CN115885855B - 一种以紫魁茶树下胚轴为外植体建立再生体系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以紫魁茶树下胚轴为外植体建立再生体系的方法，包括以下步骤：采摘紫魁茶树的蒴果，取出种子，并去掉种壳，选取饱满且无污染的种子，消毒后，接种至种胚萌发培养基中，待胚萌发培养基中的幼苗长出胚轴后，将幼苗的下胚轴切成1cm的小段，接种至愈伤及分化培养基中，暗胚天数为14d后，移至光照条件下培养60d；将不定芽丛愈伤组织切下，下端斜切，接种至壮苗培养基中培养；将壮苗培养基中长势健壮、高度5cm左右的无根苗下端斜切，接种至生根培养基中；将组培瓶里的无菌苗移至温室，炼苗后移栽至配置好的移栽基质中。本发明可以建立高效的紫魁茶树组培再生体系，可为后续茶树遗传转化和分子育种的开展提供技术参考。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种以紫魁茶树下胚轴为外植体建立再生体系的方法。
背景技术
紫魁茶树是从贵州本地茶树湄潭苔茶群体种中筛选获得的茶树新品系，属于典型的紫化茶树。近年来，随着花青素生理研究的深入与医学保健功能的推广，紫化茶树的选育和开发逐渐被人们关注。紫魁茶树是无性系灌木型小叶类品种，成熟叶片呈墨绿色，生长期长，叶质较柔软，叶面平整，叶缘平或微波。紫魁芽色呈紫红色，茸毛中等，芽肥壮且短。幼嫩芽、叶颜色也呈紫红色，芽叶抗寒、抗旱力较强，适应性广。春茶一芽二叶含游离氨基酸5.40%、茶多酚17.30%、咖啡碱3.10%、儿茶素12.85%。紫魁茶叶制作的绿茶滋味依爽，制作的红茶汤色黄红明亮，香气甜香持久、滋味平和略有涩味、叶底酱色较暗。经测定紫魁茶树花青素含量达3.87mg/ml，春季花青素含量可高于福鼎白茶的4.5倍，紫魁第4~5叶片颜色仍然呈现紫色，属于典型的紫化茶树，是研究茶树花青素代谢和调控的理想材料。
茶树本身具有生长周期过长，自交也不亲和的特性。紫化茶树的常规繁殖分为有性繁殖和无性繁殖，有性繁殖是指利用茶籽进行播种最终获得茶树植株的过程。无性繁殖也称为营养繁殖，指利用茶树根和茎器官，形成新的完整的茶苗。通常为扦插和压条，但扦插也存在劳动成本高，繁殖系数低，出苗时间长等问题。因此，紫魁茶树在品种的培育和推广上进度缓慢。
发明内容
为了解决以上问题，本发明提出一种以紫魁茶树下胚轴为外植体建立再生体系的方法，利用紫魁茶树种子的胚轴作为材料，诱导愈伤组织和再生，利用组培技术得到了紫魁茶树完整植株，并建立再生体系，为珍贵茶树种质资源的离体保存提供了无菌材料，也为后续茶树遗传转化和分子育种的开展提供技术参考。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种以紫魁茶树下胚轴为外植体建立再生体系的方法，包括以下步骤：
S1、获取种子与消毒处理：10~11月份，采摘紫魁茶树的蒴果，取出种子，并去掉种壳，选取饱满且无污染的种子，在添加洗洁精溶液的烧杯中浸泡10min，期间不断轻轻搅拌，捞出，用自来水细流反复冲洗10min以上后，置于浓度为0.50%的多菌灵溶液中浸泡30min，期间不断搅拌，捞出，用自来水细流冲洗1h以上，置于超净台备用；
S2、种胚诱导：将所得的种子接种至添加有2.4mg.L-1的GA3的种胚萌发培养基中；
S3、胚轴分化暗培养：待胚萌发培养基中的幼苗长出胚轴后，将幼苗的下胚轴切成1cm左右的小段用来作为愈伤诱导和分化的外植体，接种至愈伤及分化培养基中，暗胚天数为14d后，出愈率最高可达93.64%，移至光照条件下培养60d；
S4、壮苗：将不定芽丛愈伤组织切下，下端斜切，接种至壮苗培养基中培养；壮苗培养基为MS+2.00mg/L 6-BA+0.60mg/L IBA，培养时间为50d；
S5、生根：将壮苗培养基中长势健壮、高度5cm左右的无根苗下端斜切，接种至添加有1.60mg/L IBA的生根培养基中；
S6、移栽：将组培瓶里的无菌苗移至温室，打开瓶盖，自然光条件下炼苗 6d，炼苗完成后，将带有培养基的植株冲洗干净，移栽至配置好的移栽基质中。
进一步地，所述步骤S1中，还包括：用75%消毒酒精消毒3min，无菌水荡涤种子3次，之后用20%次氯酸钠溶液消毒10min，无菌水荡涤7次以上，使用无菌吸水纸将种子水分吸干的操作。
进一步地，所述步骤S2中，种胚萌发诱导培养基采用添加有2.4mg.L-1的GA3的MS基本培养基，pH=5.86，萌发培养基中培养60d，萌发率达93.64%，萌发时间短，下胚轴长，根毛短。
进一步地，所述的步骤S3中，愈伤及分化培养基为WPM+2.00mg/L 6-BA+0.10mg/LNAA。
进一步地，所述的步骤S5中，生根培养基为1/2MS+1.60mg/L IBA。
进一步地，所述的步骤S6中，炼苗完成后，将带有培养基的植株进行冲洗干净，移栽至配置好的V黄壤土：V蛭石=2:1移栽基质中，其中培养基的pH值为5.80~6.00，组培间内光照强度为2000lx，温度设置为（23±2）℃，光照时间设置为12h/d。
本发明可以建立高效的紫魁茶树组培再生体系，可为后续茶树遗传转化和分子育种的开展提供技术参考。
附图说明
图1为种胚萌发诱导在不同时间的长势；
图中：A. 种胚萌发诱导培养0 d长势；B. 种胚萌发诱导培养25 d长势；C. 种胚萌发诱导培养45 d长势；标尺均为1 cm。
图2为胚在不同GA3浓度下萌发60d的长势；
图中：A. 胚接种至空白培养基上培养60d长势；B. 胚接种至MS+1.20mg/L GA3培养基上培养60d长势；C. 胚接种至MS+2.40mg/L GA3培养基上培养60d长势；D. 胚接种至MS+3.60mg/L GA3培养基上培养60d长势除注释外，图中标尺均为1 cm。
图3不同分化培养基条件下胚轴60d的分化情况；
图中：A. 胚轴接种至WPM+2.00mg/L 6-BA+0.10mg/L NAA培养基上培养60d的情况；B. 胚轴接种至WPM+2.00mg/L 6-BA+0.10mg/L IBA培养基上培养60d的情况；C. 胚轴接种至WPM+2.00mg/L 6-BA+0.10mg/L 2,4-D培养基上培养60d的情况；D. 胚轴接种至WPM+2.00mg/L 6-BA+0.10mg/L NAA培养基上培养60d的情况图中标尺均为1 cm。
图4胚轴在WPM+2.00mg/L 6-BA+0.10mg/L NAA培养基上形成愈伤和分化过程；
图中：A. 胚轴在WPM+2.00mg/L 6-BA+0.10mg/L NAA培养基上培养0d长势；B. 胚轴在WPM+2.00mg/L 6-BA+0.10mg/L NAA培养基上培养20d长势；C. 胚轴在WPM+2.00mg/L6-BA+0.10mg/L NAA培养基上培养40d长势；D. 胚轴在WPM+2.00mg/L 6-BA+0.10mg/L NAA培养基上培养60d长势；图中标尺均为1 cm。
图5紫魁茶树壮苗生根移栽及成活植株；
图中：A. 幼苗在MS+2.00mg/L 6-BA+0.60mg/L IBA的壮苗培养基中0d长势；B. 植株在1/2MS+1.60mg/L IBA生根培养基中60d的情况；C. 植株在1/2MS+1.60mg/L IBA生根培养基中60d的情况；D. 植株在V黄壤土：V蛭石=2:1的移栽基质中成活60d的情况；除注释外，图中标尺均为1 cm。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
材料
本实施例所使用的紫魁茶树是从贵州本地茶树种质资源湄潭茶苔群体种中筛选获得的本地子叶茶树新品系。本研究以10~11月份紫魁茶树植株上的蒴果为材料，挑取种胚在无菌条件下萌发，再以种胚萌发幼苗的下胚轴进行再生体系建立。该研究材料由贵州省农业科学院茶叶研究所惠赠。
方法
获取种子与消毒处理
10~11月份，采摘紫魁茶树当年的生蒴果，取出种子，用去壳器去掉种壳后，选取饱满并且无污染的种子，在添加洗洁精溶液的烧杯中浸泡10min，期间不断轻轻搅拌，捞出用自来水细流冲洗10min以上，再将种子在浓度为0.50%的多菌灵溶液中浸泡30min，期间不断搅拌，捞出用自来水细流冲洗1h以上，置于超净台，用75%消毒酒精消毒3min，无菌水荡涤种子3次后，用20%次氯酸钠溶液消毒10min，无菌水荡涤7次以上。荡涤后使用无菌吸水纸将种子水分吸干。
计算公式如下：
种胚存活率(%) = (种胚存活数/种胚接种数)×100%；
种胚污染率(%) = (种胚污染数/种胚接种数)×100%；
种胚死亡率(%) = (种胚死亡数/种胚接种数)×100%。
种胚萌发培养基确定
将经过消毒处理后的种子接至不同GA3浓度的种胚萌发培养基中，该培养基是以MS为基础培养基，添加不同GA3（0.00~3.60mg/L）配比的4个处理组，每个处理组重复3次，每次接种110个。观察记录种胚萌发情况并在60d后统计萌发数量，计算出萌发率，计算公式如下：
种胚萌发率(%) = (种胚萌发数/种胚接种数)×100%；
胚轴分化暗培天数确定
待上述种胚萌发培养基中的幼苗长出胚轴后，将幼苗的下胚轴切成1cm左右的小段用来作为愈伤诱导和分化的外植体，接种至MS+2.00mg/L 6-BA+0.80mg/L IBA的愈伤及分化培养基中，设计不同的暗培天数（0、7、14d）培养后，再移至光照条件下培养，共计3个处理组，每个处理组重复3次，每次接种90个，60d后观察记录愈伤个数和分化个数，计算出出愈率和分化率，计算公式如下：
愈伤诱导率(%) = (外植体诱导出的愈伤个数/外植体总接种数)×100%；
不定芽分化率(%) = (愈伤分化出芽的个数/外植体总接种数)×100%；
愈伤组织及不定芽分化诱导
将萌发培养基中幼苗的下胚轴切成1cm的小段作为愈伤诱导和分化的外植体，接种到添加不同植物生长调节剂配比的胚轴分化培养基中。胚轴分化培养基是以WPM为基础培养基，在2.00mg/L 6-BA溶液中添加不同浓度的IBA（0.10、0.30mg/L）、NAA(0.10、0.30mg/L)和2,4-D（0.10、0.30mg/L）配比的6个处理组，每个处理组重复3次，每次接种90个。30d后观察记录愈伤生长状况和愈伤个数，继续培养至60d后观察记录不定芽生长情况和外植体分化数。计算出出愈率和分化率，计算出出愈率和分化率，计算公式如下。
愈伤诱导率（%）=（外植体诱导出的愈伤个数/外植体总接种数）×100%
不定芽分化率（%）=（愈伤分化出芽的个数/外植体总接种数）×100%
壮苗及生根
将上不定芽丛愈伤组织中切下，下端斜切，接种至以探索MS+2.00mg/L 6-BA+0.60mg/L IBA的壮苗培养基中培养。
选择壮苗培养基中长势健壮、高度5cm左右的无根苗下端斜切，用60mg/L IBA的无菌溶液浸泡8min，接种至1/2MS+1.60mg/L IBA的生根培养基中。
炼苗移栽
将组培瓶里的无菌苗移至温室，打开瓶盖，自然光条件下进行炼苗，炼苗时间为6d。炼苗完成后，将带有培养基的植株冲洗干净，移栽至配置好的V黄壤土：V蛭石=2:1移栽基质中。
培养条件
在紫魁茶树离体快繁和再生培养过程中，除了胚轴愈伤分化和植株生根使用到WPM位基础培养基，其余是使用MS为基础培养基。胚轴愈伤分化过程中，WPM粉为29.78g/L、蔗糖为10.00g/L、琼脂1.00g/L。生根诱导时WPM分为14.89g/L、蔗糖为5.00g/L、琼脂0.50g/L。生根诱导时MS粉为2.22g/L、植物凝胶为2.50g/L、蔗糖为15.00g/L。其他过程均是MS粉称量4.43g/L、蔗糖称量30g/L、琼脂称量8.00g/L。培养基pH值在5.80~6.00之间，光照强度为2000 lx，温度为(23±2)℃，光照时间为12 h/d。
结果
消毒时间对紫魁茶树种胚存活率的影响
建立胚的无菌体系，目的是为了获得无菌胚轴，进而为后续再生体系的建立提供外植体。以75%消毒酒精（1、2、3min）和20%次氯酸钠（7、10、13min）两种消毒试剂组合设计试验，研究表明，不同灭菌时间对种胚的污染率、存活率及死亡率具有限制性差异的影响（表1）。9个处理组进行组间比较，20d后第8处理组的污染率和死亡率均较低，存活率达到了72.73%，存活率最高，为9个处理组中的最优处理组，因此紫魁茶树种胚的消毒时间为75%酒精消毒3min、20%次氯酸钠浸泡10min。
当75%酒精消毒时间不变，随着20%次氯酸钠消毒时间的增加，污染率逐渐降低，污染率最低为15.45%，污染率最高为41.82%，存活率先增加后降低，存活率最低为53.94%，存活率最高为72.73%；当20%次氯酸钠消毒时间不变，随着75%酒精消毒时间的增加，污染率在逐渐降低，存活率在逐渐增加；当两种消毒试剂浸泡时间变长时，死亡率也随之增加，最高死亡率为17.88%，这是因为消毒试剂不仅能杀死真菌和细菌，材料自身细胞等结构也会受到伤害，消毒时间越长，种胚收到的伤害越大，甚至死亡。
GA3对种胚萌发的影响
赤霉素能够促进细胞伸长，进而促进植物的生长发育，是一种高效常见的植物生长调节剂。本次试验所需外植体为下胚轴，第3组萌发率最高，下胚轴长，根毛短，所以第3处理组为最优处理组，紫魁茶树种胚萌发培养基为MS+2.40mg/L GA3。
试验使用GA3来破除种子休眠状态、促进发芽，这是因为茶胚去除子叶后在无植物生长调节剂的MS培养基中萌发率较低（图2A），因此在萌发培养基中添加不同浓度配比的GA3（表2）。研究发现：培养基中添加GA3能有效促进胚萌发和胚轴生长（图1），当培养基中附加GA3后，萌发的时间由长变短，萌发率也从最低82.73%增加到90.91%以上；添加1.20mg/LGA3的萌发率为90.91%（图2B），添加2.4mg/L GA3的萌发率为93.64%（图2C），添加3.60mg/LGA3的萌发率为92.12%(图2D），可以看出三组萌发率没有明显的显著性差异，且萌发时间均缩短，但下胚轴的长度随着浓度增加由短到长再到短，这可能是因为较低浓度或较高浓度的GA3会影响胚轴的伸长。
黑暗培养天数对胚轴愈伤形成及分化的影响
愈伤组织诱导阶段的黑暗培养有利于细胞脱分化产生愈伤组织。光照条件下容易分化产生维管等组织，阻碍组织的脱分化，不利于产生大量的愈伤组织。植物组织培养在无光的条件下愈伤组织长得更快，因此在同种培养基条件下探索胚轴分化的最适暗胚天数（表3）。研究发现：分化率随着暗培天数的增加而上升，但波动幅度不大，可能是因为该中培养基不是胚轴分化的最适培养基；随着暗胚时间由无到7d再到14d，胚轴诱导的愈伤数增加，出愈率最高可达93.64%，因此胚轴分化的暗胚天数为14d。
不同生长调节剂配比对紫魁茶树胚轴愈伤及芽分化的影响
植物组织形成愈伤及分化是整个再生体系中最为关键的过程，它决定整个再生体系的成败。茶树为木本植物，多数情况下，木本植物诱导愈伤组织和不定芽分化通常在同种培养基中进行。植物生长调节剂的种类和浓度配比对植物愈伤诱导和器官分化具有诸多作用，因此在黑暗培养14d条件下，以不同植物生长调节剂种类和配比设计试验进行胚轴愈伤诱导和愈伤分化（表4）。
研究表明6个组别中，第1组和第4组出愈率无显著性差异，但第1组分化率为20.74%(图3D），为整个处理组中最高，并且综合愈伤生长状况等因素得出第1组为6个处理组中最优（图4），因此紫魁茶树愈伤诱导及分化培养基为WPM+2.00mg/L 6-BA+0.10mg/LNAA
研究表明6个处理组的出愈率从88.89%到97.04%，出愈率都很高；6-BA和NAA条件下，愈伤呈现绿色，愈伤结构紧密，后续分化的不定芽丛多（图3A），6-BA和IBA条件下，愈伤呈现黄绿色，结构较紧密，但愈伤后期伴有少量褐化（图3B），6-BA和2,4-D条件下，愈伤呈现绿色和白色，结构较松散，不定芽丛少（图3C）；随着IBA、NAA和2,4-D三种调节剂的浓度从0.10mg/L增加到0.30mg/L，发现分化率均在不断降低，0.10mg/L的浓度更为适宜分化。
不定芽壮苗、生根和移栽的确定
将不定芽丛愈伤组织切下后接种至MS+2.00mg/L 6-BA+0.60mg/L IBA的壮苗培养基中培养（图5A）。50d后，将长势良好、高度5cm左右无根苗用刀片将下端斜切，用60mg/L 无菌IBA溶液浸泡8min，接种至1/2MS+1.60mg/L IBA培养基中生根（图5B-C）。60d后将无菌苗移至温室，打开瓶盖自然光条件下炼苗6d。将带有培养基的植株进行冲洗干净，移栽至配置好的V黄壤土：V蛭石=2:1移栽基质。（图5D）
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种以紫魁茶树下胚轴为外植体建立再生体系的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、获取种子与消毒处理：10~11月份，采摘紫魁茶树的蒴果，取出种子，并去掉种壳，选取饱满且无污染的种子，在添加洗洁精溶液的烧杯中浸泡10min，期间不断轻轻搅拌，捞出，用自来水细流反复冲洗10min以上后，置于浓度为0.50%的多菌灵溶液中浸泡30min，期间不断搅拌，捞出，用自来水细流冲洗1h以上，置于超净台备用；
S2、种胚诱导：将所得的种子接种至添加有2.4mg.L-1的GA3的种胚萌发培养基中；
S3、胚轴分化暗培养：待胚萌发培养基中的幼苗长出胚轴后，将幼苗的下胚轴切成1cm的小段用来作为愈伤诱导和分化的外植体，接种至愈伤及分化培养基中，暗胚天数为14d后，移至光照条件下培养60d；
S4、壮苗：将不定芽丛愈伤组织切下，下端斜切，接种至壮苗培养基中培养；壮苗培养基为MS+2.00mg/L 6-BA+0.60mg/L IBA；
S5、生根：将壮苗培养基中长势健壮、高度5cm左右的无根苗下端斜切，接种至添加有1.60mg/L IBA的生根培养基中；
S6、移栽：将组培瓶里的无菌苗移至温室，打开瓶盖，自然光条件下炼苗 6d，炼苗完成后，将带有培养基的植株冲洗干净，移栽至配置好的移栽基质中；
所述步骤S1中，还包括：用75%消毒酒精消毒3min，无菌水荡涤种子3次，之后用20%次氯酸钠溶液消毒10min，无菌水荡涤7次以上，使用无菌吸水纸将种子水分吸干的操作；
所述步骤S2中，种胚萌发诱导培养基采用添加有2.4mg.L-1的GA3的MS基本培养基，pH=5.86，萌发培养基中培养60d；
所述的步骤S3中，愈伤及分化培养基为WPM+2.00mg/L 6-BA+0.10mg/L NAA；
所述的步骤S5中，生根培养基为1/2MS+1.60mg/L IBA；
所述的步骤S6中，炼苗完成后，将带有培养基的植株进行冲洗干净，移栽至配置好的V黄壤土：V蛭石=2:1移栽基质中，其中培养基的pH值为5.80~6.00，组培间内光照强度为2000lx，温度设置为（23±2）℃，光照时间设置为12h/d。
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