CN110367102A - 一种锥栗再生植株与外生菌根真菌共生的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种锥栗再生植株与外生菌根真菌共生的方法，包括如下步骤：S1、锥栗无菌苗的培养；S2、建立锥栗再生体系；S3、外生菌根真菌培养；S4、共生培养。通过建立锥栗再生体系可以保证遗传背景一致，提高实验结果准确性和可重复性。再通过构建共生体系可以方便统计和观察锥栗菌根侵染进程、因外生菌根真菌侵染而导致的根系结构的改变和研究菌根的促生长效应。

Description

一种锥栗再生植株与外生菌根真菌共生的方法
技术领域
本发明涉及栽培技术领域，更具体地，涉及一种锥栗再生植株与外生菌根真菌共生的方法。
背景技术
壳斗科(Fagaceae)的外生菌根(ECM)真菌侵染率能高达90％以上，且在南半球和北半球具有极其丰富的ECM真菌多样性。锥栗(Castanea henryi)为壳斗目(Fagales)壳斗科栗属(Castanea)植物，起源于中国，是我国重要的木本粮食树种之一，主要分布于我国长江以南地区。栗属植物主要生长在营养贫瘠的山地、丘陵或河滩冲积沙地。因此目前，关于栗属菌根效应的研究主要集中在植物对矿质营养(N、P)的吸收、叶片光合作用、对干旱胁迫的抗性及提高幼苗对环境的适应等方面，而对其ECM形成过程中共生体双方的分子机理研究甚少。
试管共生体系的成功建立是研究菌根共生分子机理的前提和关键技术。目前，较为成熟的外生菌根试管共生体系的建立方法是“三明治法”，即在无菌条件下，将无菌苗或组培苗的根放在适宜的共生培养基上，再将培养在玻璃纸上的外生菌根真菌覆盖于植物根上。该方法已被成功地运用在蓝桉(Eucalyptus globulus)与彩色豆马勃(Pisolithustinctorius)、杨树(Populus sp.)与双色蜡蘑(Laccaria bicolor)、海岸松(Pinuspinaster)与滑锈伞(Hebeloma cylindrosporum)的菌根共生分子机理的研究中。该方法的优点是能够准确观察真菌侵染宿主的过程，及宿主植物根系的形态变化，能够最大限度的保证取样时间和部位的准确性。然而，该方法也存在较严重的缺陷，因为根系只是部分与培养基表面接触，根系无法正常自由的生长且生长的空间相当狭小，会给植物根系造成逆境胁迫，在很大程度上影响菌根共生过程的研究。
发明内容
基于此，针对上述“三明治法”的缺陷，提供一种锥栗再生植株与外生菌根真菌共生的方法。
一种锥栗再生植株与外生菌根真菌共生的方法，包括如下步骤：
S1、锥栗无菌苗的培养：将锥栗种子消毒后去皮并切掉部分子叶获得种胚，将所述种胚置于MS培养基中培养获得无菌苗；
S2、建立锥栗再生体系：将所述无菌苗的带芽茎段移入增殖培养基中培养，将培养后的茎段移入促进所述茎段伸长和增粗的培养基中培养获得粗壮的茎段，将所述粗壮的茎段移入生根培养基中诱导生根；
S3、外生菌根真菌培养：将外生菌根真菌置于MMN固体培养基中培养，然后挑取所述外生菌根真菌的菌落边缘的菌块置于灭菌的液体MMN培养基中获得菌液；
S4、共生培养：将生根后的锥栗茎段移入灭菌的共生基质中培养，然后将所述菌液接种于所述锥栗茎段。
在一些实施方式中，所述锥栗种子消毒包括如下步骤：
将锥栗种子依次用自来水冲洗30min、次氯酸钠进行消毒10min；然后用体积分数为75％酒精消毒60s，无菌水冲洗1-3次，每次不小于30s；再用质量浓度为0.1％的氯化汞溶液消毒6min，无菌水冲洗不小于5次。
在一些实施方式中，所述MS培养基包括如下成分：
硝酸铵1.65g/L，硝酸钾1.9g/L，氯化钙0.44g/L，硫酸镁0.37g/L，磷酸二氢钾0.17g/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸5.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，EDTA二钠37.3mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸0.5mg/L，琼脂6.5g/L和蔗糖30g/L；pH为5.8，培养室温度为23-27℃，光照周期为14/10h，光照强度为50mol m- 2s-1。
在一些实施方式中，在步骤S2中，所述增殖培养基中含有如下成分：
上述所述的MS培养基，1mg/L 6-BA，0.02-0.05mg/L IBA和0-0.05mg/L GA3。
在一些实施方式中，在步骤S2中，所述促进所述茎段伸长和增粗的培养基中含有如下成分：
上述所述的MS培养基，2mg/L 6-BA和0.05mg/L IBA。
在一些实施方式中，在步骤S2中，所述生根培养基中含有如下成分：
上述所述的MS培养基和1.5mg/L IBA。
在一些实施方式中，在步骤S3中，所述MMN固体培养基中含有如下成分：
溶液A10mL/L，溶液B、C和D各1mL/L，溶液E 2mL/L，琼脂13g/L，麦芽浸膏3g/L，葡萄糖10g/L和加盐酸调整pH为5.5-5.7；
其中，溶液A包含磷酸氢二铵25g/L、磷酸二氢钾50g/L和氯化钠2.5g/L，溶液B包含硫酸镁1.5g/L，溶液C包含氯化钙0.5g/L，溶液D包含盐酸硫胺素1mg/L，溶液E包含氯化铁0.1g/L。
在一些实施方式中，在步骤S4中，所述共生基质包含如下成分：
泥炭和河沙；其中，泥炭与河沙的体积分数比为3-2:1。
在一些实施方式中，向所述共生基质中添加不含有麦芽浸膏的MMN营养液，所述共生基质与营养液的体积比为3:2，121℃灭菌2次，每次30min。
在一些实施方式中，所述外生菌根真菌选自如下真菌：美味牛肝菌、彩色豆马勃和土生空团菌。
通过建立锥栗再生体系可以保证遗传背景一致，提高实验结果准确性和可重复性。再通过构建共生体系可以方便统计和观察锥栗菌根侵染进程、因外生菌根真菌侵染而导致的根系结构的改变和研究菌根的促生长效应。
本发明具有以下有益效果：
(1)通过本发明构建的锥栗外生菌根共生体系便于追踪和观察菌根形成的发育进程。
(2)宿主植物和真菌在共生基质里的直接接触，为植物根系和真菌的生长提供了相对理想的环境，可以清楚的观察到因外生菌根真菌侵染而导致的根系结构的改变。
(3)宿主植物和真菌在共生基质里的直接接触，最大限度的模拟了野外环境，便于研究菌根的生理效应。
附图说明
图1为本发明公开的一种锥栗再生植株与外生菌根真菌共生的方法的流程示意图；
图2中的A、B、C、D、E、F、G和H为锥栗种胚茎段再生植株培养过程的示意图；
图3中的A、B、C和D为外生菌根真菌的培养的示意图；
图4中的A和B为锥栗与外生菌根真菌共生培养及菌根形态解剖结构。
具体实施方式
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
正如本文中所使用的术语“MS”培养基是无机盐和离子浓度较高，且较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。
正如本文中所使用的术语“EDTA”是乙二胺四乙酸，分子式：C10H16N2O8，白色粉末，能溶于氢氧化钠、碳酸钠及氨溶液中，能溶于160分沸水，微溶于冷水，溶于乙醇、丙酮及部分有机溶剂。
正如本文中所使用的术语“6-BA”是Benzylaminopurine，指6-苄氨基腺嘌呤。6-BA是第一个人工合成的细胞分裂素。具有抑制植物叶内叶绿素、核酸、蛋白质的分解，保绿防老；将氨基酸、生长素、无机盐等向处理部位调运等多种效能，广泛用在农业、果树和园艺作物从发芽到收获的各个阶段。
正如本文中所使用的术语“IBA”是名称又叫吲哚丁酸，人工合成的生长素。主要用于插条生根剂，也可用于冲施，滴灌，冲施肥增效剂、叶面肥增效剂，植物生长调节剂，用于细胞分裂和细胞增生，促进草木和木本植物的根的分生。是植物主根生长促进剂，常用于木本和草本植物的浸根移栽，硬枝杆插，能加速根的生长，提高植物生根的百分率，也可用于植物种子的浸种和拌种，可提高发芽率和成活率。
正如本文中所使用的术语“MMN”培养基是一种营养培养基，营养培养基是在基础培养基中添加一些其它营养物质，如葡萄糖、血液、血清、酵母浸膏等，可供营养要求较高的细菌生长。
培养基的制备
MS培养基：每升培养基包含硝酸铵1.65g、硝酸钾1.9g、氯化钙0.44g、硫酸镁0.37g、磷酸二氢钾0.17g、碘化钾0.83mg、硼酸6.2mg、硫酸锰22.3mg、硫酸锌8.6mg、钼酸钠0.25mg、硫酸铜0.025mg、氯化钴0.025mg、硫酸亚铁27.8mg、EDTA二钠37.3mg、肌醇100mg、甘氨酸2mg、盐酸硫胺素0.1mg、盐酸吡哆醇0.5mg、烟酸0.5mg、琼脂6.5g和蔗糖30g，pH约为5.8。煮沸溶解后，分装于试管中于121℃下灭菌20分钟，冷却备用。
增殖培养基：MS培养基+1mg/L 6-BA+0.05mg/L IBA。
促进茎段伸长和加粗的培养基：MS培养基+2mg/L 6-BA+0.05mg/L IBA。
生根培养基：MS培养基+1.5mg/L IBA。
MMN培养基：配制溶液A，包含磷酸氢二铵25g/L、磷酸二氢钾50g/L、氯化钠2.5g/L。配制溶液B，硫酸镁1.5g/L。配制溶液C，氯化钙0.5g/L。配制溶液D，盐酸硫胺素1mg/L。配制溶液E，氯化铁0.1g/L。取麦芽浸膏3g，葡萄糖10g，溶解于900mL超纯水中，依次加入溶液A10mL，溶液B、C和D各1mL/L，溶液E 2mL/L(边加边搅拌)，定容至1L，加HCl调节pH至5.5～5.7。
参见图1，一种锥栗再生植株与外生菌根真菌共生的方法，包括如下步骤：
1、锥栗无菌苗的培养
1.1 MS培养基的制备，同上述的制备方法。
1.2锥栗种子消毒及种胚培养
将锥栗种子用自来水冲洗30min后，再用NaClO(有效成分2％-3％)进行表面消毒10min，用解剖刀辅助去掉种皮。在超净工作台上，先用75％酒精(v/v)消毒60s，无菌水冲洗3次，每次不少于30s；然后用0.1％(w/v)HgCl2溶液消毒6min，无菌水冲洗不少于5次以除尽HgCl2残余。切掉部分子叶，剩余种胚大小约为1cm3，播种于灭菌后的MS培养基试管中。培养室温度为25±2℃，光照周期为14/10h，光照强度为50mol·m–2·s–1。
2、锥栗再生植株的获得
将锥栗无菌苗的带芽茎段移入增殖培养基中进行增殖培养约4周，将增殖后的茎段移入茎段伸长和加粗培养基中约4周，最后将伸长和加粗的茎段移入生根培养基中诱导生根。生根诱导2周后，即可看到不定根的形成，参见图2。
3、外生菌根真菌培养
3.1 MMN培养基的制备：同上述的制备方法，固体培养基需加13g琼脂，液体培养基则不加琼脂。
3.2液体菌剂制作
将美味牛肝菌、彩色豆马勃和土生空团菌菌株在固体MMN培养基平皿上培养约4周，再用直径为4～5mm的打孔器取菌落边缘活性强的菌块2块，于装有灭菌过的液体MMN锥形瓶中，每瓶约50mL，于摇床中180r/min，25℃，培养约3周待用，参见图3。
4、锥栗与美味牛肝菌、彩色豆马勃和土生空团菌建立共生
准备共生基质，泥炭：河沙＝3～2:1(v/v)，泥炭为德国进口Klasmann。营养液为不含麦芽浸膏的MMN营养液。将基质与营养液3:2体积比混合后，分装于750mL培养瓶中，每瓶约250mL基质，于高压灭菌锅中121℃灭菌30min，两次，冷却备用。
将获得的再生植株，在无菌条件下移栽至共生基质中，注意这一过程要轻且快，减少锥栗根系损伤。
待再生苗于共生基质中适应生长约1个月后，取5～6mL制得的各外生菌根真菌菌液，于无菌条件下，接入锥栗再生苗根系周围。将培养瓶置于培养室中生长，培养室温度为25±2℃，光照周期为14/10h，光照强度为50mol·m–2·s–1。共生培养约2个月后，制作菌根的石蜡切片，可观察到菌根哈氏网的形成，参见图4，说明成功建立了锥栗外生菌根共生体系。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种锥栗再生植株与外生菌根真菌共生的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、锥栗无菌苗的培养：将锥栗种子消毒后去皮并切掉部分子叶获得种胚，将所述种胚置于MS培养基中培养获得无菌苗；
S2、建立锥栗再生体系：将所述无菌苗的带芽茎段移入增殖培养基中培养，将培养后的茎段移入促进所述茎段伸长和增粗的培养基中培养获得粗壮的茎段，将所述粗壮的茎段移入生根培养基中诱导生根；
S3、外生菌根真菌培养：将外生菌根真菌置于MMN固体培养基中培养，然后挑取所述外生菌根真菌的菌落边缘的菌块置于灭菌的液体MMN培养基中获得菌液；
S4、共生培养：将生根后的锥栗茎段移入灭菌的共生基质中培养，然后将所述菌液接种于所述锥栗茎段。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述锥栗种子消毒包括如下步骤：
将锥栗种子依次用自来水冲洗30min、次氯酸钠进行消毒10min；然后用体积分数为75％酒精消毒60s，无菌水冲洗1-3次，每次不小于30s；再用质量浓度为0.1％的氯化汞溶液消毒6min，无菌水冲洗不小于5次。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MS培养基包括如下成分：
硝酸铵1.65g/L，硝酸钾1.9g/L，氯化钙0.44g/L，硫酸镁0.37g/L，磷酸二氢钾0.17g/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸5.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，EDTA二钠37.3mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸0.5mg/L，琼脂6.5g/L和蔗糖30g/L；pH为5.8，培养室温度为23-27℃，光照周期为14/10h，光照强度为50molm-2s-1。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述增殖培养基中含有如下成分：
权利要求3中所述的MS培养基，1mg/L6-BA，0.02-0.05mg/L IBA和0-0.05mg/L GA3。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述促进所述茎段伸长和增粗的培养基中含有如下成分：
权利要求3中所述的MS培养基，2mg/L6-BA和0.05mg/L IBA。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述生根培养基中含有如下成分：
权利要求3中所述的MS培养基和1.5mg/L IBA。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S3中，所述MMN固体培养基中含有如下成分：
溶液A10mL/L，溶液B、C和D各1mL/L，溶液E2mL/L，琼脂13g/L，麦芽浸膏3g/L，葡萄糖10g/L和加盐酸调整pH为5.5-5.7；
其中，溶液A包含磷酸氢二铵25g/L、磷酸二氢钾50g/L和氯化钠2.5g/L，溶液B包含硫酸镁1.5g/L，溶液C包含氯化钙0.5g/L，溶液D包含盐酸硫胺素1mg/L，溶液E包含氯化铁0.1g/L。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤S4中，所述共生基质包含如下成分：
泥炭和河沙；其中，泥炭与河沙的体积分数比为3-2:1。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，向所述共生基质中添加不含有麦芽浸膏的MMN营养液，所述共生基质与营养液的体积比为3:2，121℃灭菌2次，每次30min。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述外生菌根真菌选自如下真菌：美味牛肝菌、彩色豆马勃和土生空团菌。
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