CN111758573B

CN111758573B - 一种美味猕猴桃砧木组培快繁方法

Info

Publication number: CN111758573B
Application number: CN202010757378.1A
Authority: CN
Inventors: 戢小梅; 杜迎军; 张鸿; 陈志伟; 乐有章; 赵志远; 徐刚健; 李长林
Original assignee: Wuhan Weierfu Biological Technology Co ltd; Wuhan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Wuhan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-07-31
Filing date: 2020-07-31
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2040-07-31
Also published as: CN111758573A

Abstract

本发明提供了一种美味猕猴桃砧木组培快繁方法，属于植物组培技术领域。该方法通过外植体消毒、不定芽再生诱导、增殖和生根培养等技术创新，使得外植体污染率极低，同时有效解决了外植体褐化的问题，且组培苗生长健壮、生长速度明显增快。另外，本发明方法不仅简化了工序、节约了时间，而且减少了污染，适合工厂化生产的需要。

Description

一种美味猕猴桃砧木组培快繁方法

技术领域

本发明属于植物组培技术领域，涉及猕猴桃组培快繁技术，特别涉及一种美味猕猴桃砧木组培快繁方法。

背景技术

猕猴桃是被子植物门双子叶植物纲猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia)多年生落叶藤本植物。猕猴桃属植物的分类学比较困难，不同品种间性状经常变异重叠，1911年Dunn首次修订认为猕猴桃属有23种，随着时间的推移，科学工作者们逐渐发现越来越多的种类，2002年Cui等认定猕猴桃属有66种，其中62种在中国。常见的猕猴桃有中华猕猴桃、美味猕猴桃、软枣猕猴桃、狗枣猕猴桃、硬齿猕猴桃、黄毛猕猴桃和毛花猕猴桃等等。

美味猕猴桃因适应性强、试种范围广、同多数接穗品种嫁接的亲和力强，被作为猕猴桃优良品种嫁接繁育的主要砧木类型。‘金魁’系美味猕猴桃，是湖北省农业科学院果树茶叶研究所猕猴桃课题组从野生猕猴桃“竹溪2号”中经实生选育而来(陈庆红.猕猴桃优良品种——金魁[J].果树实用技术与信息,2002(01):13.)，也是目前生产上广泛应用的美味猕猴桃砧木品种，曾于1988年和1992年连续两年获农业部优质农产品中心评比第一名，获“希望之光”奖；1993年通过了湖北省农作物品种审定，定名为“鄂猕猴桃1号”；2002年获湖北省人民政府科技进步二等奖。2001年9月江西省奉新县选送的“金魁”猕猴桃被国家农业部优质农产品中心评为“优质猕猴桃”。但目前生产上是以‘金魁’猕猴桃的种子繁殖得到的实生苗作为砧木，因猕猴桃为雌雄异株植物，实生苗株间变异大，不能保持母本的优良特性，很难生产出稳定一致的砧木，对种苗的标准化生产有较大影响，不利于猕猴桃产业高质量发展。

近年来，猕猴桃在世界上许多国家受到广泛欢迎，为了将这种作物商业化并满足种植材料日益增长的需求，组织和器官培养技术正被用作许多国家繁殖的替代方法。植物组织培养是在人工调控的合适的无菌条件下，将野外植物的组织部分放入培养基中进行培养，使其产生愈伤组织进而分化出器官，形成完整植株。最为重要的是，通过组织培养技术获得的猕猴桃种苗完整保留了母本的优良形状，且可对种苗进行有效复壮，对培育猕猴桃优质健康种苗以及推动猕猴桃种苗标准化生产奠定了基础。猕猴桃几乎所有的组织器官都可作为外植体材料进行研究，不同类型的外植体和培养基被用作诱导愈伤组织，形成器官和生根的效果存在差异。

猕猴桃组织培养常用的培养方式是将外植体进行表面消毒后接种至固体培养基，添加不同浓度植物激素和生长调节剂进行愈伤组织或不定芽的诱导培养至长出与母代性状相同的完整植株。一般可选用MS、1/2MS、B5、WPM等培养基，目前阶段快繁实验最常用于诱导芽生长的是MS基础培养基，在培养过程中不同种类不同用量的激素是实验能否成功的关键，目前已知的生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸和乙烯都可诱导细胞分化，其中生长素和细胞分裂素的配比至关重要。此外，培养前的消毒处理非常关键，传统的猕猴桃组培过程中外植体在流水下冲洗后便采用酒精、升汞一次消毒，但是猕猴桃的茎段上及芽上有很多短绒毛，流水冲洗后加入酒精、升汞消毒，会在外植体表面产生很多小气泡，导致不能彻底杀菌，消毒效果大打折扣，污染率很高。另外，在培养过程中，光照、温度、pH值等外在环境因子也有重要影响。

目前，我国的猕猴桃组织培养技术虽日趋成熟，但由于猕猴桃雌雄异株，基因高度杂合，而组织培养体系又受到基因型的影响，现有培养方法难以全面适用。更重要的是，关于美味猕猴桃砧木品种‘金魁’猕猴桃的组培快繁技术尚未有文献报道。

发明内容

鉴于现有技术的不足，发明人经研究一种美味猕猴桃‘金魁’与其他品种的物种基因型差异性，创造性地通过外植体消毒、不定芽再生诱导、增殖和生根培养等技术创新，提供一种促进各阶段生长发育水平的美味猕猴桃‘金魁’的组培快繁方法。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究，最终获得了如下技术方案：一种美味猕猴桃砧木组培快繁方法，该方法包括如下步骤：

(1)外植体的选取与消毒：从‘金魁’系美味猕猴桃一年生母树上剪取生长健壮，且顶芽和腋芽饱满的当年生嫩枝，长度10～15cm，每段含顶芽及3～5个腋芽，将所取嫩枝在流水下冲洗后，剪切下带芽茎段，装入瓶中，用0.1ml/L的百时清浸泡8～15min，再用纯净水浸洗3～4次，然后于超净工作台中，将所述茎段用1g/L升汞溶液浸泡6～10min后，用75％酒精浸泡处理2.5～3.5min，最后用无菌水浸洗3～5次；

(2)不定芽再生诱导：于超净工作台中切取上述灭菌带芽茎段上的顶芽或腋芽，置于光照强度3000～3200Lux、光照时长12h/d、温度24℃的条件下进行培养，培养基组成为MS+蔗糖29～31g/L+琼脂7～8g/L+6-BA 2mg/L+NAA 0.2mg/L，pH＝6.20～6.24，培养25～30d时顶芽或腋芽再生为不定芽；

(3)不定芽增殖培养：将诱导获得的不定芽置于光照强度3000～3200Lux、光照12h/d、温度24℃条件下进行增殖培养，培养基组成为MS+蔗糖29～31g/L+琼脂7～8g/L+6-BA 0.5mg/L+GA₃4mg/L，pH＝6.20～6.24，培养25～30d后，不定芽增殖系数达4～5；

(4)生根培养：当不定芽生长到4～5cm，具5-6个叶片时，切除底部愈伤组织和底部叶片，保留茎干和顶部2～4片幼叶，接种于生根培养基上，先进行弱光培养，光照强度400lux，时长12h/d，温度20～24℃；弱光培养13～16d后转入正常培养，光照强度3000～3200Lux，光照时长12h/d，温度20～24℃，根长2～3cm，待每苗4～6条根时，即可进行移栽；

(5)移栽：将瓶苗进行驯化处理，然后将瓶苗取出，用流水将培养基质洗净，并灭菌处理，然后将苗株移栽到育苗穴盘中，根部埋入基质中，在栽好苗株的穴盘上覆盖一层无纺布，同时保持无纺布湿润，5-7d后缓苗结束，移除无纺布，并控制环境条件为：前期13～16d，光照6000～8000Lux，温度22～24℃，湿度96～98％；中期13～16d，光照8000～15000Lux，温度24～28℃，湿度76～78％；后期根据苗株长势，逐步提高光照强度，待植株健壮且生长稳定后，进入正常温室生产管理，光照强度不高于25000Lux，温度不高于30℃，湿度不低于75％；2个月后，组培苗生长健壮后即可移栽到苗圃园。

需要说明的是，本发明所采用的百时清(Bestking)属于一种杀菌灭藻剂，为上海永通生态工程股份有限公司生产，剂型为水剂，主要功能成分为阳离子表面活性剂，阳离子表面活性剂的含量≥60.0％。

进一步优选地，如上所述的金魁猕猴桃组培快繁方法，其中步骤(1)中剪切下的带芽茎段每段长2～3cm，带一个顶芽或腋芽。

进一步优选地，如上所述的金魁猕猴桃组培快繁方法，其中步骤(2)中切取顶芽时，需切掉周围所有的小叶及绒毛，保留0.3～0.5cm，垂直插入培养瓶；切取腋芽时，需切掉茎上端、茎下端和叶柄的切口，保留0.5～1cm，插入培养瓶，使腋芽朝上。

进一步优选地，如上所述的金魁猕猴桃组培快繁方法，其中步骤(2)、(3)按照配方配制相应培养基后，分别加热煮沸两次后进行分装，每1L培养基分装到20～22个培养瓶中，120℃下高压灭菌20min，冷却后置入超净工作台备用。

进一步优选地，如上所述的金魁猕猴桃组培快繁方法，其中步骤(4)中所述的生根培养基的组成为：1/2MS+蔗糖29～31g/L+琼脂7～8g/L+IBA 1mg/L+NAA 0.2mg/L，pH＝6.20～6.24。

进一步优选地，如上所述的金魁猕猴桃组培快繁方法，其中步骤(5)中驯化处理的步骤为：将瓶苗置于温室大棚内3d，光照8000～10000Lux，温度24～28℃。

进一步优选地，如上所述的金魁猕猴桃组培快繁方法，其中步骤(5)中灭菌处理的步骤为：将洗净的苗株放入1000倍多菌灵中浸泡1min，晾干。

进一步优选地，如上所述的金魁猕猴桃组培快繁方法，其中步骤(5)中所述的基质组成为：泥炭∶珍珠岩＝3∶1。

与现有技术相比，本发明涉及的金魁猕猴桃组培快繁方法具有如下优点和进步性：

(1)传统的猕猴桃组培过程中，外植体在流水下冲洗后便采用酒精、升汞一次消毒，但猕猴桃的茎段上及芽上有很多短绒毛，流水冲洗后加入酒精、升汞消毒，会在外植体表面产生很多小气泡，导致不能彻底杀菌，消毒效果大打折扣，污染率很高。本发明通过在消毒之前加入0.1ml/L的百时清处理后，再加入酒精、升汞后，污染率极低，甚至可达到零染菌情况发生。

(2)传统猕猴桃组培过程中，先加入酒精浸泡处理后再加入升汞溶液处理，但这种处理后褐化率很高，达到50％以上，而本发明通过先加入升汞、再加入酒精的顺序处理外植体，有效解决了外植体褐化的问题(褐化率为0％)。

(3)外植体可以选用顶芽或腋芽，并筛选了组分科学的不定芽诱导培养基配方，使得再生诱导率显著提高至90％以上。

(4)传统猕猴桃组培过程中，在制作增殖培养基时，需要在培养基灭菌冷却到40℃左右时加入GA3，但琼脂培养基在35℃时就开始凝固，整个灌装过程时间短、程序繁琐，很容易染菌，不适应工厂化大规模生产应用。本发明采用在培养基灭菌前一次性加入一定量的GA3，再进行高温灭菌，解决了必须等到培养基冷却至40℃以下再灌装带来的各种问题，不仅简化了工序、节约了时间，而且减少了污染，适合工厂化生产的需要。

(5)通过优化生根培养基的配方，以及弱光培养和正常光照培养结合，节约了生根时间15天以上，且组培苗生长健壮、生长速度明显增快。

附图说明

图1是本发明‘金魁’猕猴桃组培的丛生芽诱导及分化初期示意图。

图2是本发明‘金魁’猕猴桃组培的丛生芽分化阶段示意图。

图3是本发明‘金魁’猕猴桃组培的丛生芽增殖阶段示意图。

图4是本发明‘金魁’猕猴桃组培的丛生芽增壮阶段示意图。

图5是本发明‘金魁’猕猴桃组培的无菌苗生根示意图。

具体实施方式

以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

实施例1外植体处理

将野外收集的枝条在流水下冲洗30min，置于超净工作台上，用体积分数为75％的酒精表明消毒3min,无菌水冲洗4次，用0.1％的HgCI₂溶液进行消毒，时间设置为4、6、8、10、12min，无菌水冲洗4次。灭菌茎段剪成1.5cm长度，每个茎段带一个腋芽，垂直插入培养基中，培养基为MS培养基添加0.2mg/L NAA和2mg/L 6-BA。30天后统计污染率。同时探索先升汞后酒精消毒试验，时间设置不变。试验结果见表1。

将野外收集的枝条在流水下冲洗30min，添加0.1ml/L的百时清浸泡10min(以不添加百时清为对照)，用无菌水冲洗3次，置于超净工作台上，用0.1％的HgCI₂溶液进行消毒8min，无菌水冲洗4次,用体积分数为75％的酒精表明消毒3min,无菌水冲洗4次。灭菌茎段剪成1.5cm长度，每个茎段带一个腋芽，垂直插入培养基中，培养基为MS培养基添加0.2mg/LNAA和2mg/L 6-BA。30天后统计污染率。试验结果见表2。

表1用0.1％的HgCI2消毒时间对猕猴桃芽成活的影响

注：同列不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)，下同。

表2添加0.1ml/L的百时清对外植体成活的影响

处理	污染率/％	成活率/％
			1(添加0.1ml/L的百时清)	2.23	96.67
CK(不添加百时清)	43.06	51.06

带芽茎段接入培养基5-7天后，侧芽出现膨大、变绿，随后10天内伸长、长出叶片，形成小茎。但是，培养过程中，从第5天开始，陆续开始出现细菌污染，大多数为黄色，少数为白色。从试验结果可看出，无论是先用酒精消毒后再用升汞消毒一定时间，还是先用升汞消毒一定时间再用酒精消毒，随着消毒时间增长，污染率降低，成活率先增后减。值得注意的是，先用酒精消毒再用升汞消毒的5个处理出现了不同程度的褐化，褐化率高达50％，而先升汞后酒精消毒处理的外植体未出现褐化。其中以先升汞消毒8min、后酒精消毒3min的处理综合表现最佳，既能保持较高的成活率，又能保持较低的污染率。在此基础上，添加0.1ml/L的百时清浸泡10min后，升汞消毒8min、酒精消毒3min，污染率明显降低，成活率大大提高。

实施例2不定芽再生诱导

于超净工作台中切取上述灭菌嫩枝段的顶芽或腋芽作为外植体。切取顶芽时尽量切掉周围所有的小叶及绒毛，保留0.3-0.5cm左右垂直插入芽诱导培养基中；腋芽取芽时切掉三段切口(茎上端、茎下端、叶柄)，保留0.5～1cm左右，插入芽诱导培养基，使腋芽朝上。芽诱导培养基为MS培养基添加0.2mg/L NAA和1～5mg/L 6-BA。每个培养瓶中1个茎段，每个处理10瓶，重复3次。置于光照强度3000～3200Lux、光照时长12h/d、温度24℃的条件下进行培养。30天后统计成活率，调查是否有褐化、玻璃化等现象。试验结果见表3.

表3不同质量体积比6-BA对不定芽诱导的影响

注：不定芽诱导率％＝(有不定芽产生的茎段/接种数)*100％

由表3可以看出，在NAA的添加量确定为0.2mg/L的情况下，随着6-BA浓度的增加，不定芽诱导率增高，当6-BA的添加量为2mg/L时，不定芽的诱导率达到最大值93.33％，后随着浓度的增加，不定芽诱导率显著降低。‘金魁’猕猴桃不定芽诱导培养基最佳配方为MS+0.2mg/L NAA+2.0mg/L 6-BA.

实施例3不定芽增殖培养

以MS为基本培养基，分别添加6-BA和GA3处理。6-BA的浓度梯度设置为0.3mg/L、0.5mg/L、0.7mg/L，GA3的处理分为灭菌前加入和灭菌后加入两种，灭菌前的浓度梯度设置为1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L，灭菌后的浓度梯度设置为0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L(滤器过滤后加入)。每瓶3-4个茎段，每个处理10瓶，重复3次。置于光照强度3000～3200Lux、光照12h/d、温度24℃条件下，进行不定芽的增殖培养30天后统计增殖系数，调查是否有褐化、玻璃化等现象。试验结果见表4.

表4不同质量体积比6-BA和GA3对芽增殖的影响

从表4可以看出，两种处理方式中随着GA3浓度的增大，增殖系数越大，6-BA浓度变化对增殖系数影响不大，但当6-BA浓度低于0.5mg.L-1时，植株木质化明显。最佳增殖培养基为MS++0.5mg/L 6-BA+4.0mg/L GA3(培养基高温灭菌前加入),植株生长健壮，且增殖系数较高。此外，培养基加入GA3后进行高温灭菌，无须等到培养基冷却到40℃以下进行分装，节约了时间，简化了工序，更有利于工厂化育苗操作。

实施例4生根培养

生根培养基的基本培养基为1/2MS培养基，添加激素为IBA和NAA，IBA的浓度梯度为1mg/L、1.5mg/L、2mg/L，NAA的浓度梯度为0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L。每瓶3个茎段，每个处理10瓶，重复3次。先进行弱光培养，光照强度400lux，时长12h/d，温度20～24℃。15d后转入正常培养，光照强度3000～3200Lux，光照时长12h/d，温度20～24℃。30天后统计生根率和平均根数。试验结果见表5和表6.

表5不同质量体积比IBA和NAA对组培苗生根的影响

注：‘金魁’组培苗出瓶条件为根长达2-3cm，每苗达3-4条根时。

生根率％＝(生根的芽数/接种数)％

平均根数＝总生根数/接种数

平均根长＝总生根长度/总生根数

表6不同光照条件对‘金魁’猕猴桃生根的影响

在生根培养过程中，依据已有的报道采用1/2MS+1.0mg/L IBA作为生根培养基，15d开始长根，30d平均根数达到1-2条，平均根长1cm，75d时平均生根数量达到3-4条，平均根长约2cm，满足出瓶条件，但组培苗表现为植株矮小，生长弱，生根慢。后探索在1/2MS培养基中添加不同浓度IBA和NAA组合(见表5)，从实验结果可以看出,随着IBA和NAA浓度的增加，不同处理的生根率和生根数都表现为增加趋势，当IBA浓度为1.0mg/L、NAA的浓度为0.2mg/L时，不定根诱导达到最佳状态，无论是生根率、平均根数还是平均根长均达到最大。

在上述生根培养基优化的前提下，对组培苗的生根环境进行改良，分别开展了生根培养基先暗培养后正常光照培养(光照强度3000～3200Lux，光照时长12h/d，温度20～24℃)、先弱光(光照强度400lux，时长12h/d，温度20～24℃)培养后正常光照培养和全正常光照培养，结果发现(见表6)，先弱光培养15d再正常光照培养，组培苗达到出瓶移栽标准所需的时间比常规培养缩短了30d。因此，‘金魁’猕猴桃组培生根培养最佳条件为，以1/2MS+1.0mg/L IBA+0.2mg/L NAA为生根培养基，先在400lux光照强度下培养15d，12h/d，再3000～3200Lux光照强度下培养20d，12h/d，整个培养过程环境温度20～24℃，生根率可达到100％，平均根长可达到3.36cm，平均根数可达5.22条，且植株生长健壮。

实施例5移栽

1)驯化：将瓶苗置于温室大棚内3d，光照8000～10000Lux，温度24～28℃，进行驯化处理。

2)出瓶：将瓶苗用镊子夹住根部取出，用流水将培养基质洗净。将洗净的苗株放入1000倍多菌灵中浸泡1min，晾干。

3)穴盘移栽：将晾干的苗株移栽到50孔育苗穴盘中，根部埋入基质中1cm左右。基质配比为进口泥炭∶珍珠岩＝3∶1。在栽好苗株的穴盘上覆盖一层无纺布，同时保持无纺布湿润，7d后缓苗结束，移除无纺布。

4)环境控制：前期15d，光照6000～8000Lux，温度22～24℃，湿度98％；中期15d，光照8000～15000Lux，温度24～28℃，湿度78％；后期根据苗株长势，可逐步提高光照强度，待植株健壮且生长稳定后，进入正常温室生产管理，光照强度不高于25000Lux，温度不高于30℃，湿度不低于75％。

5)苗圃移栽：2个月后，组培苗生长健壮后即可移栽到苗圃园。

Claims

1.一种美味猕猴桃砧木组培快繁方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

（1）外植体的选取与消毒：从‘金魁’系美味猕猴桃一年生母树上剪取生长健壮，且顶芽和腋芽饱满的当年生嫩枝，长度10~15 cm，每段含顶芽及3~5个腋芽，将所取嫩枝在流水下冲洗后，剪切下带芽茎段，装入瓶中，用0.1 ml/L的百时清浸泡8~15min，再用纯净水浸洗5~6次，然后于超净工作台中，将所述茎段用1 g/L升汞溶液浸泡10~15min后，用75%酒精浸泡处理2.5~3.5 min，最后用无菌水浸洗4~8次；

（2）不定芽再生诱导：于超净工作台中切取上述灭菌带芽茎段上的顶芽或腋芽，置于光照强度3000~3200 Lux、光照时长12 h/d、温度24℃的条件下进行培养，培养基组成为MS +蔗糖29~31g/L + 琼脂7~8g/L + 6-BA 2mg/L + NAA 0.2mg/L，pH=6.20~6.24，培养25~30 d时顶芽或腋芽再生为不定芽；

（3）不定芽增殖培养：将诱导获得的不定芽置于光照强度3000~3200 Lux、光照12 h/d、温度24℃条件下进行增殖培养，培养基组成为MS + 蔗糖29~31g/L + 琼脂7~8g/L + 6-BA0.5mg/L + GA₃4mg/L，pH=6.20~6.24，培养25~30 d后，不定芽增殖系数达4~5；

（4）生根培养：当不定芽生长到4~5 cm，具5-6个叶片时，切除底部愈伤组织和底部叶片，保留茎干和顶部2~4片幼叶，接种于生根培养基上，先进行弱光培养，光照强度400 lux，时长12 h/d，温度20~24℃；弱光培养13~16 d后转入正常培养，光照强度3000~3200 Lux，光照时长12 h/d，温度20~24℃，根长2~3 cm，待每苗4~6条根时，进行移栽；

（5）移栽：将瓶苗进行驯化处理，然后将瓶苗取出，用流水将培养基质洗净，并灭菌处理，然后将苗株移栽到育苗穴盘中，根部埋入基质中，在栽好苗株的穴盘上覆盖一层无纺布，同时保持无纺布湿润，5-7 d后缓苗结束，移除无纺布，并控制环境条件为：前期13~16d，光照6000~8000 Lux，温度22~24℃，湿度96~98%；中期13~16 d，光照8000~15000 Lux，温度24~28℃，湿度76~78%；后期根据苗株长势，逐步提高光照强度，待植株健壮且生长稳定后，进入正常温室生产管理，光照强度不高于25000 Lux，温度不高于30℃，湿度不低于75%；2个月后，组培苗生长健壮后移栽到苗圃园；

步骤（2）、（3）按照配方配制相应培养基后，分别加热煮沸两次后进行分装，每1 L培养基分装到20~22个培养瓶中，120℃下高压灭菌20 min，冷却后置入超净工作台备用；

步骤（4）中所述的生根培养基的组成为：1/2MS + 蔗糖29~31g/L + 琼脂7~8g/L + IBA1mg/L + NAA 0.2mg/L，pH=6.20~6.24。

2.根据权利要求1所述的美味猕猴桃砧木组培快繁方法，其特征在于，步骤（1）中剪切下的带芽茎段每段长2~3 cm，带一个顶芽或腋芽。

3.根据权利要求1所述的美味猕猴桃砧木组培快繁方法，其特征在于，步骤（2）中切取顶芽时，需切掉周围所有的小叶及绒毛，保留0.3~0.5 cm，垂直插入培养瓶；切取腋芽时，需切掉茎上端、茎下端和叶柄的切口，保留0.5~1 cm，插入培养瓶，使腋芽朝上。

4.根据权利要求1所述的美味猕猴桃砧木组培快繁方法，其特征在于，步骤（5）中驯化处理的步骤为：将瓶苗置于温室大棚内3 d，光照8000~10000 Lux，温度24~28℃。

5.根据权利要求1所述的美味猕猴桃砧木组培快繁方法，其特征在于，步骤（5）中灭菌处理的步骤为：将洗净的苗株放入1000倍多菌灵中浸泡1 min，晾干。

6.根据权利要求1所述的美味猕猴桃砧木组培快繁方法，其特征在于，步骤（5）中所述的基质组成为：泥炭∶珍珠岩=3∶1。