，待胚发芽至2-3cm左右时，移到光照培养室，室温(23±2)℃，空气相对湿度65％左右，每个培养架的光照由3根40W的直管灯管提供，采用每日光培养12-16h和暗培养8-12h的光周期，生长4周，待芽苗高达6-8cm，长出3-4片嫩叶，叶片长度为1～2cm；

具体的，

所述继代培养方法如下：在无菌环境中，将初代培养得到的芽苗裁成包含1～2个腋芽的茎段，然后接种至继代培养基，诱导不定芽萌发，得到丛生芽苗；

所述继代培养的培养基为WPM+1.5mg/L玉米素(ZT)+0.15mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，培养基灭菌前，将pH用1mol/L NaOH调至5.8～6.0。

具体的，

所述生根培养的方法如下：在无菌条件下，用无菌剪刀剪去长度为3-4cm丛生芽苗的基端，接种至生根培养基，1周后转接在1/2WPM培养基上，再培养3天即可生根，平均发根率约为85％。

具体的，所述生根培养的培养基为WPM+0.4～1.2mg/L IBA+0.05mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L；培养基灭菌前，将pH用1mol/L NaOH调至5.8～6.0。其中WPM为木本植物用培养基；IBA为吲哚丁酸，是植物内源生长素，可诱导根原体的形成，促进细胞分化和分裂，有利于新根生成和维管束系统的分化，经过多次实验验证，0.4～1.2mg/L的IBA对板栗丛生芽苗的发根效果最好；NAA为萘乙酸，是植物生长调节剂，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根，经过实验验证，0.05mg/L NAA与0.4～1.2mg/L IBA混合使用可以进一步提高板栗丛生芽苗的生根率。

具体的，所述步骤(4)中驯化炼苗方法如下：当生根苗生长4-6周后，移至温室内按照炼苗技术规程进行炼苗4-8周，然后将炼好的板栗苗进行移栽，再对移栽的板栗苗进行正常的施肥、灌水及病虫害管理。

本发明的有益效果：

(1)以成熟胚作为外植体进行组织培养，大大提高了板栗的萌发成苗率(平均成苗率97％)，

缩短了育种周期；

(2)对生根培养基进行了优化，很大程度上提高了继代芽苗的生根率(平均生根率约为85％)，解决了生根难的问题；

(3)试验材料进行两次消毒，大大降低污染率(平均污染率约为3％)，保证发芽率(平均发芽率约为97％)；

(4)提供了一种外植体萌发率和芽苗生根率高、育种周期短(从板栗外植体萌发至练苗约12周)、良种繁育快的优种板栗成熟胚组织培养的方法，具有较大的应用前景和产业化价值，利用推动大别山区地理标志产品“罗田板栗”产业发展。

附图说明

图1为本发明实施例选用的“桂花香”板栗的外观图；

图2为本发明实例1中板栗成熟胚萌发图；

图3为本发明实例1中板栗成熟胚萌发得到的芽苗；

图4为本发明实例1中腋芽茎段继代培养得到的芽苗；

图5为本发明生根培养后部分根的生长情况；

图6为本发明驯化练苗后得到的部分板栗幼苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步说明，本发明的内容完全不限于此。

实施例1

本实施例以“桂花香”板栗为例，用于说明本发明所述的优种板栗成熟胚组织培养快繁育苗的方法。

包括如下步骤：

(1)优种板栗的选取：选取当季采收的去蓬、饱满、大小一致、无病虫害的罗田“桂花香”板栗，于0～4℃冷藏柜中冷藏备用；图1示出了选取的板栗的外观图；

(2)板栗的清洗、消毒：选择新鲜、健康、无裂口的板栗种子在自来水下冲洗20-30min(轻轻的用手搓洗或者用毛刷轻轻刷洗)，同时淘汰漂浮的种子；在超净工作台里，先用75％的酒精浸泡2min(浸泡过程中需不断摇晃以使种子表面与消毒液充分接触，下同)，无菌水洗2次，再用5％次氯酸钠消毒6min，无菌水洗3次，用灭菌的吸水纸吸干表面备用；

(3)板栗成熟胚的获取：用无菌解剖刀破开并去除表皮，把板栗果实放到75％的酒精浸泡2min，用无菌水冲洗3遍，再放入5％的次氯酸钠中浸泡3min，浸泡完毕后用无菌水冲洗果实5遍，然后放到装有无菌吸水纸的平板中，吸干水分，以胚为中心切成0.3cm×0.5cm带胚乳的小方块，作为外植体；

(4)外植体的接种：将外植体接种至诱导培养基：WPM+1.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)+0.15mg/L萘乙酸(NAA)+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，培养基灭菌前，将pH用1mol/LNaOH调至5.8～6.0；

(5)初代培养：将外植体接种至诱导培养基后，前两周进行暗培养，待胚萌发(萌发率约为96％)，芽苗高达2-3cm时，移到光照培养室，室温(23±2)℃，空气相对湿度65％左右，每个培养架的光照有3根40W的直管灯管提供，采用每日光培养12h和暗培养12h的光周期。生长4周，芽苗高达6-8cm，长出3-4片嫩叶，叶片长度为1～2cm；图2和图3示出了胚萌发及初代培养芽苗生长情况；

(6)继代培养：在无菌环境中，将初代培养得到的芽苗裁成包含1个腋芽的茎段接种至继代培养基(WPM+1.5mg/L玉米素(ZT)+0.15mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，培养基灭菌前，将pH用1mol/L NaOH调至5.8～6.0)诱导不定芽萌发。培养方式同初代培养，培养4周，待不定芽苗株高达4～6cm；图4示出了腋芽茎段继代培养得到的芽苗；

(7)生根培养：在无菌条件下，用无菌剪刀剪去继代培养苗株的基端，接种至生根培养基(WPM+0.4mg/L IBA+0.05mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，培养基灭菌前，将pH用1mol/L NaOH调至5.8～6.0)，1周后转接在1/2WPM培养基上，再培养3天即可生根(生根率约为82％)，图5示出了生根培养后部分根的生长情况；

(8)驯化炼苗：当生根苗生长4周后，移至温室内按照炼苗技术规程进行炼苗8周，然后将炼好的板栗苗进行移栽，按照常规的方法对移栽的板栗苗进行正常的施肥、灌水及病虫害管理，图6示出了驯化练苗后得到的部分板栗幼苗。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于：步骤(2)、(3)板栗种子和板栗果实的消毒方式不同。

具体如下：

步骤(2)：

板栗的清洗、消毒：选择新鲜、健康、无裂口的板栗种子在自来水下冲洗20-30min(轻轻的用手搓洗或者用毛刷轻轻刷洗)，同时淘汰漂浮的种子；在超净工作台里，先用75％的酒精浸泡2min(浸泡过程中需不断摇晃以使种子表面与消毒液充分接触)，无菌水洗2次，再用5％次氯酸钠消毒10min，无菌水洗3次，用灭菌的吸水纸吸干表面备用；

步骤(3)：

板栗成熟胚的获取：用无菌解剖刀破开并去除表皮，把板栗果实放到75％的酒精浸泡2min，用无菌水冲洗3遍，再放入5％的次氯酸钠中浸泡5min，浸泡完毕后用无菌水冲洗果实5遍，然后放到装有无菌吸水纸的平板中，吸干水分，以胚为中心切成0.3cm×0.5cm带胚乳的小方块，作为外植体。

本实施例所采取的种子和成熟胚的消毒方法可以降低污染率至2％，外植体萌发率高达98％。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于：步骤(7)生根培养所用的培养基中IBA的浓度不同。

具体如下：

步骤(7)：

生根培养：在无菌条件下，用无菌剪刀剪去继代培养苗株的基端，接种至生根培养基(WPM+0.8mg/L IBA+0.05mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，培养基灭菌前，将pH用1mol/L NaOH调至5.8～6.0。)，7天后转接在1/2WPM培养基上。

本实施例中，板栗继代芽苗的生根率约为86％。

实施例4

本实施例与实施例4的区别在于：步骤(7)生根培养所用的培养基中IBA的浓度不同。

具体如下：

步骤(7)：

在无菌条件下，用无菌剪刀剪去继代培养苗株的基端，接种至生根培养基(WPM+1.2mg/LIBA+0.05mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，培养基灭菌前，将pH用1mol/L NaOH调至5.8～6.0。)，7天后转接在1/2WPM培养基上。

本实施例中，板栗继代芽苗的生根率约为88％。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明保护的范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内所做的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种优种板栗成熟胚组织培养快繁育苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)优种板栗的选取、清洗及消毒；

(2)板栗成熟胚的获取及接种；

(3)外植体的培养；

(4)组培苗的驯化炼苗。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述步骤(1)中优种板栗为当季采收的饱满、大小一致、无病虫害的罗田“桂花香”板栗，贮藏于0～4℃冷藏柜中备用；

板栗种子的清洗包括以下步骤：选择新鲜健康无裂口的板栗种子在自来水下冲洗20-30min，同时淘汰漂浮的种子；

板栗种子的消毒包括以下步骤：在超净工作台里，先用75％的酒精充分浸泡2min，无菌水洗2次，再用5％次氯酸钠消毒6-10min，无菌水洗3-5次，用灭菌的吸水纸吸干表面。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述步骤(2)的板栗成熟胚的获取方法：将板栗种子经清洗和消毒处理后，用无菌解剖刀破开并去除表皮，把板栗果实置于75％的酒精充分浸泡2min，用无菌水冲洗3遍；再放入5％的次氯酸钠中浸泡3-5min，浸泡完毕后用无菌水冲洗果实3-5遍，然后置于装有无菌吸水纸的平板中，吸干水分，以胚为中心切成带胚乳的小方块，作为外植体。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述步骤(2)的板栗成熟胚的接种方法：先将诱导培养基灭菌，用强碱溶液调pH至5.8～6.0，再将成熟胚接种至诱导培养基；所述诱导培养基为木本植物培养基(WPM)+1.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)+0.15mg/L萘乙酸(NAA)+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)的外植体培养包括初代培养、继代培养和生根培养。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

初代培养方法如下：将外植体接种至诱导培养基后，前两周进行暗培养，待胚发芽至2-3cm左右时，移到光照培养室，室温，空气相对湿度约65％，每个培养架的光照由3根40W的直管灯管提供，采用每日光培养12-16h和暗培养8-12h的光周期，生长4周，待芽苗高达6-8cm，长出3-4片嫩叶，叶片长度为1～2cm。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述继代培养方法如下：在无菌环境中，将初代培养得到的芽苗裁成包含1～2个腋芽的茎段，然后接种至继代培养基，诱导不定芽萌发，得到丛生芽苗。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述继代培养的培养基为WPM+1.5mg/L玉米素(ZT)+0.15mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，培养基灭菌前，将pH用1mol/L NaOH调至5.8～6.0。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述生根培养的方法如下：在无菌条件下，用无菌剪刀剪去长度为3-4cm丛生芽苗的基端，接种至生根培养基，1周后转接在1/2WPM培养基上，再培养3天即可生根，平均发根率约为85％；

所述生根培养的培养基为WPM+0.4～1.2mg/L IBA(吲哚丁酸)+0.05mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L；培养基灭菌前，将pH用1mol/L NaOH调至5.8～6.0。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述步骤(4)中驯化炼苗方法如下：当生根苗生长4-6周后，移至温室内按照炼苗技术规程进行炼苗4-8周，然后将炼好的板栗苗进行移栽，再对移栽的板栗苗进行正常的施肥、灌水及病虫害管理。