CN111264383B - 一种同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法，属于植物组织培养以及良种选育领域。本发明提供的一种同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法，包括如下步骤：无菌体系的建立；离体的种质保存与田间性状观测同步进行；新品系的快速繁殖。本发明对选育出的姜花新品系进行性状观察的同时，对姜花新品系进行离体培养种质保存，当选出新品系后回溯至离体保存的种质，迅速进行种苗的扩繁，可实现姜花新品系的多年多点试验和大规模种植。本发明利用果实对种子的包裹，建立无菌体系的特点，以无菌处理简单、效率高、种子萌发速度快、杂交后代存活率高的优点，使得整个过程比常规先性状观测后采用根茎分株繁殖的时间大大缩短。

Description

一种同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法

技术领域

本发明涉及一种同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法，属于植物组织培养以及良种选育领域。

背景技术

姜花属Hedychium是姜科Zingiberaceae植物中少有的芳香花卉品种，广受人们的喜爱。目前全世界已培育出不少姜花属园艺品种，花型奇特、花色丰富并具有怡人的香气，可作为园林应用、切花等，具有良好的开发前景。姜花属植物为异花授粉植物，在F1代出现广泛的性状分离，可直接从中选育具有较高观赏价值的新品种，并进行推广应用。传统的新品种的选育和种苗生产，通常是将收获的杂交种子播种在土壤或各种基质里，然后观测性状、筛选新品系。待新品系选出之后，再采用根茎分株繁殖的方式获取足够数量的种苗进行多年多点种植试验，最后对选育的新品系进行大规模的种苗生产以用于种植推广。由于环境条件不适或人为操作失误，杂交后代在播种、栽培等选育过程中，不可避免存在种质资源丢失问题。除此之外，育种工作耗时长，这是植物新品种选育普遍面临的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法，解决传统姜花杂交新品种选育方案种质丢失及耗时长的问题。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法，包括如下步骤：

(1)无菌体系的建立：选取姜花杂交得到种胚成熟的果实，无菌条件下，用酒精浸泡后冲洗，再进行消毒，再冲洗；然后从所述果实中取出种胚，接种于诱导种胚萌发的培养基中，于黑暗条件下培养至种胚萌动，转入光照环境中培养，即可获得无菌姜花幼苗，然后将所述无菌姜花幼苗进行编号，分别接种于增殖培养基进行继代培养，获得增殖后的无菌姜花幼苗；

(2)离体的种质保存与田间性状观测同步进行：取部分步骤(1)所述的增殖后的无菌姜花幼苗接种于种质保存培养基进行离体保存；取另一部分步骤(1)所述的增殖后的无菌姜花幼苗接种于壮苗及生根培养基，进行壮苗及生根培养，炼苗一段时间后移栽至露地种植，待花期进行生物学特性和农艺性状的观测，筛选出符合育种目标的新品系；

(3)新品系的快速繁殖：将步骤(2)筛选出的新品系与步骤(2)离体保存的无菌姜花幼苗进行编号对应，将无菌姜花幼苗接种至增殖培养基培养，再转至壮苗及生根培养基培养，然后炼苗移栽种植，即可实现新品系的快速繁殖。

在姜花的传统杂交育种中，收获杂交种子后通常是直接播种，观测性状，筛选新品系，再采用根茎进行分株繁殖，由于根茎繁殖速度较慢，如果需要推广种植，在短时间内很难达到所需要的种苗数量，以所需种苗数量为1万株计算，1粒种子的杂交后代需要经过4年才能繁殖出1万株(按每年最高增殖10倍计算)，这种选育和选育方法耗费时间长，且占用场地、劳动力、肥料农药等成本巨大。通常能想到的加快速度的方法就是筛选后进行离体快速繁殖。然而这种方法存在着利用根茎为外植体建立无菌体系困难、耗费时间长、效率低的问题。

本发明巧妙地利用果实对种子的包裹，容易建立无菌体系的特点，将无菌处理前移，同时还拥有无菌处理简单、效率高、种子萌发速度快、杂交后代存活率高等优点，整个过程比常规先性状观测后采用根茎分株繁殖大大缩短。那些未能选育为新品系的杂交后代也是宝贵的种质，包含有大量特点各异的性状，可用于进一步的育种改良。由于离体培养的种质可在培养室长期保存，不占场地，维持成本低，为节省场地、资金和劳动力，可以清理除新品系之外的杂交后代在田间的保存，释放育种场地用于新的杂交后代观察。当有需要用这些杂交后代进一步进行遗传改良时，再经过增殖、壮苗和生根培养、移栽，定植到田间参与新的选育。

作为本发明所述的同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法的优选实施方式，步骤(1)中，所述酒精的体积浓度为75％，所述酒精浸泡的时间60～120s，所述酒精浸泡后用无菌水冲洗3～4次；所述消毒具体为用0.10％升汞溶液消毒15～20min，然后无菌水冲洗4～6次；所述黑暗条件下培养的时间为7天。

作为本发明所述的同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法的优选实施方式，步骤(1)中，所述种胚培养至种配萌动后，转入光照环境中培养30天，获得2～3片叶的无菌姜花幼苗；所述继代培养在继代2次后，每个杂交后代可获得25～30株无菌姜花幼苗。

无菌体系的建立：选取姜花杂交后得到的饱满、无病虫害的未开裂(种胚成熟)的果实。在无菌条件下，用75％酒精浸泡60～120s后，无菌水冲洗3～4次，再用0.10％升汞溶液消毒15～20min，无菌水冲洗4～6次；将果实剥开，取出种子切开，取出种胚，接种于杂交后代种胚萌发培养基于黑暗条件下培养，培养7天后种胚开始萌动，转入光照度为2500～3500lx环境中培养，30天时萌发为带2～3片叶的幼苗。将种胚萌发成的幼苗进行编号，分别接种于增殖培养基进行继代培养，快速繁殖，继代2次后每个杂交后代可获得25～30株无菌苗。

作为本发明所述的同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法的优选实施方式，步骤(2)中，所述进行离体保存的无菌姜花幼苗为10～15株；所述进行离体保存的无菌姜花幼苗，每3.5个月转接一次；所述增殖后的无菌姜花幼苗丛切为单个，接种于壮苗及生根培养基；所述炼苗的时间为一周，所述炼苗的温度为室温，所述露地种植的基质包括泥炭、园土和粗砂。

作为本发明所述的同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法的优选实施方式，所述泥炭、园土和粗砂的质量比为1:1:1。

作为本发明所述的同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法的优选实施方式，步骤(2)中，所述无菌姜花幼苗接的种质保存培养与所述符合育种目标的新品系的筛选同时进行。

离体的种质保存与田间性状观测同步进行：将增殖得到的无菌苗分为两部分，一部分用于种质保存，同时对另一部分进行露地种植、良种筛选。取10～15株接种于种质保存培养基用于保存，每3.5个月转接一次；其余的姜花无菌苗丛切分为单个，接种于壮苗及生根培养基，诱导出根后将装有生根无菌苗的瓶盖打开，置于温室，炼苗一周后移栽至泥炭：园土：粗砂＝1：1：1(质量比)的基质，在植株花期进行生物学特性和农艺性状观测，筛选符合育种目标的新品系。

本发明对同一编号的杂交后代同步进行离体培养种质的保存和活体的性状观察，解决了传统育种方案容易导致部分种质丢失的问题。

作为本发明所述的同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法的优选实施方式，步骤(3)中，所述炼苗的时间为一周，所述炼苗的温度为室温，所述移栽种植的基质包括泥炭、园土和粗砂，所述泥炭、园土和粗砂的质量比为1:1:1。

新品系的快速繁殖：将筛选出的优良杂交后代编号对应离体保存的无菌苗，将无菌苗转接于促杂交后代幼苗增殖的培养基，进行继代培养，快速繁殖；将增殖的无菌苗接种于壮苗及生根培养基，将装有生根无菌苗的瓶盖打开，置于温室，炼苗一周后移栽至泥炭：园土：粗砂＝1：1：1(质量比)的基质，进行后续的多年多点试验和大面积推广应用。

本发明首次在对选育出的姜花新品系进行性状观察的同时，对姜花新品系进行离体培养种质保存，当选出新品系后回溯至离体保存的种质，迅速进行种苗的扩繁，可实现姜花新品系的多年多点试验和大规模种植。

作为本发明所述的同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法的优选实施方式，所述诱导种胚萌发的培养基为在MS培养基中添加1.0～3.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤(BA)、0.01～0.02mg/L苯基噻二唑脲(TDZ)、30g/L蔗糖和7g/L琼脂。

作为本发明所述的同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法的优选实施方式，所述增殖培养基为在MS培养基中添加3.0～5.0mg/L6-苄基氨基嘌呤(BA)、0.04～0.06mg/L苯基噻二唑脲(TDZ)、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂。

更优选地，所述增殖培养基为在MS培养基中添加3.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤(BA)、0.05mg/L苯基噻二唑脲(TDZ)、30g/L蔗糖以及7.0g/L琼脂。

作为本发明所述的同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法的优选实施方式，所述种质保存培养基为在MS培养基中添加0.3～0.5mg/L 6-苄基氨基嘌呤(BA)、1.0～2.0mg/L吲哚-3-乙酸(IAA)、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂。

更优选地，所述种质保存培养基为在MS培养基中添加0.3mg/L 6-苄基氨基嘌呤(BA)、1.0mg/L吲哚-3-乙酸(IAA)、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂。

作为本发明所述的同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法的优选实施方式，所述壮苗及生根培养基为在MS培养基中添加0.3～0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤(BA)、0.5～1.0mg/L萘乙酸(NAA)、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂。

更优选地，所述壮苗及生根培养基为在MS培养基中添加0.3mg/L6-苄基氨基嘌呤(BA)、1.0mg/L萘乙酸(NAA)、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂。

上述培养基的配制，参照李浚明和朱登云编“植物组织培养教程”的方法，配置培养基。

所述MS培养基的组成成分如表1所示：

表1 MS培养基的组成成分(mg/L)

作为本发明所述的同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法的优选实施方式，所述诱导种胚萌发的培养基和所述增殖培养基培养的条件均为：温度为24～26℃、光照时间为10～14h/d、光照强度为2500～3500lx。

作为本发明所述的同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法的优选实施方式，所述种质保存培养基培养的条件为：温度为20～22℃、光照时间为8～10h/d、光照强度为1000～1500lx。

作为本发明所述的同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法的优选实施方式，所述壮苗及生根培养基培养的条件为：温度为24～26℃、湿度为90～95％、光照为10～14h/d、光照强度为2000～3000lx。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供一种同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法，解决传统姜花杂交新品种选育方案种质丢失及耗时长的问题。

(2)本发明提供一种同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法，通过优选选育环节，缩短了育种时间：选用杂交得到的未开裂的果实进行无菌处理，操作简单、污染率极低，缩短了无菌体系建立的时间，提高了效率；利用种胚在实验室中进行培养，不受外界气温影响，可在不利于种子萌发的冬季迅速得到杂交后代的无菌苗，节省了选育时间；在种子萌发过程中直接切取种胚进行萌发培养，有利于拯救萌发力弱、性状优异的后代，提高了杂种后代的萌发率，提高杂种后代的成活率；本发明巧妙地利用果实对种子的包裹，容易建立无菌体系的特点，将无菌处理前移，同时还拥有无菌处理简单、效率高、种子萌发速度快、杂交后代存活率高等优点，整个过程比常规先性状观测后采用根茎分株繁殖大大缩短。

(3)本发明首次对选育出的姜花新品系进行性状观察的同时，对姜花新品系进行离体培养种质保存，当选出姜花新品系后回溯至离体保存的种质，可迅速进行姜花种苗的扩繁，以实现姜花多年多点试验和大规模种植。

(4)本发明提供一种同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法，巧妙地利用果实对种子的包裹，建立无菌体系的特点，将无菌处理前移，以无菌处理简单、效率高、种子萌发速度快、杂交后代存活率高的优点，使得整个过程比常规先性状观测后采用根茎分株繁殖的时间大大缩短。

附图说明

图1为本发明一种同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法的流程图，图中以‘橙心×寒月’姜花为例。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本实施例以‘橙心×寒月’姜花后代的杂交选育为例，说明以未开裂的杂交果实为外植体，提供本发明所述的同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法。“橙心”姜花花大而香但叶茎容易倒伏，“寒月”姜花花略小但叶茎直立、坚硬不易倒伏。发明人期望从杂交后代中选育出花较大、叶茎直立而坚硬的切花品种，并迅速为种植户提供3万株种苗。

一种同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法，包括如下步骤：

(1)无菌体系的建立：

外植体准备：选取(橙心×寒月’)姜花杂交后得到的饱满、无病虫害的未开裂的果实5个(种胚已成熟)；外植体的无菌处理及种胚的萌发：在无菌条件下，用75％酒精浸泡60s后，无菌水冲洗4次，再用0.10％升汞溶液消毒20min，无菌水冲洗6次，将果实剥开，取出种子切开，取出种胚，接种于诱导种胚萌发培养基，每个果实内有种子30～50粒，5个果实共约200个杂交后代，培养7天后种胚开始萌动，30天时萌发为带2～3片叶的姜花幼苗；将上述种胚萌发成的姜花幼苗进行编号，以亲本汉语拼音的首字母组合加序号构成，分别为CH-1至CH-200，杂交无菌苗接种于促杂交后代幼苗增殖培养基，以40天为继代周期，继代2次，进行快速繁殖；在增殖培养基上杂交姜花无菌苗的增殖倍数为每40天5～6倍，继代2次后每个杂交后代获得25～30株苗；

(2)离体的种质保存与田间性状观测同步进行：将增殖得到的无菌苗分为两部分，一部分用于种质保存，同时对另一部分进行露地种植、良种筛选；

取部分步骤(1)所述的增殖后的无菌姜花幼苗10株接种于种质保存培养基进行离体保存，每3.5个月转接一次，种植保存的条件为：20℃、光照时间8h/d、光照强度1000lx；取步骤(1)所述的除种质保存外的其他增殖后的无菌姜花幼苗丛切分为单个，按编号接种于壮苗及生根培养基进行生根诱导，诱导出根后将装有生根无菌苗的瓶盖打开，置于温室，炼苗一周后移栽至放有基质为泥炭：园土：粗砂＝1：1：1(质量比)的花盆，编号标记，移栽成活率为90％；移栽成活后定植于大田，加强肥水管理，7个月后杂交后代进入花期和果期；然后对开花期植株进行生物学特性和农艺性状观测，筛选出花大且叶茎直立、坚硬的切花用杂交后代CH-10，成为新品系；

(3)新品系的快速繁殖：

对步骤(2)筛选出的新品系进行编号，回溯至步骤(2)离体保存的姜花无菌苗，转接于促杂交后代幼苗增殖培养基，启动快速繁殖，经过5个周期约200天的继代，获得约33000万株姜花无菌苗；然后将增殖的姜花无菌苗接种于壮苗及生根培养基，将获得的装有生根无菌苗的瓶盖打开，置于温室，炼苗一周后移栽至放有基质为泥炭：园土：粗砂＝1：1：1(质量比)的花盆，成活率为90％，然后可进行后续的多年多点试验和大面积推广应用。

本实施例1的整个过程耗时23个月，筛选出既有母本花大又有父本叶茎直立、坚硬特征的杂交新品系CH-10,获得约3万株可供田间种植的种苗。除此之外，还获得了‘橙心×寒月’杂交组合的其余199个杂交后代的离体培养种质。由于橙心姜花和寒月姜花都不是纯和的亲本，杂交后代产生了广泛的分离。这些杂交后代的种质包含有大量特点各异的种质，针对不同的育成目标，可用于进一步的育种改良。离体培养的种质可在培养室长期保存，不占场地，维持成本低。因此，可以清理除新品系之外的田间种质释放育种场地用于新的杂交后代观察。当有需要用这些种质进一步进行遗传改良时，再经过增殖、壮苗和生根培养、移栽，定植到田间，参与新的杂交和选育。

以上实施例1中诱导种胚萌发的培养基、增殖培养基、种质保存培养基、壮苗及生根培养基以及各培养基的培养条件如下所示：

诱导种胚萌发的培养基为在MS培养基中添加1.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤(BA)、0.01mg/L苯基噻二唑脲(TDZ)、30g/L蔗糖和7g/L琼脂。

增殖培养基为在MS培养基中添加3.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤(BA)、0.05mg/L苯基噻二唑脲(TDZ)、30g/L蔗糖以及7.0g/L琼脂。

种质保存培养基为在MS培养基中添加0.3mg/L 6-苄基氨基嘌呤(BA)、1.0mg/L吲哚-3-乙酸(IAA)、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂。

壮苗及生根培养基为在MS培养基中添加0.3mg/L6-苄基氨基嘌呤(BA)、1.0mg/L萘乙酸(NAA)、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂。

诱导种胚萌发的培养基和所述增殖培养基培养的条件均为：温度为24℃、光照时间为10h/d、光照强度为2500lx。

种质保存培养基培养的条件为：温度为20℃、光照时间为8h/d、光照强度为1000lx。

壮苗及生根培养基培养的条件为：温度为24℃、湿度为90％、光照为10h/d、光照强度为2000lx。

实施例2

本实施例以‘勐海×寒月’姜花后代的杂交选育为例，说明以未开裂的杂交果实为外植体，提供本发明所述的同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法。“勐海”姜花具有怡人的特异性香气、花序大而饱满但花较小、花期稍短，“寒月”姜花的花较“勐海”姜花大、花期周年。本申请发明人期望‘勐海×寒月’姜花杂交后代中选育出花较母本大、花期较母本长，具有母本特异性香气的优良品系，并迅速为种植户提供3万株种苗。

一种同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法，包括如下步骤：

(1)无菌体系的建立：

外植体准备：选取杂交后得到的饱满、无病虫害的未开裂的果实5个(种胚已成熟)；外植体的无菌处理及种胚的萌发：在无菌条件下，用75％酒精浸泡60s后，无菌水冲洗4次，再用0.10％升汞溶液消毒20min，无菌水冲洗6次。将果实剥开，取出种子切开，取出种胚，接诱导种胚萌发培养基；每个果实内有种子30～50粒，5个果实共约160个杂交后代。培养7天后种胚开始萌动，30天时萌发为带2～3片叶的幼苗；将上述种胚萌发成的姜花幼苗进行编号，以亲本汉语拼音的首字母组合加序号构成，分别为MH-1至MH-200，杂交无菌苗接种于促杂交后代幼苗增殖培养基，以40天为继代周期，继代2次，进行快速繁殖；在增殖培养基上杂交姜花无菌苗的增殖倍数为每40天5～6倍，继代2次后每个杂交后代获得25～30株苗；

(2)离体的种质保存与田间性状观测同步进行：将增殖得到的无菌苗分为两部分，一部分用于种质保存，同时对另一部分进行露地种植、良种筛选；

取部分步骤(1)所述的增殖后的无菌姜花幼苗11株接种于种质保存培养基进行离体保存，每3.5个月转接一次，种质保存的条件为：22℃、光照时间10h/d、光照强度1500lx；取步骤(1)所述的除种质保存外的其他增殖后的无菌姜花幼苗丛切分为单个，按编号接种于壮苗及生根培养基进行生根诱导，诱导出根后将装有生根无菌苗的瓶盖打开，置于温室，炼苗一周后移栽至放有基质为泥炭：园土：粗砂＝1：1：1(质量比)的花盆，编号标记，移栽成活率为90％；移栽成活后定植于大田，加强肥水管理，8个月后杂交后代进入花期和果期；然后对开花期植株进行生物学特性和农艺性状观测，具有母本特殊香气但花较母本大，花期较母本长的杂交新品系MH-102，成为新品系；

(3)新品系的快速繁殖：

对步骤(2)筛选出的新品系进行编号，回溯至步骤(2)离体保存的姜花无菌苗，转接于促杂交后代幼苗增殖培养基，启动快速繁殖，经过5个周期约200天的继代，获得约34000万株姜花无菌苗；然后将增殖的姜花无菌苗接种于壮苗及生根培养基，将获得的装有生根无菌苗的瓶盖打开，置于温室，炼苗一周后移栽至放有基质为泥炭：园土：粗砂＝1：1：1(质量比)的花盆，成活率为90％，然后可进行后续的多年多点试验和大面积推广应用。

本实施例2整个过程耗时约24个月，筛选出具有母本特殊香气但花较母本大，花期较母本长的杂交新品系MH-102,获得约3.05万株可供田间种植的种苗。除此之外，还获得了‘勐海×寒月’杂交组合的其余159个杂交后代的离体培养种质。同样，由于勐海姜花和寒月姜花都不是纯和的亲本，杂交后代产生了广泛的分离。这些杂交后代的种质包含有大量特点各异的种质，针对不同的育成目标，可用于进一步的育种改良。离体培养的种质可在培养室长期保存，不占场地，维持成本低。因此，可以清理除新品系之外的田间种质释放育种场地用于新的杂交后代观察。当有需要用这些种质进一步进行遗传改良时，再经过增殖、壮苗和生根培养、移栽，定植到田间，参与新的杂交和选育。

以上实施例2中诱导种胚萌发的培养基、增殖培养基、种质保存培养基、壮苗及生根培养基以及各培养基的培养条件如下所示：

诱导种胚萌发的培养基为在MS培养基中添加3.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤(BA)、0.02mg/L苯基噻二唑脲(TDZ)、30g/L蔗糖和7g/L琼脂。

增殖培养基为在MS培养基中添加3.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤(BA)、0.05mg/L苯基噻二唑脲(TDZ)、30g/L蔗糖以及7.0g/L琼脂。

种质保存培养基为在MS培养基中添加0.3mg/L 6-苄基氨基嘌呤(BA)、1.0mg/L吲哚-3-乙酸(IAA)、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂。

壮苗及生根培养基为在MS培养基中添加0.3mg/L6-苄基氨基嘌呤(BA)、1.0mg/L萘乙酸(NAA)、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂。

诱导种胚萌发的培养基和所述增殖培养基培养的条件均为：温度为26℃、光照时间为14h/d、光照强度为3500lx。

种质保存培养基培养的条件为：温度为22℃、光照时间为10h/d、光照强度为1500lx。

壮苗及生根培养基培养的条件为：温度为26℃、湿度为95％、光照为14h/d、光照强度为3000lx。

试验例1

本试验例以不同外植体无菌处理效率进行对比，以‘橙心×寒月’姜花为例。选择‘橙心×寒月’姜花不同外植体进行无菌处理，对比‘橙心×寒月’姜花不同外植体在不同处理时间下的处理效果。

本试验中使用了三种类型的外植体：A.未开裂的果实；B.开裂的果实；C.根茎。将三种类型的外植体用75％乙醇消毒60s，然后用0.10％HgCl₂溶液分别浸泡不同时间(5、10、15、20min)，无菌水冲洗6次。将处理完的外植体接种于萌发培养基，在培养室中培养。培养30天后观察并记录污染率、死亡率。本试验中所用培养基为：在MS培养基的基础上添加30g/L蔗糖以及7g/L琼脂，不添加外源植物生长调节剂。试验设计及结果见表2

不同类型外植体的无菌处理操作步骤如下：

A:选取杂交后得到的饱满、无病虫害的未开裂的果实(授粉后两个月，种胚已成熟)；将果实用75％酒精浸泡120s后，无菌水冲洗4次，再用0.10％升汞溶液分别处理不同时间(5、10、15、20min)，无菌水冲洗6次；将果实剥开，切开种子，取出种胚，接种于杂交后代种胚萌发培养基。

B:选取杂交后得到的饱满、无病虫害的已开裂的果实(授粉后三个月)，取出种子，去除假种皮；用75％酒精浸泡120s后，无菌水冲洗4次，再用0.10％升汞溶液分别处理不同时间(5、10、15、20min)，无菌水冲洗6次，接种于杂交后代种胚萌发培养基。

C:选取健壮的、无病虫害的根茎，用75％酒精浸泡120s后，无菌水冲洗4次，再用0.10％升汞溶液分别处理不同时间(5、10、15、20min)，无菌水冲洗6次，将鳞片剥开，切下芽尖，接种于萌发培养基。

表2不同外植体的无菌处理效率对比

由表2可知，在同样的消毒处理时间下，三种不同类型的外植体中，取未开裂的果实中种子的胚作为外植体污染率最低，消毒剂致死率也低。同样以种子为外植体，开裂果实中的种子已经暴露在空气中，受到污染。此时微生物通过种子顶端的萌发孔已经进入种子内部，以至于杀菌剂难以深入种子内部。通常在培养2周的时候看不到污染的发生，但在第3～4周时，病菌不断从萌发孔长出，最终导致污染。另外，由于此时种子已经完全成熟，剥取种胚的难度很大，容易在操作过程中污染。本发明采用未开裂的果实中的种子为外植体，一方面由于有果壳的包裹，种子是无菌的，无菌处理成功率很高；另一方面这一类果实，种子还未硬化，种胚剥取十分容易，大大降低了操作过程中的污染风险。从萌发速度上看，由于没有种皮的机械障碍，种胚可迅速从培养基中吸取营养，仅在第7天就开始萌动，14天就萌发。在姜花杂交新品系的选育过程中，如果先进行性状观察和选择，再取根茎为外植体进行无菌体系的建立，由于根茎本身长期暴露在土壤及空气中，受污染较重，污染率远高于以未开裂果实中的种子为外植体。用未开裂果实的种子未外植体剥取种胚，采用未开裂果实进行无菌处理的效率，远高于以开裂果实或根茎作为外植体的效率。

试验例2

本试验例选择‘橙心×寒月’姜花的种子以不同播种方式培养，对各方式下芽的萌发速度、萌发率进行比较。姜花杂交后代不同播种方式萌发速度、萌发率的对比，以‘橙心×寒月’姜花为例，试验设计及结果见表3。本试验例中的MS培养基的成分如表1所示。

不同类型的播种方式处理操作步骤如下：

A:选取杂交后得到的饱满、无病虫害的未开裂(种胚成熟)的果实，用75％酒精浸泡120s后，无菌水冲洗4次，再用0.10％升汞溶液处理15min，无菌水冲洗6次，将果实剥开，取出种子切开，取出种胚，接种于杂交后代种胚萌发培养基。

B:选取杂交后得到的饱满、无病虫害的已开裂的果实，用75％酒精浸泡120s后，无菌水冲洗4次，再用0.10％升汞溶液处理15min，无菌水冲洗6次。取出种子，接种于杂交后代种胚萌发培养基。

C:选取杂交后得到的饱满、无病虫害的已开裂的果实，在泥炭土基质、珍珠岩基质中进行萌发培养。

表3姜花杂交后代不同播种方式萌发速度、萌发率的对比

由表3可知，由于B方式在无菌处理时十分困难，即使将0.10％升汞溶液处理的时间延长到15min，污染率也达90％，种子多数被污染致死(表2)。如果再延长升汞处理时间值20min,种子则会被消毒剂毒死。因此，在选用B方式开裂果实的种子为外植体的条件下，萌发率均低于10％。因此剥取胚接种的萌发率比直接培养种子的萌发率要高。而C方式采用泥炭土基质进行萌发，萌发率低，种子萌发不整齐。与泥炭土相比，以珍珠岩为基质，萌发稍整齐，长势略好，但萌发率仍然远远低于A方式离体萌发。

试验例3

本试验例为种质保存培养基外源植物生长调节剂种类及浓度的优化。

杂交后代在田间进行性状观测期间，为了减少室内种质保存所需场地、人力及资金，应尽可能降低转接的频次，使无菌苗在同一培养基上尽可能长时间的存活。目前，姜花的离体培养均以快速繁殖为主，缺乏长期保存种质的方法。本发明通过添加适当浓度的IAA，与BA组合，诱导无菌苗基部膨大，产生小根茎，可长时间在同一培养基上维持无菌苗的活力，实现种质保存。以‘橙心×寒月’姜花为例，试验结果见表4。

选取杂交后得到的饱满、无病虫害的未开裂(种胚成熟)的果实，在无菌条件下，用75％酒精浸泡120s后，无菌水冲洗4次，再用0.10％升汞溶液消毒20min，无菌水冲洗6次。将果实剥开，取出种子切开，取出种胚，接种于杂交后代种胚萌发培养基。培养7天后种胚开始萌动，30天时萌发为带2～3片叶的幼苗。将上述幼苗接种于促杂交后代幼苗增殖培养基，以40天为继代周期，继代2次，进行快速繁殖；将上一步获得的增殖苗，接种于不同的种质保存培养基用于保存，40天后观察记录植株生长情况。试验设计及结果见表4。

表4姜花杂交后代不同种植保存培养基对比

由表4可知，小根茎有利于养分储藏，进行种质保存，在需要增殖时改变培养基成分，即可快速启动增殖程序。而须根在未经脱分化的情况下并不具有再生能力。BA在0.3～0.5mg/L范围内，添加0.5～1.0mg/L的IAA的情况下均能很好的诱导小根茎用于种质保存。NAA主要诱导根的发生，对小根茎的诱导不明显。通常，一定量的蔗糖可以为小苗的生长提供能量，从而促进小根茎的形成。如，有报道认为在培养基中添加8～10％的蔗糖可诱导生姜的小根茎形成。但对姜花而言，蔗糖的浓度过高会引起无菌苗的死亡。

试验例4

以‘勐海×寒月’的杂交选育为例，分别采用常规选育法(田间性状选育，田间分株繁殖)、改良法(先田间性状选择后离体繁殖法)与同步选育法(田间性状选育与离体保存和繁殖同步进行)，具体流程及效率见表5。

表5同步选育和保存法与常规选育法、改良选育法耗时的比较

在姜花属的育种中，由于姜花是异花授粉植物，在F1代出现广泛的性状分离，可以直接从中选育具有观赏价值的新品种，并进行推广应用。在姜花的传统杂交育种中，收获杂交种子后通常是直接播种，观测性状，筛选新品系，再采用根茎进行分株繁殖。由于根茎繁殖速度较慢，如果需要推广种植，在短时间内很难达到所需要的种苗数量。

姜花属植物的杂交多在9～10月进行，种子成熟在12月～次年2月，此时气温低，不利于种子的迅速萌发，增加了后代选育所需的时间。

在常规选育法中：露地播种于土壤或基质的种子，约70天后才萌发；杂交种子从幼苗至开花，最快7个月，此时新品系经过7个月生产，最多可繁殖出4～8株；以初始基数为6计算，每年最高增殖10倍，如果要繁殖出3万种球，需要3.5年，总耗时需60个月。这种选育和选育方法不仅耗费时间长，且占用场地、劳动力、肥料农药等成本巨大。

改良的选育法是完成田间性状筛选后进行离体快速繁殖扩繁种苗。然而这种方法存在着利用根茎为外植体建立无菌体系困难、耗费时间长、效率低的问题，从幼苗至开花，最快7个月。此时新品系可切取新根茎数约为4～8个，在至少保存3份活体的前提下，仅有2～3个根茎用于催芽。由于以根茎为外植体污染率高，存在不能获得无菌苗的风险，即使获得无菌苗，数量也极低。因此，需先采用分株繁殖一年选育足够数量的外植体(60个)。此外，为了降低污染率，还需要将根茎在湿沙中催芽1个月，取嫩茎为外植体，获得的可选育根茎一部分(10个)保存活体，另一部分作为外植体(50)进行催芽处理，约有60～80％的根茎催芽成功；这30～40个外植体仅有30％的部分(9～12株)成为成功建立无菌苗，以获得的无菌苗为10计算，每个周期40天，增殖率约为5倍，培养5个周期获得31250株无菌苗，再加上生根、炼苗移栽的时间，总耗时约为40个月。如以叶茎为外植体建立无菌体系，由于每枝叶茎可提供比根茎多10个以上的外植体，可不必花费一年的时间繁殖根茎，无菌体系建立的时间也较短，时间可缩短14个月，总耗时约26个月。

本发明提前一个月采收种胚已成熟的种子，此时果壳尚未开裂。在种壳的保护下，种子的无菌处理简单、效率高。因每个果实包含30～100粒不等的种子，处理一个果实就能实现30～100个杂交后代的无菌化，与前述以根茎和叶茎为外植体建立无菌体系相比，实现了批量处理，操作简便而高效。本发明还通过剥取种胚接种的方式促进萌发，从接种到种胚萌动仅需要7～10天，30天左右在增殖培养基上长成带2～3片叶的无菌苗。在相同培养基上继代两次后，获得25株带2～3片叶的无菌苗。将获得的无菌苗分为两部分：A、10株转接至种质保存培养基，进行种质保存和低速增殖，3.5个月转接一次，B处理：15株转入壮苗和生根培养基培养，一个月后，对B处理进行炼苗和移栽。3.5个月后，将A处理在种质保存培养基上转接一次。7个月后，B处理的部分种苗在田间进入开花结果期，完成性状观测，选出新品系(基数为15，田间生长期7个月，分株倍数为4～8，取6计算，活体植株可繁殖为90)，离体种质保存的A部分种苗，原基数为10，增殖倍数为1.2倍，7个月后每个杂交后代的无菌苗数量为12。对照B处理选出的新品系，回溯至A处理部分相同编号的杂交后代，转接至增殖培养基上启动快速增殖。经历5个继代周期约200天，无菌苗的数量达到37500株，再经过2个月的壮苗生根及炼苗移栽，获得可种植于大田的种苗约33750株。本发明所述的一种同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法，总耗时约23个月，大大缩短了育种时间，且对所有杂交后代种质进行了离体保存，避免了环境和人为操作失误可能造成的种质丢失。

本发明巧妙地利用果实对种子的包裹，容易建立无菌体系的特点，将无菌处理前移，同时带来了无菌处理简单、效率高、种子萌发速度快、杂交后代存活率高等优点。在种苗选育节段本发明充分利用离体快速繁殖在种质保存和大规模种苗繁育中的优势，较传统先进行性状观测，选育出新品系再分株繁殖的方法缩短了时间，节省了成本。以获得3万株苗为计算标准，当对新品系的种苗需求量越大的时候，本发明的技术方案优势越明显。

但本发明的有益效果并不简单由离体培养贡献。在改良选育法中(先进行田间性状观测，再以根茎或叶茎为外植体建立无菌体系，进行种苗的快速繁殖)，也使用了离体培养的方法，但由于初期新品系的可繁殖外植体较少，在无菌处理困难的情况下难以建立无菌体系，只能多花一年时间先用分株法扩繁根茎，进而通过催芽降低污染，最终才能建立无菌体系，最终在总耗时上比常规育种法少8个月，但与同步选育法相比，仍然具有较大差距。如以叶茎为外植体建立无菌体系，由于每枝叶茎可提供比根茎多10个以上的外植体，可不必花费一年的时间繁殖根茎，无菌体系建立的时间也较短，时间比采用根茎为外植体缩短14个月，总耗时约26个月，与同步选育法较为接近。即便如此，改良选育法中以叶茎为外植体建立无菌体系也仅能对筛选出的新品系进行快速繁殖，不能实现杂交后代的种质保存，操作过程也较为繁复。因此，仅用同步选育法既能实现种质保存又能缩短选育和选育的时间，且这种优势对于经济价值较高对种苗数量有规模化需求的姜花而言更加明显。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)无菌体系的建立：选取姜花杂交得到种胚成熟的果实，所述种胚成熟的果实为未开裂的果实，无菌条件下，用酒精浸泡后冲洗，再用0.10％升汞溶液消毒15～20min，再冲洗；然后从所述果实中取出种胚，接种于诱导种胚萌发的培养基中，于黑暗条件下培养至种胚萌动，转入光照环境中培养，获得无菌姜花幼苗，然后将所述无菌姜花幼苗进行编号，分别接种于增殖培养基进行继代培养，获得增殖后的无菌姜花幼苗；

(2)离体的种质保存与田间性状观测同步进行：取部分步骤(1)所述的增殖后的无菌姜花幼苗接种于种质保存培养基进行离体保存；取另一部分步骤(1)所述的增殖后的无菌姜花幼苗接种于壮苗及生根培养基，进行壮苗及生根培养，炼苗一段时间后移栽至露地种植，待花期进行生物学特性和农艺性状的观测，筛选出符合育种目标的新品系；

(3)新品系的快速繁殖：将步骤(2)筛选出的新品系与步骤(2)离体保存的无菌姜花幼苗进行编号对应，将无菌姜花幼苗接种至增殖培养基培养，再转至壮苗及生根培养基培养，然后炼苗移栽种植，实现新品系的快速繁殖；

所述诱导种胚萌发的培养基为MS培养基+1.0～3.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤+0.01～0.02mg/L苯基噻二唑脲+30g/L蔗糖+7g/L琼脂；

所述增殖培养基为MS培养基+3.0～5.0mg/L6-苄基氨基嘌呤+0.04～0.06mg/L苯基噻二唑脲+30g/L蔗糖+7g/L琼脂；

所述种质保存培养基为MS培养基+0.3～0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+1.0～2.0mg/L吲哚-3-乙酸+30g/L蔗糖+7g/L琼脂；

所述壮苗及生根培养基为MS培养基+0.3～0.5mg/L 6-苄基氨基嘌呤+0.5～1.0mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+7g/L琼脂。

2.如权利要求1所述的同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述种胚成熟的果实为未开裂的果实，所述酒精的体积浓度为75％，所述酒精浸泡的时间60～120s，所述酒精浸泡后用无菌水冲洗3～4次；所述消毒具体为用0.10％升汞溶液消毒15～20min，然后无菌水冲洗4～6次；所述黑暗条件下培养的时间为7天。

3.如权利要求1所述的同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述种胚培养至种胚萌动后，转入光照环境中培养30天，获得2～3片叶的无菌姜花幼苗；所述继代培养在继代2次后，每个杂交后代获得25～30株无菌姜花幼苗。

4.如权利要求1所述的同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述进行离体保存的无菌姜花幼苗为10～15株；所述进行离体保存的无菌姜花幼苗，每3.5个月转接一次；所述增殖后的无菌姜花幼苗丛切为单个，接种于壮苗及生根培养基；所述炼苗的时间为一周，所述炼苗的温度为室温，所述露地种植的基质包括泥炭、园土和粗砂。

5.如权利要求4所述的同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法，其特征在于，所述泥炭、园土和粗砂的质量比为1:1:1。

6.如权利要求1所述的同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述无菌姜花幼苗接种 的种质保存培养与所述符合育种目标的新品系的筛选同时进行。

7.如权利要求1所述的同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述炼苗的时间为一周，所述炼苗的温度为室温，所述移栽种植的基质包括泥炭、园土和粗砂，所述泥炭、园土和粗砂的质量比为1:1:1。

8.如权利要求1所述的同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法，其特征在于，

所述增殖培养基为MS培养基+3.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤+0.05mg/L苯基噻二唑脲+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂；

所述种质保存培养基为MS培养基+0.3mg/L6-苄基氨基嘌呤+1.0mg/L吲哚-3-乙酸+30g/L蔗糖+7g/L琼脂；

所述壮苗及生根培养基为MS培养基+0.3mg/L 6-苄基氨基嘌呤+1.0mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+7g/L琼脂。

9.如权利要求1所述的同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法，其特征在于，所述诱导种胚萌发的培养基和所述增殖培养基培养的条件均为：温度为24～26℃、光照时间为10～14h/d、光照强度为2500～3500lx；

所述种质保存培养基培养的条件为：温度为20～22℃、光照时间为8～10h/d、光照强度为1000～1500lx；

所述壮苗及生根培养基培养的条件为：温度为24～26℃、湿度为90～95％、光照为10～14h/d、光照强度为2000～3000lx。

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