CN107711290B - 菌根食用菌共生苗的培养基及其同步培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了菌根食用菌共生苗的培养基及其同步培养方法，菌根食用菌共生苗的培养基包括菌根食用菌菌种菌丝体培养基和菌根食用菌共生苗合成培养基，菌根食用菌菌种菌丝体培养基包括用于菌丝体扩大繁殖的固体培养基和用于培养菌根共生苗接种用菌丝体的液体培养基。利用上述培养基实施菌根食用菌共生苗合成的同步培养方法包括：（1）菌根食用菌菌种菌丝体的培养方法，（2）菌根食用菌共生苗的同步培养方法。本发明将菌根食用菌菌丝体的培养分为固体培养和液体培养两个阶段，采用液体菌种接种，同时与菌根苗合成培养基中的共生植物共同生长，使菌丝体侵染能力提高了30%以上，接种成功率提高了20%‑30%，共生植物苗和菌根菌的菌丝成活率都提高了20%以上。
Description
技术领域
本发明技术领域属于食用菌栽培生产技术领域，具体涉及菌根食用菌共生苗的培养技术。
背景技术
菌根食用菌如松茸、块菌、牛肝菌、茯苓等是食用菌中一种非常重要的、具有很高食用价值的类群，在生长中与特定种类的共生植物形成共生根系，共同生长，相互供应生长物质，共生共存。这类食用菌需要与活体植物共生，通过活体植物根系接受植物的光合成产物，同时将它本身从土壤中吸收的养分供给活体植物利用，即形成植物-食用菌共生关系。目前人工栽培菌根食用菌共生苗的培养技术还没有实质性突破，产业化开发利用受到限制。通常的做法一般是先培养共生植物苗，以表面灭菌的种子在灭菌的培养基质中培养，将培养好的共生植物苗，接种上菌根食用菌菌种，然后将接种后的植物-菌根食用菌共生苗，在一定的温室或灭菌温室中培养，待菌根苗成长到一定程度大小，将其移植到生产场地，生成食用菌子实体。整个过程主要包括菌根食用菌菌种菌丝体培养，共生植物无菌苗的培育，在共生植物根系接种食用菌菌种，接种后的菌根苗的培养，以及养成的菌根苗移植到生产场地进行出菇培养。
2013年第34卷第1期《四川林业科技》公开的共生植物-菌根食用菌合成苗的制作方法是，收集云南松种子用水选法去除空壳种子，用0．1%的高锰酸钾液浸泡处理30min，然后再用清水浸泡1d～2d，灭菌处理后的云南松种子播入混合基质的培育箱中。培养基质在121℃～126℃的高压灭菌器下灭菌2.5h～3h，放置一周后使用。播种后，用清水将基质浇透后放置于室内催芽，待80%以上的种子发芽后再移入炼苗室内进行无菌苗培育。将培育好的云南松无菌苗浸泡在自来水里至根部基质松解，在适宜的容器内装入上述灭菌基质，至2/3深度，然后用小勺舀一勺约3g接菌剂（菌根食用菌接种菌液），在容器基质表面，将云南松无菌苗栽入，使根部与菌剂接触，然后覆盖基质压紧，用水浇透，将接种苗放置在炼苗室培育半月，期间适当浇水，然后移到温室大棚育苗架上培养6个月。上海农科院食用菌研究所付绍春等人在《食用菌学报》2009年16卷第1期报道了“美味牛肝菌与马尾松幼苗无菌条件下的外生菌根合成”的研究试验，针对菌根合成基质、宿主苗龄和接种方式进行了正交实验,通过对苗成活率、培养6个月的树苗地径和苗高、茎根比、菌根根尖数、菌根感染率6个指标的综合分析,证明在菌根合成中,采用模拟自然土壤结构的二层基质体系的菌根合成效果明显优于目前广泛使用的单层泥炭蛭石基质,且向基质中添加海泡石矿粉更有利于外生菌根菌的形成和发育。
现行的技术存在问题主要是：（1）整个操作过程中难以保证共生植物苗以及培养基质不受到环境中的杂菌污染；（2）所用接种菌液大部分是孢子悬浮液，接种后感染率较低；或者所用接种菌丝体采用固体培养基培养的菌丝体，其接种后的感染成功率也是较低的；（3）现行技术大多是先将共生植物培养成幼苗，再行接种菌丝体，其接种方法较难感染成功，进而，接种后的苗在定植过程中不易成活，特别是菌丝不易定着成活；（4）将接种后的植物苗栽植于培养基质中，再进行浇水，这时容易造成接种的菌种流失乃至死亡，致使植物苗根系接种菌种浓度降低，从而减少共生植物-菌根食用菌共生苗的成活率；（5）所形成的共生苗的培养较难，菌根食用菌种类与特异共生植物对生长基质有特异要求，普通培养基质难于适应菌根共生苗的菌与根的同时生长发育的要求。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术和方法存在的不足，提供一种菌根食用菌共生苗的培养基和同步培养方法，旨在解决现有技术培养菌根食用菌共生苗程序复杂、菌根侵染率低、成活率低等问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
本发明的菌根食用菌共生苗的培养基包括菌根食用菌菌种菌丝体培养基和菌根食用菌共生苗合成培养基。所述菌根食用菌菌种菌丝体培养基包括用于菌丝体扩大繁殖的固体培养基和用于培养菌根共生苗接种用菌丝体的液体培养基。所述菌丝体扩大繁殖的固体培养基由下列成分组成：海藻糖20-25g/L，酵母粉2-6 g/L，蛋白胨1-2 g/L，共生植物树下腐殖土抽提液50ml/L,琼脂15-20 g/L，余量为纯净水，培养基pH值调节至5-6；所述共生苗接种用菌丝体的液体培养基由下列成分组成：海藻糖20-25g/L，酵母粉2-6 g/L，蛋白胨1-2 g/L，共生植物树下腐殖土抽提液50ml/L,余量为纯净水，培养基pH值调节至5-6。
所述菌根食用菌共生苗合成培养基由下列成分组成：3-4份固体培养基质、0.1-0.2份液体营养剂和0.1-0.2份共生植物树下腐殖土抽提液。所述固体培养基质包括下列重量份成分组成：共生植物树下腐殖土3份，草炭土1份；所述液体营养剂包括下列重量份成分组成：海藻糖2-6 g/L，蛋白胨0.2 g/L，酵母膏0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.03-0.08 g/L，KH2PO40.03-0.08 g/L，柠檬酸铁0.01-0.03 g/L，余量为纯净水，pH5-6；所述共生植物树下腐殖土抽提液的制作方法是：将共生植物树下腐殖土用腐殖土重量2-3倍的纯净水在水温35-40℃下浸泡5-8小时，再加热至70-80℃，保持20分钟，用3-5层纱布粗滤后再用0.5μm以下滤网过滤制得。所述共生植物树下腐殖土是取自于菌根食用菌的共生植物种类树的树冠之下范围内，表层1cm-20cm处的腐殖土。
所述菌根食用菌共生苗合成培养基的配制方法是：按重量比将0.1-0.2份液体营养剂和0.1-0.2份共生植物树下腐殖土抽提液顺序加入3-4份固体培养基质中，然后灭菌，灭菌条件，121℃，2.5-3小时。
利用上述制备的菌根食用菌共生苗的培养基，实施菌根食用菌共生苗合成的同步培养方法，包括如下步骤：
（1）菌根食用菌菌种菌丝体的培养方法：
（1.1）无菌条件下将菌根食用菌菌种菌丝体接种在扩大繁殖的固体培养基上，在22-25℃下黑暗或500Lux以下的散光培养30-100天；
（1.2）经（1.1）培养繁殖的菌丝体转入培养菌根共生苗接种用菌丝体的液体培养基中，在22-25℃下黑暗或500Lux以下的散光培养20-70天，培养成菌根食用菌共生苗接种用菌液，备用；
（2）菌根食用菌共生苗的同步培养方法：
（2.1）将共生植物种子先用75%酒精灭菌30-40秒，然后用5%KOH水溶液或0.5-1.0%NaClO灭菌10-25分钟，备用；
（2.2）将（2.1）灭菌后的共生植物种子浸泡1-5天后，放在25℃条件下进行催芽处理，然后播入菌根食用菌共生苗合成培养基中，种子萌芽时，注入（1.2）制备的菌根食用菌共生苗接种用菌液，培养条件为22-25℃下、10-12小时黑暗，12-14小时光照，强度3000-8000Lux，培养80-120天，使共生植物种子与菌根食用菌菌种同步生长，相互共生感染，形成菌根食用菌共生苗。
本发明的有益效果（1）采用本发明的菌根食用菌菌丝体接种液培养基和培养方法，将菌根食用菌菌丝体的培养分为固体培养和液体培养两个阶段，使菌丝体能够生长健壮，具有较高的侵染能力和几率，较现存技术和方法其侵染能力提高了30%以上；（2）本发明采用液体菌种接种，同时与菌根苗合成培养基中的共生植物共同生长，整体接种成功率达到95%以上，比采用固体菌丝体接种成功率提高了20%-30%（现存技术接种过程中，易造成植物根系受伤，影响定植后的成活力，再加上定植培养基不能满足共生苗双方的生长，也影响共生苗成功率）；（3）本发明在菌根共生苗合成的培养基质选择上选用共生植物树下的腐殖土，以及在基本培养基质中添加液体营养剂和共生植物树下的腐殖土抽提液，可使菌丝体的生长活性更好，共生苗生活在原有的共生植物树下的腐殖土环境中，成活率更高，与现存技术相比，共生植物苗和菌根菌的菌丝成活率都提高了20%以上。
具体实施方式
本发明适用于如块菌、牛肝菌、松茸、茯苓、杨树口蘑等菌根食用菌种类的共生苗培养。下面列举实施例。
实施例1
一种马尾松与茯苓菌的菌根共生苗合成的同步培养方法，包括如下步骤：
（1）制备用于菌丝体扩大繁殖的固体培养基称取海藻糖20g，酵母粉2g，蛋白胨1g，马尾松树下腐殖土抽提液50ml,琼脂15g，溶于纯净水中，定容成1L，pH值调节至5，装入试管或培养皿、常规灭菌。
（2）制备用于培养菌根共生苗接种用菌丝体的液体培养基称取海藻糖25g，酵母粉6g，蛋白胨2g，马尾松树下腐殖土抽提液50ml, 溶于纯净水中，定容成1L，pH值调节至5，装入三角培养瓶、常规灭菌。
（3）茯苓菌种接种液培养将茯苓菌丝在无菌条件下接种在（1）制备的固体培养基上，在500Lux以下的散光条件，扩繁培养70天，至菌丝最旺盛阶段，再将培养扩繁的菌丝体转入（2）制备的液体培养基中，在22-25℃下黑暗培养50天，培养成茯苓菌种接种液，备用。
（4）共生植物材料的准备将共生植物马尾松种子先用75%酒精灭菌30-40秒，用灭菌纯净水洗净，再用5%KOH水溶液灭菌10分钟，用灭菌纯净水洗净，然后用灭菌纯净水浸泡2d后，在25℃下进行催芽处理，等待多数种子萌芽时使用。
（5）制备用于共生苗合成培养基使用的固体培养基质取马尾松树下1-20cm范围的腐殖土3份，草炭土1份混合均匀配成。
（6）制备液体营养剂 称取海藻糖4g，蛋白胨0.2 g，酵母膏0.2g，MgSO4·7H2O 0.08g，KH2PO40.03g，柠檬酸铁0.03 g，溶解在1L的纯净水中，pH值调节至5。
（7）制备马尾松树下腐殖土抽提液 取自于马尾松树的树冠之下范围内，表层1cm-20cm处的腐殖土1公斤，用40℃的2公斤纯净水浸泡8小时，再加热至70℃浸泡20分钟，然后用5层纱布粗滤后、再用0.5μm以下滤网过滤制得。
（8）制备菌根食用菌共生苗合成培养基将0.1份（6）制备的液体营养剂和0.2份（7）制备的马尾松树下腐殖土抽提液顺序加入3份（5）制备的固体培养基质中，然后灭菌即可，灭菌条件，121℃，2.5小时。
（9）菌根食用菌共生苗同步培养将（4）制备的、刚刚萌芽的马尾松种子播入（8）制备的菌根食用菌共生苗合成培养基中，同时注入（3）制备好的茯苓菌种接种液，培养条件为22-25℃下、12小时黑暗， 12小时光照，强度5000Lux，培养100天，形成马尾松与茯苓菌的菌根共生苗。
实施例2
一种杨树与杨树口蘑的菌根共生苗合成的同步培养方法，包括如下步骤：
（1）制备用于菌丝体扩大繁殖的固体培养基 称取海藻糖24g，酵母粉4g，蛋白胨1.5g，杨树下腐殖土抽提液50ml,琼脂18g，溶于纯净水中，定容成1L，pH值调节至5，装入试管或培养皿、常规灭菌。
（2）制备用于培养菌根共生苗接种用菌丝体的液体培养基 称取海藻糖22g，酵母粉3g，蛋白胨1.2g，杨树下腐殖土抽提液50ml,溶于纯净水中，定容成1L，pH值调节至5，装入三角培养瓶、常规灭菌。
（3）杨树口蘑菌种接种液培养 将杨树口蘑菌丝在无菌条件下接种在（1）制备的固体培养基上，在22-25℃下黑暗条件，扩繁培养85天，再将培养扩繁的菌丝体转入（2）制备的液体培养基中，在500Lux以下的散光培养30天，培养成杨树口蘑菌种接种液，备用。
（4）共生植物材料的准备 将共生植物杨树种子先用75%酒精灭菌30秒，用灭菌纯净水洗净，再用0.5% NaClO灭菌10分钟，用灭菌纯净水洗净，然后用灭菌纯净水浸泡2d后，在25℃下进行催芽处理，等待多数种子萌芽时使用。
（5）制备固体培养基质 取杨树下腐殖土3份，草炭土1份混合均匀配成。
（6）制备液体营养剂 称取海藻糖5g，蛋白胨0.2 g，酵母膏0.2g，MgSO4·7H2O 0.05g，KH2PO40.06g，柠檬酸铁0.02 g，溶解在1L的纯净水中，pH值调节至5。
（7）制备杨树下腐殖土抽提液 取自杨树的树冠之下范围内，表层1cm-20cm处的腐殖土1公斤，用35℃的3公斤纯净水浸泡5小时，再加热至80℃浸泡20分钟，然后用4层纱布粗滤后、再用0.5μm以下滤网过滤制得。
（8）制备菌根食用菌共生苗合成培养基 将0.1份（6）制备的液体营养剂和0.2份（7）制备的杨树下腐殖土抽提液顺序加入3份（5）制备的固体培养基质中，然后灭菌即可，灭菌条件121℃，2.5小时。
（9）菌根食用菌共生苗同步培养 将（4）制备的、刚刚萌芽的杨树种子播入（8）制备的菌根食用菌共生苗合成培养基中，同时注入（3）制备好的杨树口蘑菌种接种液，培养条件为22-25℃下、10小时黑暗， 14小时光照，强度5000Lux，培养85天左右，形成杨树与杨树口蘑的菌根共生苗。
Claims (2)
1.菌根食用菌共生苗合成的同步培养方法，包括如下步骤：
(1)菌根食用菌菌种菌丝体的培养方法：
(1.1)无菌条件下将菌根食用菌菌种菌丝体接种在扩大繁殖的固体培养基上，在22-25℃下黑暗或500Lux以下的散光培养30-100天；
(1.2)经(1.1)培养繁殖的菌丝体转入培养菌根共生苗接种用菌丝体的液体培养基中，在22-25℃下黑暗或500Lux以下的散光培养20-70天，培养成菌根食用菌共生苗接种用菌液，备用；
(2)菌根食用菌共生苗的同步培养方法：
(2.1)将共生植物种子先用75％酒精灭菌30-40秒，然后用5％KOH水溶液或0.5-1.0％NaClO灭菌10-25分钟，备用；
(2.2)将(2.1)灭菌后的共生植物种子浸泡1-5天后，放在25℃条件下进行催芽处理，然后播入菌根食用菌共生苗合成培养基中，种子萌芽时，注入(1.2)制备的菌根食用菌共生苗接种用菌液，培养条件为22-25℃下、10-12小时黑暗，12-14小时光照，强度3000-8000Lux，培养80-120天，使共生植物种子与菌根食用菌菌种同步生长，相互共生感染，形成菌根食用菌共生苗；
所述菌根食用菌共生苗合成培养基由下列成分组成：3-4份固体培养基质、0.1-0.2份液体营养剂和0.1-0.2份共生植物树下腐殖土抽提液。
2.根据权利要求1所述的菌根食用菌共生苗合成的同步培养方法，其特征在于，所述菌根食用菌共生苗合成培养基的配制方法是：按重量比将0.1-0.2份液体营养剂和0.1-0.2份共生植物树下腐殖土抽提液顺序加入3-4份固体培养基质中，然后灭菌，灭菌条件，121℃，2.5-3小时。
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