CN103461143B - 一种油茶组织培养快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种油茶组织培养快速繁殖方法，包括外植体消毒、初代培养、继代增殖培养、生根培养和移栽的步骤。其中，生根培养基的制备方法为：配制含0.5mg/L IBA的1/2MS琼脂培养基，其中琼脂为7-10g/L，pH值5.0-5.5，用网兜包好粉碎的珍珠岩，放入融化的培养基中，待珍珠岩充分吸收培养基后，稍沥干，灭菌，即得。本发明以一定颗粒度的珍珠岩为培养基，混合琼脂培养基组成生根基质，使得油茶根系能够充分呼吸，大大提高油茶组培生根率，且根系发达，移栽成活率高，为油茶的组织培养工厂化育苗和基因工程改良奠定了技术基础。
Description
技术领域
本发明涉及组织培养技术，具体地说，涉及一种油茶组织培养快速繁殖方法。
背景技术
油茶(Camellia oleifera)是山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)植物，是我国特有的优质木本油料树种，与油橄榄、油棕和椰子并称为世界四大木本油料树种。茶油营养丰富，色清味香，耐贮藏，是优质食用油之一，被誉为“东方橄榄油”，同时副产物还是生产化肥、农药、药品的优质原料。随着人类生活水平的提高，油茶营养价值被广泛认知，茶油市场需求空间的急剧增加，然而，目前的茶油产量远远不能满足人们日常生活的需要，油茶低产低效严重制约产业的发展。油茶低产低效的重要原因之一就是良种化程度低，优良品种亩产茶油可达75kg以上，是现有林分产量的10倍以上，而目前油茶的优良品种有200多个，如何将这些油茶良种尽快应用于生产，从而提高整个油茶产业的产量水平，育苗技术和产业化水平是关键。目前，油茶种苗繁育主要采用芽苗砧嫁接育苗，但芽苗砧嫁接育苗出圃时间长，而且受育苗季节的限制，难以满足全国油茶产业发展对油茶优良无性系的要求，油茶组织培养快速繁育成为必然趋势。
油茶属于喜干旱植物，根系在不透气的情况下较难生根，因此油茶组织培养普遍面临生根困难的技术瓶颈，虽然采用瓶外生根的方法能提高生根率，但由于细菌等污染较为严重，不能满足基因改良过程中如转基因等操作的要求；同时油茶品种繁多，在不同品种生长习性方面有差异，因此不同品种之间各个阶段的培养基成分及处理都有很大的差异，利用现有技术培育‘华硕’等近年选育的品种不能达到预期的效果，更不能满足工厂化育苗的要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种油茶组织培养快速繁殖方法。
为了实现本发明目的，本发明的一种油茶组织培养快速繁殖方法，包括外植体消毒、初代培养、继代增殖培养、生根培养和移栽的步骤。其中，生根培养使用的生根培养基，其制备方法为：配制含0.5mg/L IBA的1/2MS琼脂培养基，其中琼脂为7-10g/L，pH值5.0-5.5(优选7g/L，pH值5.5)，用网兜包好粉碎的珍珠岩，放入融化的培养基中，待珍珠岩充分吸收培养基后，稍沥干，灭菌，即得。
外植体消毒具体为：取油茶新梢抽出5-10cm，叶片数4-6片的枝条作为外植体，用水冲洗8-15min，然后浸泡于75％酒精中10-60s，用水冲洗后，再用0.1％HgCl2处理2-4min，最后用无菌水冲洗3-5遍。
初代培养具体为：将消毒好的外植体接入初代培养基中，暗培养1-3d后，在光照条件下培养20-25d，培养温度为26±1℃。所述初代培养基为：MS+1-4mg/L6-BA+0.05-0.2mg/L IAA+30g/L蔗糖+琼脂7-10g/L，pH5.4-5.8。优选6-BA为2mg/L，IAA为0.05或0.2mg/L。
前述光照条件为：光照强度1800-2000lx，光照时间14-16h/d。
继代增殖培养具体为：将初代培养的外植体的无菌组织茎段切下接种到继代培养基中，进行不定芽的继代增殖培养；培养条件为：暗培养1-3d后，在光照条件下培养25-30d；培养温度为26±1℃。所述继代培养基为：MS+2-4mg/L6-BA+0.05-0.2mg/L IBA+30g/L蔗糖+琼脂7-10g/L，pH5.4-5.8。优选6-BA为2-3mg/L，IBA为0.05-0.1mg/L。
前述光照条件为：光照强度1800-2000lx，光照时间14-16h/d。
生根培养具体为：继代增殖培养后，取长至2-3cm的无菌苗进行生根培养，将无菌苗插入生根培养基中进行培养，培养温度为26±1℃；先进行暗培养5-7d，然后在光照条件下培养至生根，光照强度为1800-2000lx，光照时间14-16h/d。
移栽具体为：生根培养12-16d后，将无菌苗转移到泥炭土、珍珠岩和油茶专用肥按6:3:1的体积比混合的基质中，覆盖薄膜，保持湿度80％以上，温度27-28℃，12-18d后移栽至常温大棚或圃地中。
上述油茶组织培养快速繁殖方法特别适用于油茶品种‘华硕’。
具体地，本发明提供的一种油茶新品种‘华硕’组培快繁的方法，包括步骤：初代培养、继代增殖培养、生根培养和试管苗移栽。本发明的油茶组培快繁方法，从外植体的初代到继代培养有效地消除了褐化问题，一个腋芽诱导1-3个新芽，经过继代30d左右增殖系数5-10，取长至2-3cm的无菌苗，以经过8-16目筛的珍珠岩为主，混合琼脂培养基作为生根基质，生根率达到95％以上，且根系健壮，移栽成活率90％以上，较原有的技术体系更为完善和简便，为油茶转基因以及其他研究，新品种快速繁育提供了技术支持，具体如下：
(1)外植体的消毒：从每年3月份油茶刚抽稍开始，取油茶轻度木质化枝条(一般为油茶新梢抽出5-10cm，叶片数4-6片)作为外植体，用自来水冲洗10min左右，然后依次用75％酒精处理10s，用0.1％HgCl2处理3min。穗条采集时间自第一次采穗开始每推迟10天，酒精和HgCl2的处理时间分别增加15s和1min。这样才能保证不同时期的外植体充分脱毒且不易褐化，然后用无菌水冲洗3-5遍。
(2)初代培养：将消毒好的外植体接入初代培养基MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/L IAA中获得无菌组织茎段；暗培养1-3d后，在光照条件下培养20-25d；培养温度为26±1℃，光照强度为1800-2000lx，光照时间14-16h/d。
(3)继代增殖培养：将初代诱导的无菌组织茎段切下接种到MS+2.0-3.0mg/L6-BA+0.05-0.1mg/L IBA的培养基中进行不定芽的继代增殖培养，暗培养1-3d后，在光照条件下培养25-30d；培养温度为26±1℃，光照强度为1800-2000lx，光照时间14-16h/d。
(4)生根培养：取长至2-3cm的无菌苗进行生根培养，生根培养基制备：将膨胀珍珠岩在流水下进行清洗，去除杂质，在阴凉处晾干，分别稍微粉碎过8-16目筛备用。按照1/2MS+IBA0.5mg/L配制琼脂培养基，其中琼脂为7g/L，调节pH为5.5左右。用尼龙网包好粉碎的珍珠岩，放入融化的培养基中约10min，待珍珠岩充分吸收培养基后，提起稍沥干，装入组培瓶中，厚度2-3cm，高温灭菌。冷却后将无菌苗接入其中进行培养，培养温度为26±1℃；暗培养5-7d，再转到光照下培养8-10d生根，光照强度为1800-2000lx，光照时间14-16h/d。
(5)试管苗移栽：生根培养14d后，在温室中打开培养瓶瓶盖2-3d后，小心取出试管苗，直接种植到已消毒的基质(基质配比为泥炭土:珍珠岩:油茶专用肥＝6:3:1)，组培苗移栽后覆盖薄膜，保持湿度80％以上，两周后即可逐步进行正常管理，移栽成活率可达90％以上。
本发明主要以油茶优良品种“华硕”的当年生轻度木质化枝条作为外植体，分别从外植体消毒、初代培养、继代增殖培养、生根、炼苗和移栽等方面进行探索，在初代培养中探索不同时期的枝条消毒时间，为防止初代褐化及污染提供试验依据；在生根培养过程中以珍珠岩混合适量琼脂基质以使得油茶基部能透气，并提供所需养分，从而提高组培苗生根率，形成一整套专门的油茶快繁技术体系，实现油茶“华硕”的工厂化育苗，并为基因工程改良奠定了材料基础。
附图说明
图1和图2为本发明油茶初代培养初期的照片。
图3-图5为本发明油茶初代培养后期的照片。
图6和图7为本发明油茶继代培养增殖的照片。
图8和图9为本发明油茶增殖培养后期的照片。
图10-图11为本发明油茶无菌苗生根的照片。
图12为本发明油茶无菌苗移栽的照片。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的油茶专用肥购自湖南林之神旺亿农生物有机肥料有限公司。
实施例：油茶组织培养快速繁殖方法
包括以下步骤：
1、外植体的获得及初代培养
分别于2012年3月20日、3月30日、4月10日从油茶采穗圃采集当年生枝条，品种为油茶‘华硕’，用自来水冲洗10min左右，然后剪去叶片，不留叶柄；在超净工作台中用75％酒精处理10s，无菌水冲洗2-3遍，再用0.1％HgCl2处理3min，无菌水冲洗4-5遍。穗条采集时间每推迟10d，酒精和HgCl2的处理时间分别增加15s和1min(表1)；然后用手术刀切成带芽茎段，每个茎段一个芽，最后切除基部已经被酒精等杀伤的组织，接种到如表2所示的培养基中；暗培养1-3d，再转到光照条件下培养20-25d后长出无菌茎段，诱导率可达93％左右。附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.4-5.8；培养温度为26±1℃，光照强度为1800-2000lx，光照14-16h/d。
表1：不同消毒方式对油茶污染及褐化率的影响
表2：不同激素配比对油茶穗条初代培养的影响
从表2可以看出，MS+2.0mg/L6-BA+0.05mg/L-0.2mg/L IAA效果最好。
2、继代增殖培养
将初代培养芽进行增殖培养，激素配比见表3，暗培养1-3d，再转到光照条件下培养25-30d，最高增殖系数可达到10左右。附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.5。培养温度为26±1℃，光照强度为1800-2000lx，光照14-16h/d。
结果表明：MS培养基+2-3mg/L6-BA+0.05-0.1mg/L IBA效果最好。
表3：不同激素配比对油茶无菌苗增殖系数的影响
3、生根培养
取长至2-3cm的无菌苗进行生根培养。
生根培养基制备：将膨胀珍珠岩在流水下进行清洗，去除杂质，在阴凉处晾干，分别稍微粉碎过8目、16目和60目筛备用。按照1/2MS+IBA0.5mg/L配置琼脂培养基，其中琼脂为7g/L，调节pH为5.5左右。用尼龙网包好粉碎的珍珠岩，放入融化的培养基中约10min，待珍珠岩充分吸收培养基后，提起稍沥干，装入组培瓶中，厚度约3-5cm，高温灭菌。冷却后将无菌苗接入其中进行培养，培养温度为26±1℃；暗培养5-7d，再转到光照下培养8-10d生根，光照强度为1800-2000lx，光照时间14-16h/d。
结果发现：珍珠岩粉碎经过16目筛具有较好效果(表4)。
表4：不同粒度珍珠岩对试管苗生根的影响
| 珍珠岩粒度 | 成活率 | 生长状况 |
| 8目 | 94％ | 生长较弱，主要集中在表面 |
| 16目 | 95％ | 生长健壮、根系浓密、根毛发达 |
| 60目 | 84％ | 生长健壮、根系纤弱 |
| 对照(无珍珠岩) | 20％ | 生长健壮，不能深入基质 |
4、试管苗的移栽
生根培养14d后，开始为移栽前炼苗。油茶组培苗需炼苗3-4d，然后将组培苗移至无纺布营养杯中，基质为泥炭土、珍珠岩和油茶专用肥按6:3:1的体积比混合，组培苗移栽后覆盖薄膜，保持湿度80％以上，温度27-28℃，16d后移栽至常温大棚或圃地中，移栽成活率可达90％以上。
图1和图2为本发明油茶初代培养初期的照片，图3-图5为本发明油茶初代培养后期的照片，图6和图7为本发明油茶继代培养增殖的照片，图8和图9为本发明油茶增殖培养后期的照片，图10-图12为本发明油茶无菌苗生根和移栽的照片。
本发明提供的油茶新品种‘华硕’的组织培养快速繁育技术，在初代培养中确定了不同时期油茶穗条的最佳消毒时间，有效地防止了油茶组织培养污染、褐化严重等问题；在继代增殖过程中，筛选出适合油茶增殖的最佳配方，增殖系数远大于现有配方，为油茶大量繁殖提供技术支撑；更重要的是，解决了油茶生根难的大问题，本发明以一定颗粒度的珍珠岩为培养基，混合琼脂培养基组成生根基质，使得油茶根系能够充分呼吸，改变了传统的配方，大大提高油茶组培生根率，解决了油茶生根难的问题，为油茶新品种‘华硕’的组织培养工厂化育苗和基因工程改良奠定了技术基础。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (1)
1.油茶品种‘华硕’的组织培养快速繁殖方法，包括外植体消毒、初代培养、继代增殖培养、生根培养和移栽的步骤，其特征在于，
外植体消毒具体为：取油茶新梢抽出5-10cm，叶片数4-6片的枝条作为外植体，用水冲洗8-15min，然后浸泡于75％酒精中10-60s，用水冲洗后，再用0.1％HgCl2处理2-4min，最后用无菌水冲洗3-5遍；
初代培养具体为：将消毒好的外植体接入初代培养基中，暗培养1-3d后，在光照条件下培养20-25d，培养温度为26±1℃；所述初代培养基为：MS+1-4mg/L6-BA+0.05-0.2mg/L IAA+30g/L蔗糖+7-10g/L琼脂，pH5.4-5.8；光照条件下培养时光照强度为1800-2000lx，光照时间14-16h/d；
继代增殖培养具体为：将初代培养的外植体的无菌组织茎段切下接种到继代培养基中，进行不定芽的继代增殖培养；培养条件为：暗培养1-3d后，在光照条件下培养25-30d；培养温度为26±1℃；所述继代培养基为：MS+2-4mg/L6-BA+0.05-0.2mg/L IBA+30g/L蔗糖+7-10g/L琼脂，pH5.4-5.8；光照条件下培养时光照强度为1800-2000lx，光照时间14-16h/d；
生根培养具体为：继代增殖培养后，取长至2-3cm的无菌苗进行生根培养，将无菌苗插入生根培养基中进行培养，培养温度为26±1℃；先进行暗培养5-7d，然后在光照条件下培养至生根，光照强度为1800-2000lx，光照时间14-16h/d；所述生根培养基的制备方法为：按照1/2MS+0.5mg/L IBA配制琼脂培养基，其中琼脂为7g/L，pH值5.5，用网兜包好粉碎的过16目筛的珍珠岩，放入融化的培养基中，待珍珠岩充分吸收培养基后，稍沥干，灭菌，即得；
生根培养12-16d后，将无菌苗转移到泥炭土、珍珠岩和油茶专用肥按6:3:1的体积比混合的基质中，覆盖薄膜，保持湿度80％以上，温度27-28℃，12-18d后移栽至常温大棚或圃地中。
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