CN106358661B - 一种根瘤菌母种的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种根瘤菌母种的培育方法，包括菌种驯化培养步骤，所述菌种驯化培养：在模拟的目标环境中，通过环境筛选、拮抗竞争、适者生存的方法汰劣选优，发现、培育与目标环境和品种匹配的菌种；本发明较好解决了根瘤菌适应性差和豆科植物接种结瘤率低的问题，使根瘤菌的作用充分发挥，产品达到有机农产品的要求，成本低，产量高，效益好。

Description

一种根瘤菌母种的培育方法

技术领域

本发明涉及一种根瘤菌母种的培育方法。

背景技术

豆科作物具有利用根瘤菌结瘤固氮的特性，适宜条件下作物自身固氮可满足50-70%的需求。然而根瘤菌具有品种、环境等专一性的特点，在豆类蔬菜上表现尤其突出。生产上普遍存在着豆类蔬菜不结根瘤、根瘤菌肥效果差的现象。特别是在已消毒处理的基质上进行无土栽培，现有菌肥几无效果。究其原因是菌种适应性问题，进一步说是母种培育方法问题。现有根瘤菌肥母种，采取的是“菌种采集-培养基培养-优势株筛选-优势株扩繁”培育路径，其生长环境是温箱、培养基，择优标准是菌落长势，对生长环境、作物品种缺乏针对性，所制菌肥无法解决根瘤菌专一性的问题。破解这一技术难题，亟需一种快速、便捷、有效的菌种选育方法，及时为各种环境、作物、品种生产出具有专一性的根瘤菌肥。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种根瘤菌母种的培育方法，较好解决了根瘤菌适应性差和豆科植物接种结瘤率低的问题，使根瘤菌的作用充分发挥，产品达到有机农产品的要求，成本低，产量高，效益好。

为解决上述问题，本发明采用以下技术方案：一种根瘤菌母种的培育方法，包括菌种驯化培养步骤。

作为上述技术方案的进一步改进：

所述菌种驯化培养：在模拟的目标环境中，通过环境筛选、拮抗竞争、适者生存的方法汰劣选优，发现、培育与目标环境和品种匹配的菌种。

所述菌种驯化培养步骤包括如下步骤：

首轮：将菌种土与目标土壤（基质）按1:1比例拌匀装盆，将目标品种播入盆中，每盆视盆径大小播10-20粒种子，出苗后视苗情和位置留5-10株；管理同常规，至花荚期首轮结束；

首轮结束后取出植株观察根部结瘤情况，结瘤良好的转入次轮；结瘤差或不结瘤的更换菌种地块土壤重复首轮步骤。

所述菌种驯化培养步骤包括如下步骤：

次轮：将首轮使用的盆土连同根瘤一半留存备用，另一半与等量目标土壤（基质）拌匀装盆，盆内继续种植首轮相同品种，操作同首轮；

若遇结瘤差或不结瘤，用备用盆土加半量目标土壤（基质）重复次轮过程。

所述菌种驯化培养过程一般持续3-5轮，时间持续半年到一年。

包括模拟环境条件步骤：模拟环境条件从土壤（或基质）和品种两个方面确定，土壤（或基质）环境通过目标土壤（或基质）占比倍数递增、菌种土壤倍数递减的方式逐步过渡。

所述模拟环境条件用盆栽的方式，通过3-5个组合梯度递进到目标环境模拟样本。

包括菌种选取步骤：菌种地的标准是：①长期进行同类豆科作物生产，以种植豆类作物不低于5年的老园土作为菌种选取对象，上茬豆类作物结瘤状况良好；②没有土传或流行病虫害，近期也没有使用过杀菌剂；③土壤、基质类型与目标环境（土壤、基质）近似，有机质含量、PH值、电导率等主要理化指标差相对值不超过50%；④土样要尽可能新鲜，久置或长距离运输要保持5-10℃低温和60-90%的相对湿度。

包括优势株筛选步骤：通过优势植株选优势菌株的方法选择菌种，优势植株选择要在豆科花荚期之后，先将盆土（基质）连同豆株根茎一起倒出，破碎土块后轻轻分离各个植株，逐一比较鉴定后选出优势植株。

包括母种组配与复选步骤：将2株以上的优势植株的根瘤菌组配，得复合母菌种，将2株以上优势植株的根瘤连同生根段取下，经消毒研磨后进行摇床培养即成母种。

本发明优点表现为：

1、菌种针对性强、适应性好。具有含菌量较大、菌种谱范围较广的特点，克服了直接从植株或菌肥取种菌谱范围窄、适应力弱的缺点，与新环境、新品种互接成功的概率大大提高,其产品投入生产，一般豆科作物接种成功率都在80%以上。

2、效率高，培育时间较短。 由于驯化过程可在大棚或室内开展，一年四季都可进行；由于采取的是盆栽形式，不怕交叉污染，可多品种、多类别、多样本同时进行。尽管需要模拟目标环境进行多轮驯化，但省却了回接试验环节，单个菌种的培养耗时不长，为3-4个生长季，相同工作团队、单位时间内育成菌种的个数极大增加。

3、条件要求不严，投入少。该方法不怕杂菌污染，不需无菌实验室及接种箱等，菌种驯化可利用生产大棚一隅进行，驯化过程在盆内开展，菌种扩繁阶段也只需基本的消毒和摇床培养设备，设备投入少，生产成本低，投入与成本均不及常规培养的一半。

4、操作简单，人员要求低。由于省去了试管和培养皿的无菌培养，整个过程变得直观简单，无需专业的技术人员，熟练技术工人经过简单培训即能操作。

5、省工、节地。由于采用了盆栽方式和先诱导后选优、以优势植株选优势菌株的制种方法，极大减少了土地的使用，选种、试验的工作量也相应减少。

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。

具体实施方式

实施例，一种根瘤菌母种的培育方法，包括如下步骤：

1、菌种选取。菌种地的标准是：①长期进行同类豆科作物生产，以种植豆类作物不低于5年的老园土作为菌种选取对象，上茬豆类作物结瘤状况良好；②没有土传或流行病虫害，近期也没有使用过杀菌剂；③土壤、基质类型与目标环境（土壤、基质）近似，有机质含量、PH值、电导率等主要理化指标差相对值不超过50%；④土样要尽可能新鲜，久置或长距离运输要保持5-10℃低温和60-90%的相对湿度。

取15㎝以上熟土，体量大于培养容器容积，拣出石块及残留作物根茎叶等，破碎备用。

2、模拟环境条件。模拟环境条件从土壤（或基质）和品种两个方面确定。土壤（或基质）环境通过目标土壤（或基质）占比倍数递增、菌种土壤倍数递减的方式逐步过渡；目标品种则直接选择当家品种或主推品种。

用盆栽的方式，通过3-5个组合梯度递进到目标环境模拟样本，形成菌种生存条件由老园土到目标环境的阶梯组合。

3、菌种驯化培养。在模拟的目标环境中，通过环境筛选、拮抗竞争、适者生存的方法汰劣选优，发现、培育与目标环境和品种匹配的菌种。

为便于管理和观察，驯化培养在具有较好透气性的泥盆中进行，泥盆体积要＞2L，驯化培养步骤如下：

首轮：将菌种土与目标土壤（基质）按1:1比例拌匀装盆，将目标品种播入盆中，每盆视盆径大小播10-20粒种子，出苗后视苗情和位置留5-10株。管理同常规，至花荚期首轮结束。

首轮结束后取出植株观察根部结瘤情况，结瘤良好的转入次轮；结瘤差或不结瘤的更换菌种地块土壤重复首轮步骤。

次轮：将首轮使用的盆土连同根瘤一半留存备用，另一半与等量目标土壤（基质）拌匀装盆，盆内继续种植首轮相同品种，操作同首轮。

若遇结瘤差或不结瘤，用备用盆土加半量目标土壤（基质）重复次轮过程。

以后各轮操作同次轮。

驯化过程一般持续3-5轮，时间持续半年到一年。

4、优势株筛选。通过优势植株选优势菌株的方法选择菌种。优势植株标志包括：植株枝叶茎生长量、根瘤菌数量、根瘤大小、根瘤活性等。标准是：植株枝叶生长旺盛，根茎粗壮；结瘤数量多，花荚期单株结瘤10个以上；结瘤大，直径＞5㎜的数量占1／3以上；根瘤活力强，外观饱满，汁液鲜艳。

优势植株选择要在豆科花荚期之后，先将盆土（基质）连同豆株根茎一起倒出，破碎土块后轻轻分离各个植株，逐一比较鉴定后选出优势植株。

5、母种组配与复选。将2株以上的优势植株的根瘤菌组配，得复合母菌种。将2株以上优势植株的根瘤连同生根段取下，经消毒研磨后进行摇床培养即成母种。母种通过规模生产适应性检验，并从中发现优势菌株，以此进一步丰富母种菌群。个别表现特别突出的，可独立组成新的母种。

6、母种的适应性检验。将根瘤菌母种使用于目标土壤（基质）、目标品种生产，表现良好即可将母种用于根瘤菌肥生产。整体表现欠佳时，通过挑选大田优势株的优势根瘤，组合成新原种，重复步骤5、6培育新的母种。

以芸豆无土栽培基质根瘤菌母种培育为例：

1、菌种采集。于芸豆花荚期后到芸豆主产区选择长势良好，结根瘤较多且无病的地块，刮去表土，取15㎝以内土层土壤2-3L，除去杂物后用保湿遮光包装袋带回实验场地备用。

2、品种、基质模拟设计。选“九粒白”为目标品种，以芸豆无土栽培基质为目标基质，进行三轮驯化。以深、宽各30㎝的泥盆为栽培容器。以温室大棚为育种场地，设三次重复。

3、驯化培养。①将菌种土与基质按1:1混合均匀后装入盆内达7成满，将10粒芸豆种子按常规处理后均匀播入盆内，用混合土覆盖种子至盆8成满后置于大棚，出苗后选留5-7株。其他管理同常规。花荚期后，将盆土连同植株一同倒出，观察结瘤状况，正常结瘤转入下一步。不结瘤重复上述操作，同时将基质减半。②将上轮盆土连同所结根瘤的一半与等量基质拌匀装盆，另一半盆土储存备用。其他操作同上。③操作同上轮。

4、优势株筛选。三轮花荚期后（时间可比上两轮稍晚），将豆株取出分离后用清水冲洗干净，对比观察植株生长和结瘤状况。选择符合标准的2-3株作为优势株。

5、母种制作。将优势株根瘤连同着生根段剪下，消毒、冲洗、研磨处理后进行摇床扩繁培养，所制菌种即为根瘤菌母种。

6、适应性检验。将根瘤菌母液简易扩繁后稀释10倍，于播种前拌入芸豆种子，按常规无土栽培方式进行适度规模的种植。一个生长季节后根据结瘤、长势、产量等对菌种进行评估。合格后将菌种用于菌肥生产。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种根瘤菌母种的培育方法，其特征在于：包括菌种驯化培养步骤；

在模拟的目标环境中，通过环境筛选、拮抗竞争、适者生存的方法汰劣选优，发现、培育与目标环境和品种匹配的菌种；

所述菌种驯化培养步骤包括如下步骤：

首轮：将菌种土与目标土壤按1:1比例拌匀装盆，将目标品种播入盆中，每盆视盆径大小播10-20粒种子，出苗后视苗情和位置留5-10株；管理同常规，至花荚期首轮结束；首轮结束后取出植株观察根部结瘤情况，结瘤良好的转入次轮；结瘤差或不结瘤的更换菌种地块土壤重复首轮步骤；

次轮：将首轮使用的盆土连同根瘤一半留存备用，另一半与等量目标土壤拌匀装盆，盆内继续种植首轮相同品种，操作同首轮；若遇结瘤差或不结瘤，用备用盆土加半量目标土壤重复次轮过程；

母种组配与复选步骤：将2株以上的优势植株的根瘤菌组配，得复合母菌种，将2株以上优势植株的根瘤连同生根段取下，经消毒研磨后进行摇床培养即成母种。

2.如权利要求1所述的一种根瘤菌母种的培育方法，其特征在于：所述菌种驯化培养持续3-5轮，时间持续半年到一年。

3.如权利要求1所述的一种根瘤菌母种的培育方法，其特征在于：包括模拟环境条件步骤：模拟环境条件从土壤和品种两个方面确定，土壤环境通过目标土壤占比倍数递增、菌种土壤倍数递减的方式逐步过渡。

4.如权利要求3所述的一种根瘤菌母种的培育方法，其特征在于：所述模拟环境条件用盆栽的方式，通过3-5个组合梯度递进到目标环境模拟样本。

5.如权利要求1所述的一种根瘤菌母种的培育方法，其特征在于：包括菌种选取步骤：菌种地的标准是：①长期进行同类豆科作物生产，以种植豆类作物不低于5年的老园土作为菌种选取对象，上茬豆类作物结瘤状况良好；②没有土传或流行病虫害，近期也没有使用过杀菌剂；③土壤类型与目标环境近似，有机质含量、PH值、电导率理化指标差相对值不超过50%；④土样新鲜，久置或长距离运输要保持5-10℃低温和60-90%的相对湿度。

6.如权利要求1所述的一种根瘤菌母种的培育方法，其特征在于：包括优势株筛选步骤：通过优势植株选优势菌株的方法选择菌种，优势植株选择要在豆科花荚期之后，先将盆土连同豆株根茎一起倒出，破碎土块后轻轻分离各个植株，逐一比较鉴定后选出优势植株。