CN114793659B

CN114793659B - 一种成龄栗属植物良种快繁方法

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Publication number: CN114793659B
Application number: CN202210556818.6A
Authority: CN
Inventors: 郭素娟; 任鹏; 王桂云; 孙小兵
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2022-05-19
Filing date: 2022-05-19
Publication date: 2023-11-03
Anticipated expiration: 2042-05-19
Also published as: CN114793659A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种成龄栗属植物良种快繁方法。本发明提供一种成龄栗属植物良种快繁方法，包括：获取经组织培养获得的成龄栗属植物接穗；获取由栗属植物种子经组织培养获得的砧木；将所述栗属植物接穗与所述砧木进行微体嫁接，以便获得嫁接苗；对所述嫁接苗进行炼苗、移栽培养。该方法有效解决了因成龄栗属植物良种组织培养生根困难，导致繁殖效率低，制约栗产业良种快速推广等问题，极大地推动了栗产业化水平的提高。

Description

一种成龄栗属植物良种快繁方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种成龄栗属植物良种快繁方法。

背景技术

栗树是壳斗科栗属植物。世界上栗属植物约10种，中国栗属的原生种有板栗、锥栗和茅栗3种。其中，板栗早在6000年前就被人们采集食用，被称为“铁杆庄稼”、中国重要的传统木本粮食树种。板栗在我国的地理分布较广，南至18°30′N的海南岛，北至41°20′N的吉林永吉马鞍山，南、北纬度差23°；西至雅鲁藏布江河谷，东至台湾地区(122°E)；分布区跨越寒温带、温带、暖温带、亚热带、边缘热带，除青海、新疆、内蒙古、宁夏等省(自治区)外，分布于24个省(自治区、直辖市)市。锥栗和茅栗主要分布在秦岭以南广大亚热带丘陵山区。板栗在南北方均种植，其中湖北、陕西、河北、山东、安徽、河南等省，种植面积较大。2020年联合国粮农组织(FAO)统计显示，我国板栗栽培面积180万hm2，年总产量196.5万t，居世界首位。

栗种质资源丰富，栽培历史悠久。其营养价值可与大米相媲美，并且具有小麦之长处，优于玉米或水稻，还具有“一代种，多代享”的特点，素有“摇钱树”之称，集融生态、经济、社会、碳汇和文化功能于一体。

中国栗具有抗疫病强、品质好，易剥内皮等性状。从20世纪60年代初到2020年，累计选育审定栗品种130多个，但其中实生选种占95％以上。我国栗育种最显著的成果是实生选种和引种栽培。实生选种的栗品种栽培面积达130多万hm²。目前，板栗在生产中仍然以实生苗嫁接繁殖为主，板栗苗木的良种化水平低。通过直播培育实生苗砧木，造林缓苗期长，成活后再嫁接良种，由于受季节的限制严重，成活率在不同品种间有所差异较大，嫁接效率低，建园较慢，严重制约了栗属植物良种推广应用和栗产业快速发展。

扦插具有简单易行的特点，关于板栗扦插生根的研究有一些报道(胡婉仪，1900；刘勇，1997；杜常健，2021)，但是由于扦插生根极困难，繁殖系数等因素的限制，扦插育苗很少应用在生产实践中。植物组织培养具有繁殖快、繁殖系数高、繁殖材料少、不受季节限制、可周年生产、后代性状更加整齐一致等优势，短时间内可以生产出大量组培苗。目前，关于栗组织培养的报道(邓小梅等,2018；郭素娟等， 2005；GoncalvesJCetal.,1998；MullinsKV，1987；VieitezAMetal.(1980)主要集中于外植体选择、无菌培养体系建立等，而栗组织培养生根困难等问题，仍是制约板栗良种快繁的瓶颈。虽然优种板栗成熟胚组织培养快繁育苗获得成功，但以成熟胚为外植体进行组织培养，获得的组培苗并不能完全保持优种的性状。可见，成龄栗属植物良种组织培养生根难的问题，仍未取得突破性进展。因此探索成龄栗属植物良种快繁方法意义重大。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种成龄栗属植物良种快繁方法，该方法有效解决了因成龄栗属植物良种组织培养生根困难，导致繁殖效率低，栗产业良种快速推广慢等问题，极大地推动了栗产业化水平的提高。

为此，本发明第一方面提供一种成龄栗属植物良种快繁方法。根据本发明的实施方案，所述成龄栗属植物良种快繁方法包括：

(1)获取经组织培养获得的栗属植物接穗；

(2)获取由栗属植物种子经组织培养获得的砧木；

(3)将所述栗属植物接穗与所述砧木进行微体嫁接，以便获得嫁接苗；

(4)对所述嫁接苗进行炼苗、移栽培养。

本发明采用栗属植物种子胚方组织培养获得的组培苗为砧木，以成龄栗属植物良种茎段组织培养获得的不定芽(嫩茎)为接穗，进行微体嫁接，成功实现了成龄栗属植物良种快繁。

根据本发明的实施方案，在步骤(1)中，所述栗属植物接穗通过以下方法获得：

1)获取栗属植物茎段作为外植体；

2)对所述外植体进行表面消毒，获得消毒后的外植体；

3)将所述消毒后的外植体接种到不定芽诱导培养基中，以便获得不定芽；

4)将所述不定芽接种到增殖培养基中，以便实现不定芽继代增殖培养；

5)将经增殖培养的不定芽接种到不定芽伸长培养基中，以便获得所述栗属植物接穗。

根据本发明的实施方案，所述外植体源自新梢旺盛生长期到新梢半木质化期的栗属植物茎段。

新梢旺盛生长期到新梢半木质化期的栗属植物茎段，枝条未木质化，代谢旺盛、营养充足，更适宜做栗属植物组织培养的外植体。

根据本发明的实施方案，在步骤2)中，利用4-6％的NaClO溶液对所述外植体消毒，此浓度下的NaClO溶液对外植体消毒效果更好。

根据本发明的实施方案，对所述外植体消毒的时间为18-22min。

根据本发明的实施方案，所述不定芽诱导培养基中含有6-BA和IBA。

根据本发明的实施方案，所述6-BA浓度为0.5mg/L或2.0mg/L。

根据本发明的实施方案，所述IBA浓度为0.1mg/L-0.2mg/L。

上述含有特定浓度的6-BA和/或IBA的不定芽诱导培养基，能够进一步提升外植体的不定芽诱导率。

根据本发明的实施方案，所述不定芽诱导培养基进一步包括基本培养基，所述基本培养基为MS培养基。由此能够进一步提升外植体的不定芽诱导率，不定芽长势好，无褐化。

根据本发明的实施方案，所述增殖培养基中含有ZT和NAA。

根据本发明的实施方案，所述ZT浓度为1.0mg/L或2.0mg/L。

根据本发明的实施方案，所述NAA的浓度为0.1mg/L-0.15mg/L。

在上述含有特定的ZT和/或NAA浓度的增殖培养基条件下，能够进一步提升增殖系数，更有利于不定芽继代分化。

根据本发明的实施方案，所述增殖培养基中含有的基础培养基为GD培养基。由此能够进一步提升增殖系数，更有利于不定芽继代分化。

根据本发明的实施方案，所述增殖培养基的pH值为5.4-5.8。增殖培养基pH值在此范围内，能够进一步提升增殖系数，且培养获得的不定芽叶片深绿色，增殖多，长势好，健壮，更有利于不定芽的继代增殖培养。

根据本发明的实施方案，所述不定芽伸长培养基包括6-BA和NAA。

根据本发明的实施方案，所述6-BA浓度为1.0mg/L-1.5mg/L。培养基中添加特定浓度的生长素，更有利于不定芽的诱导，提升不定诱导率。根据本发明的实施方案，所述NAA浓度为0.1mg/L-0.2mg/L。由此能够进一步提升不定诱导率。

根据本发明的实施方案，所述不定芽伸长培养基中含有的基础培养基为WPM培养基。由此能够进一步提升不定诱导率。

根据本发明的实施方案，在步骤(2)中，所述栗属植物种子预先进行低温层积催芽。

根据本发明的实施方案，通过以下方法获得所述砧木：

a)对经低温层积催芽的所述栗属植物种子进行消毒处理；

b)将消毒后的栗属植物种子在PVP溶液中切割获得带胚乳的种胚，

c)将所述种胚接种于胚培养基中，以便获得组培苗；

d)获取所述组培苗的茎尖，将其作为外植体进行增殖培养和生根诱导，以便获得作为砧木的组培苗。

根据本发明的实施方案，所述种胚大小为(0.4-0.6)cm×(0.4-0.6)cm×(0.4-0.6)cm。种胚大小在此范围内，消毒效果较高，污染率低，褐化率。外植体体积越小，其与消毒液的有效接触面积越大，消毒效果也就越好，污染率低；但种胚切割越小，其外层乳也越少，胚乳可以隔离种胚和消毒液直到保护胚的作用，所以种胚切割越小对胚的伤害越大，其褐化率也就越高。

根据本发明的实施方案，所述PVP溶液的浓度为1.0mg/L。

根据本发明的实施方案，所述胚培养基含有PVP。

根据本发明的实施方案，所述PVP的浓度为1.0mg/L。

特定浓度的PVP能够进一步抑制种胚褐化现象，提升种胚萌发率。

根据本发明的实施方案，所述胚培养基进一步含有6-BA和NAA。根据本发明的实施方案，所述6-BA浓度为1.0mg/L或2.0mg/L。

根据本发明的实施方案，所述NAA浓度为0.5mg/L。

根据本发明的实施方案，所述胚培养基中含有的基础培养基为WPM培养基。

经过特定组成的胚培养基培养后，由种胚培养获得萌发出芽和根，形成完整植株。

根据本发明的实施方案，所述作为砧木的组培苗高度为至少3cm时，作为砧木。

根据本发明的实施方案，所述栗属植物接穗的长度为3-4cm。该接穗的长度能够进一步提升微体嫁接的成功率。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了栗树接穗的获取过程；

图2显示了由栗树种子经组织培养获得砧木的过程；

图3显示了将栗树接穗与砧木进行微体嫁接，获得嫁接苗的过程。

具体实施方式

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

实施例的实验中所用到的试剂，如无特殊说明，均可通过市售获得。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本公开的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

根据本发明一个具体的实施方案，本发明提供一种成龄栗树良种快繁方法，包括：

(1)获取经组织培养获得的栗树接穗；

(2)获取由栗树种子经组织培养获得的砧木；

(3)将所述栗树接穗与所述砧木进行微体嫁接，以便获得嫁接苗；

(4)对所述嫁接苗进行炼苗、移栽培养。

根据本发明一个具体的实施方案，接穗的培养如附图1所示，培养过程主要包括：以栗树良种为材料(A图)；取栗树嫩枝(B图)；获取外植体并进行消毒培养(C图)；对外植体进行不定芽的诱导(D图)；对不定芽进行增殖培养(E图)；对不定芽进行继代和伸长培养(F图)。

根据本发明一个具体的实施方案，接穗的培养具体如下：

1)外植体的消毒灭菌：在成龄栗树良种新梢旺盛生长期到新梢半木质化期，取新梢茎段作为外植体，采用5％的NaCIO溶液中浸泡20min进行表面灭菌；

2)不定芽的诱导：将表面灭菌后的外植体接种于MS+6-BA0.5mg/L或 2.0mg/L+IBA0.1mg/L培养基中诱导不定芽；

3)板栗继代培养：以GD+6-BA1.5mg/L/2.0mg/L+NAA0.1mg/L为增殖培养基，添加蔗糖30g/L，pH5.6；

4)不定芽伸长培养：以WPM+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L为不定芽伸长培养基。

根据本发明一个具体的实施方案，砧木的培养如图2所示，培养过程主要包括：选择合适的栗树种子(A图)；胚方消毒灭菌萌发成苗(B图)；茎尖不定芽诱导(C图)；增殖培养(D图)；继代培养(E图)；生根培养(F图)。

根据本发明一个具体的实施方案，砧木的培养具体如下：

1)选择河北省迁西县国审板栗品种‘燕山早丰’饱满、大小一致、无病虫害的种子为试验材料，9月份采种后需要进行3个月左右的低温层积催芽；

2)胚方消毒灭菌：板栗种子进行消毒灭菌，共进行两次消毒，第一次消毒灭菌处理，用5％NaClO溶液消毒20min，在1g/L PVP溶液中用灭菌过的手术刀将种子去皮，并以胚为中心切成0.5cm×0.5cm的胚方；用3％NaClO溶液进行第二次消毒灭菌15min；

3)胚方培养：将配方接种于以WPM+6-BA 1.0mg/L或2.0mg/L+NAA 0.5mg/L培养基，添加蔗糖30g/L进行培养。先进行遮光暗培养20d，再进行光培养10d。长成一棵完整植株。

根据本发明一个具体的实施方案，微体嫁接过程如图3所示，主要包括：将接穗嫁接在砧木上(A图)；炼苗后移植培育(B图)；获得栗树微体嫁接苗(C图)。

根据本发明一个具体的实施方案，微体嫁接过程如下：

1)当胚方组培苗达到3cm时即可作为砧木，以3-4cm长的成龄‘燕山早丰’组培微枝为接穗，进行微体嫁接；

方法如下：在接穗下端1-1.5cm处两边平直地削成两个马耳形削面，使接穗呈木楔形，砧木在离基部3cm处剪断，要一次剪平，在剪口处用手术刀将砧木从中间劈开，插入接穗，注意有一边双方形成层，从上而下对齐，接穗伤口露出接口0.5cm，用包扎材料parafilm膜把伤口扎紧包严；

2)炼苗:

将装有‘燕山早丰’嫁接苗培养瓶拿到炼苗室，练苗室温25±1℃，空气相对湿度80％，光照强度2000-3000lx，光周期为光培养16h(6:00-22:00)和暗培养8h(22:00-6:00)。在练苗室去掉组培瓶封口膜炼苗5d，再注水炼苗3d；

3)培养和移植培育：

将嫁接苗移植于温室中继续培养，环境条件为温度26℃，相对温度80％，光培养16h/d，暗培养8h/d。

下面将结合实施例对本公开的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本公开，而不应视为限定本公开的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1接穗的培养

接穗的培养过程如图1所示，具体如下：

(1)外植体获取：以河北省迁西县板栗园生长健壮，茎芽饱满，无病虫害、20年生的国审板栗品种‘燕山早丰’优种为试验材料，于5月至7月采集其当年新抽生的未木质化幼嫩营养枝的茎段为外植体(简称茎段)。生长季节板栗成龄茎段初代培养外植体最佳取材时期以5月初到6月初最好，即新梢旺盛生长期到新梢半木质化期，此期间的枝条未木质化，代谢旺盛、营养充足，适宜做板栗组织培养的外植体。

从表1可以看出，萌发率受污染率和褐化率的共同影响，而且不同生长时期的外植体其污染率、褐化率和萌发率有显著差异(p＜0.05)。在4月25日取样时的污染率为15.56％，显著低于其它处理。褐化率在4月25日和5月25日取样时期最低均为4.44％，且与其它取样时期的差异显著。萌发率在5月10日和5月25日取材时的萌发率最高分别为61.11％和63.33％，且差异不显著，而在6月9日取材时的萌发率为34.45％，仅次于5月份。6月 9日后新梢开始停止生长，含内生菌较多，污染率和褐化率增高、萌发率下降，不再适宜进行板栗的初代培养。

表1不同取材时间对板栗不定芽启动培养污染率、褐化率、萌发率影响的多重比较

外植体采集时间	污染率/％	褐化率/％	萌发率/％
				4月25日	15.56eD	4.44dD	30.00cC
5月10日	30.00cdC	4.44dD	61.11aA
				5月25日	27.78dC	6.67cdD	63.33aA
6月09日	31.11cC	23.33aA	34.45bB
				6月24日	84.44bB	21.11bB	6.67dD
7月09日	91.11aA	6.67cBC	0.00dD

所以，综合来看，生长季节板栗成龄茎段初代培养外植体最佳取材时期以5月初到6 月初最好，即新梢旺盛生长期到新梢半木质化期，此期间的枝条未木质化，代谢旺盛、营养充足，适宜做板栗组织培养的外植体。

(2)外植体表面灭菌：将茎段除去其叶片等多余部分，用自来水将外植体表面冲洗干净，用毛刷刷去杂物，然后用洗衣粉浸泡20min，再切取1.0cm左右带芽茎段为外植体，在流水下冲洗2h后用蒸馏水冲洗4遍。然后在超净工作台中(无菌条件下)，用75％酒精快速灭菌30s后，无菌水冲洗4遍，再用次氯酸钠(NaClO)溶液灭菌后，无菌水冲洗4 遍，将灭菌后的外植体剪出新的切口，垂直接种到培养基上，插入深度为茎段长度的1/3-1/2。以MS为基本培养基，添加6-BA1.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7g/L，pH5.6-5.8。

表2存活率方差分析

注：*表示在住0.05水平上差异显著；**表示在0.01水平上差异显著，下同。

表3 NaClO浓度表面灭菌效果的多重比较

NaClO浓度/％	污染率/％	死亡率/％	成活率/％
				5	Aa	Cc	Aa
10	Bb	Bb	Bb
				15	Cc	Aa	Cc

注：不同字母a,b表示在0.05水平上差异显著，不同字母A，B表示在0.01水平上差异显著，下同。

表4灭菌时间表面灭菌效果的多重比较

灭菌时间/min	污染率/％	死亡率/％	成活率/％
				10	Aa	Cc	Cc
15	Bb	Bb	Bb
				20	Cc	Aa	Aa

由方差分析(表2)和多重比较(表3、表4)可知，NaClO溶液浓度对板栗成龄茎段表面灭菌效果的影响较大，灭菌时间影响较小。对板栗成龄茎段进行表面灭菌的最佳组合是5％的 NaClO溶液中浸泡20min。

(3)不定芽诱导：采用L₉(3⁴)正交设计的培养基中，以MS为基本培养基，设置A细胞分裂素(6-BA、KT、CPPU)，B细胞分裂素浓度(0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L)，C 生长素种类(NAA、IBA、IAA)、D生长素浓度(0.0mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L)4个因素，每个因素3个水平，筛选不定芽诱导过程中最佳的激素配比。培养基中分别添加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.6-5.8。

从表5看出，板栗带芽茎段接种在9种基本培养基上均能诱导出不定芽，但不定芽诱导率由高到低依次为：MS＞SH＞LS＞Miller＞DKW＞WPM＞B₅＞White＞GD。再由方差分析(表6)和多重比较(表7)可知，综合芽的平均诱导率和生长情况来看，不定芽诱导的最佳基本培养基为MS培养基。

表5不同培养基对不定芽诱导的影响

表6不定芽诱导率的方差分析

表7不定芽诱导率的多重比较

对不定芽诱导率进行方差分析和多重比较(如表8和表9)可知，不同激素组合极显著影响不定诱导率(p＜0.01)，诱导培养基中添加生长素有利于不定芽的诱导。综合分析得出，不定芽诱导的最佳激素组合为6-BA0.5mg/L或2.0mg/L+IBA0.1mg/L。

表8不同激素组合诱导不定芽的L₉(3⁴)正交试验方差分析表

表9不同激素组合不定芽诱导率的多重比较

(4)增殖培养：①将诱导萌发的不定芽(无菌材料)剪成1.0cm小段，接种于采用L₉(3⁴) 正交设计的培养基中，共设A培养基(MS、GD、WPM)，B ZT浓度(0mg/L、1.0mg/L、 2.0mg/L)，C生长素种类(NAA、IBA、IAA)，D生长素浓度(0.1mg/L、0.15mg/L、0.2 mg/L)四个因素，每个因素三个水平。培养基中均添加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.6-5.8；②将萌发的不定芽接种于ZT和NAA浓度含量不同的GD培养基中，ZT的浓度范围为 0-2.0mg/L，NAA浓度范围为0-0.2mg/L。试验采用二因素二次回归正交试验设计，进行 ZT和NAA浓度和配比的筛选；③将诱导4周后的板栗不定芽接种于不同pH值的GD培养基中，高压灭菌前用1N的NaOH(氢氧化钠)溶液调节pH值，共设置五个pH值分别为： 5.2、5.4、5.6、5.8和6.0，并添加蔗糖30g/，琼脂7g/L，无植物生长调节剂。以对比不同 pH值对板栗不定芽继代分化的影响。

方差分析和多重比较(表10和表11)可知，不同培养基和激素组合极显著的影响增殖系数(p＜0.01)。当培养基为GD时，增殖系数最高达到3.24，极显著高于其他培养基。当ZT浓度为1.0mg/L和2.0mg/L时，增殖系数分别为2.41和2.53差异不显著。对于生长素来说，当以NAA为生长素时，增殖系数最高2.64，显著高于其他生长素的处理。生长素浓度为0.1mg/L，增殖系数最大为2.62，显著高于其它处理，然而随着生长素浓度的提高，增殖系数却明显呈下降趋势。所以综合以上分析，可以得出增殖培养的最佳培养基和激素组合为GD+ZT1.0mg/L或2.0mg/L+NAA0.1mg/L。

表10不同培养基及激素组合增殖系数的方差分析表

表11不同培养基及激素组合增殖系数的多重比较

将表12中χ₁与χ₂置信区间代入Zj＝Z₀j+Δjχ_j，可以算出χ₁、χ₂在95％置信区间的实际用量分别为1.02mg/L-1.977mg/L和0.102mg/L-0.156mg/L，即当培养基中ZT浓度和NAA的浓度分别控制在该范围内时，不定芽增殖系数大于2.9，其可靠性为95％。

表12回归方程的显著性检验

表13不同pH值对增殖系数的方差分析表

方差分析和多重比较(表13)发现，培养基的pH值对不定芽的增殖系数有极显著影响。当pH值为5.6时，增殖系数最大为3.23，显著高于其它处理，且叶片深绿色，增殖多，长势好，健壮。可见，当培养基的pH值为5.6时，更有利于不定芽的继代增殖培养。

(5)不定芽伸长培养：将经过增殖培养的不定芽接种于采用L9(3⁴)正交设计的伸长培养基中，共设A培养基(1/2MS、WPM、LS)，B 6-BA浓度(0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L)， CNAA浓度(0.0mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L)四个因素，每个因素三个水平。培养基中均添加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.6-5.8。

由方差分析和多重比较(如表14和表15)可知，不同激素组合极显著影响不定诱导率 (p＜0.01)，诱导培养基中添加生长素有利于不定芽的诱导。

表14不同激素组合伸长培养的L₉(3⁴)正交试验方差分析表

表15不同激素组合生长系数的多重比较

实施例2砧木的培养

砧木的培养过程如图2所示，具体如下：

(1)选择河北省迁西县国审板栗品种‘燕山早丰’饱满、大小一致、无病虫害的种子为试验材料，9月份采种后需要进行3个月左右的低温层积催芽。

(2)将完整的板栗种子首先用清水清洗3遍，然后用洗洁精水清洗一遍，并用牙刷把外部泥土、菌类等冲洗干净，再用流水将其冲洗30min。然后在超净工作台中，第一次消毒灭菌处理，用75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，再用5％NaClO溶液消毒20min，无菌水冲洗3次，将消毒后的种子放在托盘中，托盘中倒入灭菌后的1g/L PVP溶液中，用灭菌过的手术刀将种子去皮以胚为中心切成0.5cm×0.5cm带胚乳的小方块，第二次消毒灭菌处理，将切割好的种胚用75％的酒精消毒30s，然后用NaClO溶液消毒数分钟，无菌水冲洗3次，用滤纸吸干其表面的水分，接种于胚培养基WPM+6-BA 1.0mg/L或2.0mg/L+NAA 0.5mg/L中，先遮光培养20d，然后在组培室正常光周期下进行培养。15d萌发出芽和根，30d可长成一棵完整植株。

由表16可知，不同种胚切割大小对种胚培养的污染率、褐化率、萌发率、萌发时间有极显著影响(P＜0.01)。但显著高于其它处理，这是因为外植体体积越小，其与消毒液的有效接触面积越大，消毒效果也就越好，污染率低；但种胚切割越小，其外层乳也越少，胚乳可以隔离种胚和消毒液直到保护胚的作用，所以种胚切割越小对胚的伤害越大，其褐化率也就越高。

种胚大小对萌发率有显著影响，当种胚大小为0.5cm×0.5cm时，萌发率最高为86.89％，极显著高于其它处理，同时种胚萌发率还受污染率和褐化率的共同影响。

表16不同种胚切割大小对种胚无菌体系建立的影响

由表17可知。不同PVP处理对种胚培养的褐化率、萌发率有极显著影响(P＜0.01)，使用PVP对褐化现象具有显著抑制作用。1g/L PVP溶液中切割种胚的萌发率最高为88.22％，与其它处理差异显著。所以综合分析可知，PVP抑制褐化效果明显，且在1g/L PVP溶液中切割种胚的效果最好。

表17不同PVP处理对种胚无菌体系建立的影响

由表18可知，不同遮光培养处理对种胚培养的萌发率和种胚培养苗高有极显著差异(P ＜0.01)。其中萌发率随暗培养时间的增加而升高，当接种后先暗培养20d后在组培室光下培养时的处理萌发率最高，为82.22％，此时，种胚萌发苗粗壮，叶片鲜绿色，长势较好。

表18不同遮光培养处理对种胚培养的影响

实施例3微体嫁接

微体嫁接过程如图3所示，具体如下：

当胚方组培苗达到3cm时即可作为砧木，以3-4cm长的成龄‘燕山早丰’组培微枝为接穗，进行微体嫁接。

方法如下：在接穗下端1-1.5cm处两边平直地削成两个马耳形削面，使接穗呈木楔形，砧木在离基部3cm处剪断，要一次剪平，在剪口处用手术刀将砧木从中间劈开，插入接穗，注意有一边双方形成层，从上而下对齐，接穗伤口露出接口0.5cm，用包扎材料parafilm膜把伤口扎紧包严。

实施例4炼苗、培养和移植培育

将装有‘燕山早丰’嫁接苗培养瓶拿到炼苗室，练苗室温25±1℃，空气相对湿度80％，光照强度2000-3000lx，光周期为光培养16h(6:00-22:00)和暗培养8h(22:00-6:00)。在练苗室去掉组培瓶封口膜炼苗5d，再注水炼苗3d。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、“一些实施方案”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种成龄栗属植物良种快繁方法，其特征在于，包括：

（1）获取经组织培养获得的栗属植物接穗；

（2）获取由栗属植物种子经组织培养获得的砧木；

（3）将所述栗属植物接穗与所述砧木进行微体嫁接，以便获得嫁接苗；

（4）对所述嫁接苗进行炼苗、移栽培养，

其中，在步骤（1）中，所述栗属植物接穗通过以下方法获得：

1）获取栗属植物茎段作为外植体；

2）对所述外植体进行表面消毒，获得消毒后的外植体；

3）将所述消毒后的外植体接种到不定芽诱导培养基中，以便获得不定芽；

4）将所述不定芽接种到增殖培养基中，以便实现不定芽继代增殖培养；

5）将经增殖培养的不定芽接种到不定芽伸长培养基中，以便获得所述栗属植物接穗，

所述外植体源自新梢旺盛生长期到新梢半木质化期的栗属植物茎段，

所述不定芽伸长培养基包括6-BA和NAA；所述6-BA浓度为1.0mg/L-1.5mgL；

所述NAA浓度为0.1mg/L-0.2mg/L，

所述不定芽伸长培养基中含有的基础培养基为WPM培养基，

通过以下方法获得所述砧木：

a）对经低温层积催芽的所述栗属植物种子进行消毒处理；

b）将消毒后的栗属植物种子在PVP溶液中切割获得带胚乳的种胚，

c）将所述种胚接种于胚培养基中，以便获得组培苗；

d）获取所述组培苗的茎尖，将其作为外植体进行增殖培养和生根诱导，以便获得作为砧木的组培苗，

所述不定芽诱导培养基中含有6-BA和IBA，所述不定芽诱导培养基中含有的基本培养基为MS培养基；

所述增殖培养基中含有ZT和NAA，所述增殖培养基中含有的基础培养基为GD培养基；

所述胚培养基进一步含有6-BA和NAA，所述胚培养基中含有的基础培养基为WPM培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2）中，利用4-6%的NaClO溶液对所述外植体消毒。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，对所述外植体消毒的时间为18-22min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不定芽诱导培养基中6-BA浓度为0.5mg/L或2.0mg/L。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不定芽诱导培养基中IBA浓度为0.1mg/L-0.2mg/L。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述增殖培养基中ZT浓度为1.0mg/L或2.0mg/L。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述增殖培养基中NAA的浓度为0.1mg/L-0.15mg/L。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述增殖培养基的pH值为5.4-5.8。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（2）中，

所述种胚大小为（0.4-0.6）cm×（0.4-0.6）cm×（0.4-0.6）cm。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PVP溶液的浓度为1.0 g/L。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胚培养基含有PVP。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述胚培养基中PVP的浓度为1.0 g/L。

13.根据权利要求9-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述胚培养基中6-BA浓度为1.0mg/L或2.0mg/L。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述胚培养基中NAA浓度为0.5mg/L。

15.根据权利要求9-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述作为砧木的组培苗高度为至少3cm时，作为砧木。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述栗属植物接穗的长度为3-4cm。