CN106576910B - 离体无菌寄主植物-菌根食用菌共生苗的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种离体无菌寄主植物‑菌根食用菌共生苗的培养方法和培养容器，所述这的培养方法包括：（1）准备离体无菌培养寄主植物；（2）无菌精准接种；（3）寄主植物‑菌根食用菌共生苗培养。所述的培养容器包括透明的容器、容器盖和三角形固定架，容器盖设有过滤通气窗，容器底部设有一个三角形固定架，三角形固定架上部设置一个带有缺口的圆形环，圆形环上部设有若干向外、固定弹性胶圈的小钩。本发明可以在温度、湿度和光照可控的环境条件下培育出寄主植物系统，使快速大量繁育共生苗成为现实，较现有技术的繁育速度提高了3‑12倍，接种成功率提高了1.6‑2.5倍，接种后寄主植物‑菌根食用菌共生苗的生成率较现有技术提高了30%‑50%。

Description

离体无菌寄主植物-菌根食用菌共生苗的培养方法

技术领域

本发明属于食用菌生产技术领域，尤其是涉及一种寄主植物-菌根食用菌共生苗培育技术。

背景技术

松茸、块菌、牛肝菌等菌根性食用菌与双孢蘑菇、香菇、平菇等腐生菌不同，菌根性食用菌是食用菌中重要的一类，它着生于活体植物的根系上，通过活体植物根系接受植物的光合成产物，同时将它本身从土壤中吸收的养分供给活体植物利用，即形成植物-食用菌共生关系。目前人工栽培是非常困难的。通常的做法一般是先培养寄主植物苗，以表面灭菌的种子在灭菌的培养基质中培养，将培养好的寄主植物苗，接种上菌根食用菌菌种，然后将接种后的寄主植物-菌根食用菌共生苗，在一定的温室或灭菌温室中培养，待菌根苗成长到一定程度大小，将其移植到生产场地，生成食用菌子实体。整个过程主要包括寄主植物无菌苗的培育，在寄主植物根系接种食用菌菌种，接种后的菌根苗的培养，以及养成的菌根苗移植到生产场地进行出菇培养。2013年第34卷第1期四川林业科技报道林强的研究事例，其寄主植物-菌根食用菌合成苗的制作方法是，收集云南松种子用水选法去除空壳种子，用0．1%的高锰酸钾液浸泡处理30min，然后再用清水浸泡1d～2d，灭菌处理后的云南松种子播入混合基质的培育箱中，培养基质在121℃～126℃的高压灭菌器下灭菌2.5h～3h放置一周后使用，播种后，用清水将基质浇透后放置于室内催芽，待80%以上的种子发芽后再移入炼苗室内进行无菌苗培育。将培育好的云南松无菌苗浸泡在自来水里至根部基质松解，在适宜的容器内装入上述灭菌基质，至2/3深度，然后用小勺舀一勺约3g接菌剂（菌根食用菌接种菌液），在容器基质表面，将云南松无菌苗栽入，使根部与菌剂接触，然后覆盖基质压紧，用水浇透，将接种苗放置在炼苗室培育半月，期间适当浇水，然后移到温室大棚育苗架上培养6个月。然而，现有技术存在的问题有：（1）寄主植物种子只能表面灭菌，以及寄主植物苗在培育过程中环境，尽管可以事先灭菌处理，但整个生长过程中难以做到真正的无菌培养，如空调的空气流动，人员的操作传染，以及温室角落的均无繁衍等等，因此容易造成杂菌污染。(2)寄主植物苗培养成功后，需要在寄主植物苗的根系上接种菌根食用菌的菌种，其接种方法一般是将植物根系在接种液中浸染，或者在植物根系造成创伤，如剪短一部分根系、剥皮、刺伤等，在创伤的部位接种菌种。然而这些方法难以确保在植物苗根系上确切接种成功，即接种成功率较低.(3)将接种后的植物苗栽植于培养基质中，这时容易造成接种的菌种流失乃至死亡，致使植物苗根系接种菌种浓度降低，从而减少寄主植物-菌根食用菌共生苗的成活率。(4)接种后的寄主植物-菌根食用菌共生苗，一般放在温、湿、光等可控条件下的温室中培养，这种温室事先是可以进行灭菌处理的，但是这种温室难以保证在寄主植物-菌根食用菌共生苗整个生育期间是无菌条件的。(5)菌根性食用菌其特点之一就是菌丝生长速度很慢，整个培育期将是长期的,在这个长期的培育过程中，培养基质的水分管理是十分困难的和难以准确掌握的，常常造成接种成功的寄主植物-菌根食用菌共生苗衰败和死亡。

发明内容

针对目前现行的寄主植物-菌根食用菌共生苗培养方法存在的缺陷，本发明的目的是提供一种离体无菌寄主植物-菌根食用菌共生苗的培养方法,该方法使寄主植物-菌根食用菌共生苗在全生长过程处于无菌可控条件下生长发育，可以达到在离体无菌条件培育出寄主植物系统，接种菌根食用菌菌种，形成离体无菌条件下的寄主植物-菌根食用菌共生苗系统。

为实现上述目的，本发明采用了下列技术方案。

一种离体无菌寄主植物-菌根食用菌共生苗的培养方法，包括如下步骤：

（1）准备离体无菌培养寄主植物系选择具有寄主植物-菌根食用菌共生关系的植物，在无菌条件下摘取植物茎尖生长点进行离体培养，继而诱导植物发根，形成完整的寄主植物苗系统；

（2）无菌精准接种用无菌微型接种注射器吸取特定寄主植物-菌根食用菌关系的菌种菌源液，精准地将菌种接入步骤（1）培养的植物根系的表皮皮层组织中，然后将接种口用凝胶剂包埋好，形成离体无菌寄主植物-菌根食用菌共生苗系统；

（3）寄主植物-菌根食用菌共生苗培养 将步骤(2)接种后的共生苗放在离体无菌寄主植物-菌根食用菌共生苗的培养容器中，固定共生苗于培养容器中的三脚架中，共生苗的根尖部放在培养基上，要使接种口与培养基面保持一定的距离，避免接种口接触培养基质而造成接种菌种扩散，并且不使其倒伏，也不使其下坠,在特定的寄主植物-菌根食用菌共生适宜的培养基种类及培养条件下，培养形成可用于生产的寄主植物-菌根食用菌共生苗。

一种离体无菌寄主植物-菌根食用菌共生苗的培养容器，包括透明的容器、容器盖和三角形固定架，容器盖设有过滤通气窗，容器底部设有一个三角形固定架，三角形固定架顶部设置一个带有缺口圆形环，缺口圆形环上设有若干向外、固定弹性胶圈的小钩。

使用离体无菌寄主植物-菌根食用菌共生苗的培养容器时，在容器中倒入培养基后灭菌、灭菌后冷却，无菌条件下将寄主植物-菌根食用菌共生苗移入容器中，将共生苗的茎部从圆形环的缺口处移入圆形环中，用无菌的弹性胶圈在缺口圆形环上的小钩与共生苗茎部间循环绕，固定共生苗不倒伏、不下坠，盖上容器盖即可。

本发明的有益效果：

（1）采用本发明的培养方法，可以在无菌、温度湿度和光照可控的环境条件下培育出寄主植物系统，使快速大量繁育共生苗成为现实，本发明较现有技术的繁育速度提高了3-12倍。

（2）采用本发明无菌微型接种注射器接种，可以精确地在寄主植物根系的表皮皮层组织内部注入接种菌源，较现有技术的接种成功率提高了1.6-2.5倍，接种后寄主植物-菌根食用菌共生苗的生成率较现有技术提高了30%-50%。

附图说明

图1为本发明的寄主植物-菌根食用菌共生苗培养容器示意图。

图2为本发明的接种方法示意图。

图中：1、容器，2、容器盖，3、三角形固定架，4、缺口圆形环，5、小钩，6、弹性胶圈，7、过滤通气窗，8、共生苗， 9、培养基，10、寄主植物根系，11、微型接种注射器。

具体实施方式

本发明适用于如块菌、牛肝菌、松茸、茯苓等菌根食用菌种类的共生苗培养，。其主要的技术环节是：（1）根据菌根食用菌的种类选择适当的寄主植物种类，如块菌的共生寄主植物是栎树、榛子树、云南松等；（2）对应寄主植物种类采用适当的茎尖组织培养方法，包括茎尖培养基种类、生根培养基种类以及培养条件等，如适合于木本植物的培养基有WPM、MS、B5、White、Heller等；（3）使用无菌微型接种注射器，严格实行精准的接种方法；（4）使用本发明的培养容器，正确使用接种后的培养方法和操作步骤；（5）整个培养过程要在完全无菌条件下完成。

实施例1

一种离体无菌寄主植物-菌根食用菌共生苗的培养容器，包括透明的容器1、容器盖2和三角形固定架3。所述的三角形固定架3设置在容器1的底部，三角形固定架3顶部设有一个带有缺口的圆形环4，缺口的圆形环4上设有若干向外、固定弹性胶圈6的小钩5。所述的容器盖2的中央设有过滤通气窗7。

实施例2

一种栎树与块菌的离体无菌共生苗的培养方法，包括如下步骤：

（1）寄主材料的准备将栎树(辽东栎或栓皮栎)枝条截成1寸长的小段，每段枝条含有一个腋芽，去除叶片叶柄，用清水洗净，再用70%酒精进行表面灭菌30秒，然后用灭菌水清洗3遍，再用0.1%次氯酸钠灭菌3-5分钟，倒掉次氯酸钠，用灭菌水冲洗3次，备用。

(2)培养基配制选择适合于栎树茎尖培养的WPM培养基作为基本培养基，添加0.2-0.5%的6-BA、3%蔗糖和15g/L琼脂粉，用NaOH或HCl调整pH值为6.5-7.0。培养基分装于150-180mm×180mm试管中，每只试管分装培养基10ml，在高压灭菌锅中121℃，20分钟高压灭菌。灭菌后将培养基取出，摆成斜面，备用。

(3)寄主植物离体培养将(1)准备好的栎树枝条小段，在无菌超净工作台中显微镜下，摘取0.5mm左右的茎尖，放入试管培养基，在无菌培养室中，25℃、16小时光照条件下进行离体培养，6周后，移植到新的同成份的瓶装培养基（250ml瓶，每瓶装40ml培养基中，进行继续培养，培养条件为25℃、16小时光照，每6周转移一次新培养基继续培养，直至将离体培养组织培育成栎树小苗（无根）形态。然后将栎树小苗移植到发根培养基（250ml瓶，每瓶装40ml培养基）中进行诱导发根。发根培养基为WPM培养基作为基本培养基，添加0.2-0.5%的IBA和0.1%的NAA，3%蔗糖，15g/1L琼脂粉，调整PH值为6.5-7.0。培养条件为25℃、16小时光照。

（4）块菌接种液配制将储存于冷冻冰箱的洗净过的块菌子囊果取出，室温下自然解冻，超净工作台中用无菌水洗过，用0.1%次氯酸钠表面灭菌3-5分钟，再用无菌水冲洗干净。然后进行组织分离，将菌块切开，取中间部分的子实体果肉分离到事先准备好的液体PDA培养基（300ml三角瓶，培养基量100ml）中，在摇床上进行振动培养，制成块菌接种液，备用。

（5）接种无菌条件下将(3)培养好的栎树无菌苗从培养基中取出，洗净根系培养基残渣，用无菌微型接种注射器吸入（4）准备好的块菌接种液，刺入栎树无菌苗根系的表皮，将接种菌液注入植物根系表皮组织中，再将接种口用凝胶剂包埋好。

（6）共生苗培养将（5）接种后的栎树-块菌共生苗，放入本发明的离体无菌寄主植物-菌根食用菌共生苗的培养容器中，用弹性胶圈固定共生苗于培养容器中的三脚架中，共生苗的根尖部放在培养基上，以使其可以吸收培养基的营养。要使共生苗的根系接种口与培养基面保持一定的距离，避免接种口接触培养基质而造成接种菌种扩散，并且不使共生苗倒伏，也不使其下坠。培养基为WPM培养基作为基本培养基，添加3%蔗糖，15g/1L琼脂粉，调整PH值为6.5-7.0。在温度25℃，5000Lx，16小时光照，无菌条件下，培养形成离体无菌的寄主植物-菌根食用菌共生苗。

实施例3

一种山杨树与美味牛肝菌的离体无菌共生苗的的培养方法，包括如下步骤：

（1）寄主植物材料的准备山杨树是美味牛肝菌的寄主植物之一，选择山杨树带叶芽枝条，将其枝条按实施例1步骤（1）方法，进行枝条整理，并进行洗净，表面灭菌，备用。

（2）培养基配制适合于寄主植物的培养基是关键，山杨树的适宜培养基是MS+0.3-0.5%6-BA+3%蔗糖+15g/L琼脂粉，pH值为6左右。按实施例1步骤（2）配制方法制作，灭菌后备用。

（3）寄主植物离体培养将上述(1)的山杨树枝条小段，在无菌超净工作台中显微镜下，摘取0.5mm左右的茎尖，放入（2）培养基，在无菌培养室中，25℃，16小时光照条件下离体培养。6周后，移植到新的同成份的瓶装培养基（250ml瓶，每瓶装40ml培养基）中，进行继续培养，培养条件不变。每6周转移一次至新培养基中进行培养，直至将离体培养枝条培育成稳定的小苗（无根）形态。将培养好的山杨树苗在发根培养基中诱导发根。发根培养基为MS+0.5-1.0%的IBA+3%蔗糖+15g/1L琼脂粉，pH值为6，发根培养条件为25℃、16小时光照。

（4）美味牛肝菌接种液配制在超净工作台中，选用300ml三角瓶，放入无菌水100ml左右，将美味牛肝菌菌丝取出，放入无菌水三角瓶中稀释，在摇床上进行振动摇匀，制成接种液，备用。

（5）接种将培养好的山杨树的离体无菌培养苗从培养基中取出，洗净根系培养基残渣。用无菌微型接种注射器进行接种，方法同实施例1步骤（5），接种后将接种口用凝胶剂包埋好。

6. 共生苗培养将完成接种的山杨树-美味牛肝菌共生苗，放入本发明的寄主植物-菌根食用菌共生苗培养容器中，用弹性胶圈固定共生苗于培养容器中的三脚架中，共生苗的根尖部放在培养基上，以使其可以吸收培养基的营养。要使共生苗的根系接种口与培养基面保持一定的距离，避免接种口接触培养基质而造成接种菌种扩散，并且不使共生苗倒伏，也不使其下坠。培养基为MS+3%蔗糖+15g/1L琼脂粉，PH值为6-6.5，培养条件温度25℃，光照5000 Lx，16小时，无菌。

Claims (1)

1.一种离体无菌寄主植物-菌根食用菌共生苗的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）准备离体无菌培养寄主植物系选择具有寄主植物-菌根食用菌共生关系的植物，在无菌条件下摘取植物茎尖生长点进行离体培养，继而诱导植物发根，形成完整的寄主植物苗系统；

（2）无菌精准接种 用无菌微型接种注射器吸取特定寄主植物-菌根食用菌关系的菌种菌源液，精准地将菌种接入步骤（1）培养的植物根系的表皮皮层组织中，然后将接种口用凝胶剂包埋好，形成离体无菌寄主植物-菌根食用菌共生苗系统；

（3）寄主植物-菌根食用菌共生苗培养 将步骤(2)接种后的共生苗放在离体无菌寄主植物-菌根食用菌共生苗的培养容器中，固定共生苗于培养容器中的三脚架中，共生苗的根尖部放在培养基上，使其能够吸收营养基的营养，要使接种口与培养基面保持一定的距离，避免接种口接触培养基质而造成接种菌种扩散，并且不使其倒伏，也不使其下坠,在特定的寄主植物-菌根食用菌共生适宜的培养基种类及培养条件下，培养形成可用于生产的寄主植物-菌根食用菌共生苗；

所述的离体无菌寄主植物-菌根食用菌共生苗的培养容器，包括透明的容器、容器盖和三角形固定架，所述的三角形固定架设置在容器的底部，三角形固定架顶部设有一个带有缺口的圆形环，缺口的圆形环上设有若干向外、固定弹性胶圈的小钩；所述的容器盖的中央设有过滤通气窗，使用离体无菌寄主植物一菌根食用菌共生苗的培养容器时，在容器中倒入培养基后灭菌、灭菌后冷却，无菌条件下将寄主植物一菌根食用菌共生苗移入容器中，将共生苗的茎部从圆形环的缺口处移入圆形环中，用无菌的弹性胶圈在缺口圆形环上的小钩与共生苗茎部间循环绕，固定共生苗不倒伏、不下坠，盖上容器盖即可。

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