CN110583481A - 一种诱导辽东楤木体细胞胚发生及植株再生的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种诱导辽东楤木体细胞胚发生及植株再生的方法,包括以下步骤：S1、外植体的选择与处理；S2、愈伤组织的诱导；S3、愈伤组织的增殖培养；S4、胚性愈伤组织的诱导；S5、胚性愈伤组织分瓶培养；S6、再生根培养；S7、驯化移栽，本发明培养速度快，经济适用性高，可用于优异野生种质资源的保存与繁殖，满足园艺栽培和中草药的规模化种植。
Description
技术领域
本发明涉及种植技术领域，尤其涉及一种诱导辽东楤木体细胞胚发生及植株再生的方法。
背景技术
辽东楤木是五加科楤木属的一种多年生落叶小乔木或灌木，其嫩芽，是名贵的食用山野菜，质地脆嫩，气味独特，营养丰富，被誉为“山菜之王”，其根、茎皮、叶等组织含有丰富的楤木皂甙，具有很高的食用价值和药用价值。近年来，随着辽东楤木芽菜大量出口日本，导致东北林区野生辽东楤木资源严重破坏，人们开始研究辽东楤木人工栽培技术。辽东楤木扩繁可采用4种方法：一是利用种子进行有性繁殖培养实生苗；二是利用根段进行无性繁殖生产插条苗和埋根苗；三是利用辽东楤木萌蘖能力强的生物学特性进行分株繁殖；四是利用植物细胞的全能性进行组织培养生产组培苗。由于辽东楤木种子休眠期较长，实生繁殖存在出苗不整齐且时间长的问题，而无性繁殖生产插条苗和埋根苗繁殖系数和成活率较低。利用组织培养技术能够实现种苗的快速繁育，解决稀有野生资源的保存问题。
辽东楤木植株再生有两种途径，一是愈伤组织形成途径，二是胚状体形成途径。辽东楤木通过愈伤组织再生途径，诱导率低，需要多次继代培养，一般需要6-10个月，繁殖周期较长。目前胚状体形成途径有两种方式，一是直接从外植体形成体细胞胚(Dai J L,TanX,Zhan Y G,et al.Rapid and repetitive plant regeneration ofAraliaelataSeem.via somatic embryogenesis[J].Plant Cell Tissue and Organ Culture,2011,104(1):125-130.)，这种方法体细胞胚诱导率和繁殖系数较低，平均每个外植体能生成 10-15个体细胞胚。二是先形成愈伤组织，再诱导形成体细胞胚(CN 108064697 A)，这种方法繁殖系数高，但仍存在以下不足，不同外植体诱导愈伤的激素浓度不明确，愈伤组织增殖系数低；单独添加IBA, 愈伤组织更多的是分化成不定根，分化后形成愈伤组织、不定根、不定芽及完整体细胞胚的混合体，体细胞胚分离困难，利用率低；体细胞胚接种到生长培养基上后容易在基部形成愈伤组织团及次级体细胞胚，驯化移栽困难。针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种更加有效的辽东楤木体细胞胚发生及植株再生的方法，有效提高体细胞胚诱导和增殖效率，从而建立更加高效的辽东楤木植株再生体系。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种诱导辽东楤木体细胞胚发生及植株再生的方法。
一种诱导辽东楤木体细胞胚发生及植株再生的方法，包括以下步骤：
S1、外植体的选择与处理：以5至7月份旺盛生长期植株的幼嫩叶片、茎和叶柄为外植体进行愈伤组织诱导，采回来的外植体先用流水冲洗干净，然后在超净工作台上用70％酒精浸泡消毒，叶片浸泡 30-60秒，叶柄和茎浸泡2-4分钟，用无菌水冲洗2-4次，再用氯化汞消毒7-10min，无菌水冲洗2-4次，用无菌滤纸吸干水分，用解剖刀将叶片切割成约1cm2的正方形，叶柄和茎切割成0.2-0.5cm的小段，接种到愈伤组织诱导培养基上；
S2、愈伤组织的诱导：以添加了2,4-D，蔗糖(30g/L)琼脂(6.5g/L) 的MS培养基为诱导培养基，叶片诱导愈伤的2,4-D浓度为 0.5mg/L-1.0mg/l，茎和叶柄诱导愈伤的2,4-D浓度为 1.0mg/L-3.0mg/L，愈伤组织的诱导条件：温度25±1℃，湿度 60％-70％，暗培养10-15天后转至12h/12h(2000lx)光培养，5天后开始生成淡黄色、疏软的愈伤组织，30-45天愈伤组织转至增殖培养基；
S3、愈伤组织的增殖培养：将愈伤组织在添加了1.0mg/L 2,4-D 和1.0mg/LIBA(吲哚丁酸)的培养基上继代培养，每15天继代一次；
S4、胚性愈伤组织的诱导：将增殖培养后的愈伤组织转至诱导培养基上，诱导培养基以MS为基本培养基，添加IBA 1.0-4.0mg/L、 6-BA 0.5-1.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L，诱导条件为：温度 25±1℃，湿度：60％-70％，光8h/暗16h光周期，光照强度2000lx， 13天后诱导出成熟的体细胞胚；
S5、胚性愈伤组织分瓶培养：在体细胞胚诱导培养基上培养10 天后，愈伤组织会迅速增殖3-5倍，形成大的胚性愈伤组织团，将增殖后的愈伤组织平均分到新的培养基上继续培养，每瓶接种1-2g，愈伤组织平铺在培养基上，13天后开始出现体细胞胚；
S6、再生根培养：用解剖刀切取长2cm的不定芽扦插到生根培养基上，生根培养基以WPM为基本培养基，添加IBA 0.5-1.0mg/L， NAA 0.2-1.0mg/L，蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L，诱导条件为：温度25 ±1℃，湿度：60％-70％，光12h/暗12h光周期，光照强度2000lx， 45天后，体细胞胚发展成长势强的完整植株；
S7、驯化移栽：生根培养45天后，选择根系健壮，生长势强的植株进行驯化培养，首先将组培苗用镊子取出，用自来水冲洗干净根部基质，避免伤根，然后移栽到10×10cm营养钵中,营养土体积配比灭菌的田土：草炭土：蛭石为(1:1:1)，移栽后保持空气湿度80-90％防止组培苗叶片抽干，将组培苗置于原培养箱或组培室中培养，培养条件14h/10h光周期，温度25±1℃，光照强度2000lx，一周后，降低空气湿度至60-70，2周后，将驯化后的组培苗转移至温室中培养，用遮阳网适当遮荫，遮盖塑料薄膜使空气湿度保持在60％-70％，30天后逐渐撤去遮阳网和塑料薄膜，统计成活率，移栽到露地中。
具体的，所述S1中外植体的最佳选择为茎。
具体的，所述叶片诱导愈伤的最佳2,4-D浓度为0.5mg/L，茎和叶柄诱导愈伤的最佳2,4-D浓度为1.0mg/L，培养条件为暗培养15 天后转为光培养。
具体的，所述S3中IBA和2,4-D浓度为1.0mg/L，培养条件为温度25±1℃，湿度：60％-70％，光8h/暗16h光周期。
具体的，所述S4中IBA浓度3.0mg/L，6-BA浓度为0.5mg/L，培养条件为温度25±1℃，湿度：60％-70％，光8h/暗16h光周期。
具体的，所述S5中增殖后的胚性愈伤组织需要分瓶培养，每瓶接种1-2g，愈伤组织均匀平铺在培养基上。
具体的,所述S6中生根培养基为添加了IBA 1.0mg/L，NAA 0.2 mg/L，蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L的WPM培养基。
具体的,所述S7中，优选的营养土体积配比灭菌的田土：草炭土：蛭石为(1:1:1)，优选的培养条件14h/10h光周期，温度25±1℃，空气湿度80-90％，光照强度2000lx。
本发明的有益效果是：本发明的辽东楤木体细胞胚胎发生途径的再生方法具有如下优点：
一，培养速度快，将增殖后的愈伤组织接种到诱导培养基上，23 天后便形成子叶型胚，成熟的体细胞胚转移到生根培养基上，1-2个月后便可成苗。
二，经济适用性高，每克愈伤组织可以分化成200多个胚状体或者不断在新愈伤培养基上扩大培养。
三，可用于优异野生资源的保存与繁殖性状，满足园艺栽培和中草药的规模化种植。
四，本发明还可作为基因工程的桥梁，缩短育种周期，大幅度缩短林木育种与繁殖周期，为该树种的基因工程改良工作奠定基础。
五，本发明的方法易于实施，便于推广。
附图说明
图1为激素配比和光照时数对体细胞胚诱导的影响的树状图；
图2激素配比对辽东楤木生根率及生根数量的影响的树状图。
具体实施方式
下面根据图1-2，结合具体实施例对本发明作进一步解说。
一种诱导辽东楤木体细胞胚发生及植株再生的方法，包括以下步骤：
实施例
S1、外植体的选择与处理：以5至7月份旺盛生长期植株的幼嫩叶片、茎和叶柄为外植体进行愈伤组织诱导，采回来的外植体先用流水冲洗干净，然后在超净工作台上用70％酒精浸泡消毒，叶片浸泡30 秒，叶柄和茎浸泡2分钟，用无菌水冲洗3次，再用氯化汞消毒7min，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干水分，用手术剪刀将叶片切割成约 1cm2的正方形，叶柄和茎切割成0.2cm，接种到愈伤组织诱导培养基上；
S2、愈伤组织的诱导：将叶片、叶柄和茎三种外植体分别接种到含有不同浓度的2,4-D的MS培养基为诱导培养基，每个处理接种15 瓶，每瓶接种5-7个外植体,3次重复，诱导条件：温度25±1℃，湿度：60％-70％，外植体暗培养15天后转至12h/12h(2000lx)光培养。结果如表1所示，3种外植体均可诱导出愈伤组织，叶片诱导愈伤的最佳2,4-D浓度为0.5mg/L，茎和叶柄诱导愈伤的最佳2,4-D浓度为 1.0mg/L。茎愈伤组织诱导率及愈伤产量最高，最适宜用作组织培养的外植体。
表1.外植体类型和激素浓度对愈伤组织诱导的影响
S3、愈伤组织的增殖培养：将淡黄色、疏软的愈伤组织分别转移至单独添加2,4-D及2,4-D和IBA(吲哚丁酸)组合的培养基上继代培养，每个处理接种15瓶，三次重复。15天后称量愈伤组织重量，计算增殖率：增殖后的愈伤重量/愈伤组织的初始重量。结果如表1. 试验结果表明，增殖培养基中添加IBA能够显著促进愈伤组织的增殖，增殖倍数达到6.70倍。
表2.激素配比对愈伤组织增殖的影响
S4、胚性愈伤组织的诱导：将增殖培养后的愈伤组织转至诱导培养基上，诱导培养基以MS为基本培养基，添加了不同浓度的IBA及 6-BA，每个处理接种15瓶，每瓶接种约1g的愈伤组织，3次重复诱导条件为：温度25±1℃，湿度：60％-70％，光12h/暗12h光周期，光照强度2000lx；
S5、胚性愈伤组织分瓶培养：在体细胞胚诱导培养基上培养10 天后，愈伤组织会迅速增殖3-5倍，形成大的胚性愈伤组织团，将增殖后的愈伤组织平均分到新的培养基上继续培养，每瓶接种约1g，愈伤组织平铺在培养基上，13天后开始出现体细胞胚；45天后统计体细胞胚的诱导率及体细胞胚的数量。结果见图1A，单独添加IBA 能诱导出体细胞胚，但更多的是生成大量不定根，添加6-BA后可以显著提高体细胞胚的诱导率及体细胞胚的数量，减少了不定根的产生。3.0mg/L IBA和0.5mg/L 6-BA是体细胞胚诱导的优选条件，该激素配比下体细胞胚诱导率为91.11％，每克愈伤组织可分化出 166.51个体细胞胚。
光照条件是影响愈伤组织诱导和体细胞胚发生的一个重要环境因子，有的植物适于在长日照时下进行愈伤诱导和体细胞胚发生，有的植物适于无光条件培养，多数植物适于光12h/暗12h培养。辽东楤木属于半荫生植物，为了研究适于辽东楤木体细胞胚发生的最适光周期，我们设置了0h，4h，8h，12h，16h及24h光照时数，每个处理15瓶愈伤组织，3次重复，每瓶接种约1g愈伤组织。培养条件： MS培养基添加3.0mg/L IBA和0.5mg/L 6-BA，温度25±1℃，湿度： 60％-70％，光照强度2000lx。结果如图1B所示，黑暗条件下培养愈伤组织发生褐化，体细胞胚诱导率和产量较低，每天24h光照，愈伤组织变绿，质地紧实，不能产生体细胞胚。每天8h的日照时是体细胞胚诱导的最优光照时数，平均每克愈伤组织产生216.58个体细胞胚，与12h光照时数相比，体细胞胚数量增加了23.35％。
S6、再生根培养：在体细胞胚诱导培养基上，除了生成完整的体细胞胚外，还有大量的不定根和不定芽以及未分化的愈伤组织，为了便于分离体细胞胚，提高体细胞胚的利用率和繁殖系数，直接切取高度大于2cm的不定芽扦插到生根培养基上重新生根，生根培养基以 WPM为基本培养基，添加不同浓度的IBA和NAA，蔗糖30g/L、琼脂 6.5g/L，诱导条件为：温度25±1℃，湿度：65％，光12h/暗12h光周期，光照强度2000lx。18天后，不定芽基部开始分化出根，45天后统计根发生率及生根数量，以具有下胚轴和子叶的完整体细胞胚发育成的自根苗为对照(CK)，每个处理15瓶，每瓶扦插3个不定芽，三次重复。结果如图2所示，辽东楤木比较容易生根，1.0mg/LIBA 和0.2mg/L的NAA组合生根率和单株生根数量最高，分别为91.11％， 24.07，生根率和自根苗生根率无差异，生根数量略高于自根苗。
S7、驯化移栽：生根培养45天后，选择根系健壮，生长势强的植株进行驯化培养。首先将组培苗用镊子取出，用自来水冲洗干净根部基质，避免伤根，然后移栽到10×10cm营养钵中,营养土体积配比灭菌的田土：草炭土：蛭石为(1:1:1)，移栽后用透明的塑料袋套在营养钵上，以保持高湿的环境，防止组培苗叶片抽干，将组培苗置于原培养箱或组培室中培养，培养条件14h/10h光周期，温度25±1℃，光照强度2000lx，2周后，逐渐撤去塑料袋，将驯化后的组培苗转移至温室中培养，用遮阳网适当遮荫，遮盖塑料薄膜使空气湿度保持在70％，如果有条件可配置雾化或加湿装置，培养温度25±5℃。30天后逐渐撤去遮阳网和塑料薄膜，统计自根苗和再生根苗的成活率，结果表明，再生根组培苗的成活率显著高于自根苗，分别为90％、75.56％。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种诱导辽东楤木体细胞胚发生及植株再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、外植体的选择与处理：以5至7月份旺盛生长期植株的幼嫩叶片、茎和叶柄为外植体进行愈伤组织诱导，采回来的外植体先用流水冲洗干净，然后在超净工作台上用70％酒精浸泡消毒，叶片浸泡30-60秒，叶柄和茎浸泡2-3分钟，用无菌水冲洗2-4次，再用氯化汞消毒7-10min，无菌水冲洗2-4次，用无菌滤纸吸干水分，用解剖刀将叶片切割成约1cm2的正方形，叶柄和茎切割成0.2-0.5cm的小段，接种到愈伤组织诱导培养基上；
S2、愈伤组织的诱导：以添加了2,4-D，蔗糖(30g/L)，琼脂(6.5g/L)的MS培养基为诱导培养基，叶片诱导愈伤的2,4-D浓度为0.5mg/L-1.0mg/l，茎和叶柄诱导愈伤的2,4-D浓度为1.0mg/L-3.0mg/L，愈伤组织的诱导条件：温度25±1℃，湿度60％-70％，暗培养10-15天后转至12h/12h(2000lx)光培养，5天后开始生成淡黄色、疏软的愈伤组织，30-45天后愈伤组织转至增殖培养基；
S3、愈伤组织的增殖培养：将愈伤组织在添加了0.5-1.0mg/L2,4-D和IBA(吲哚丁酸)的培养基上继代培养，每15天继代一次；培养条件为温度25±1℃，湿度：60％-70％，光12h/暗16h光周期,光照强度20001x。
S4、胚性愈伤组织的诱导：将增殖培养后约1g的愈伤组织转至诱导培养基上，诱导培养基以MS为基本培养基，添加IBA1.0-4.0mg/L、6-BA0.5-1.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L，诱导条件为：温度25±1℃，湿度60％-70％，光8h/暗16h光周期，光照强度2000lx。
S5、胚性愈伤组织分瓶培养：在体细胞胚诱导培养基上培养10天后，愈伤组织会迅速增殖3-5倍，形成大的胚性愈伤组织团，将增殖后的愈伤组织平均分到新的培养基上继续培养，每瓶接种1-2g，愈伤组织平铺在培养基上，13天后开始出现体细胞胚；
S6、再生根培养：用解剖刀切取长2cm的不定芽扦插到再生根培养基上，生根培养基以WPM为基本培养基，添加IBA0.5-1.0mg/L，NAA0.2-1.0mg/L,蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L，诱导条件为：温度25±1℃，湿度60％-70％，光12h/暗12h光周期，光照强度2000lx，45天后，体细胞胚发展成长势强的完整植株；
S7、驯化移栽：生根培养45天后，选择根系健壮，生长势强的植株进行驯化培养，首先将组培苗用镊子取出，用自来水冲洗干净根部基质，避免伤根，然后移栽到10×10cm营养钵中,营养土体积配比灭菌的田土：草炭土：蛭石为(1:1:1)，移栽后保持空气湿度80-90％防止组培苗叶片抽干，将组培苗置于原培养箱或组培室中培养，培养条件14h/10h光周期，温度25±1℃，光照强度2000lx，一周后，降低空气湿度至60-70％，2周后，将驯化后的组培苗转移至温室中培养，用遮阳网适当遮荫，遮盖塑料薄膜使空气湿度保持在60％-70％，30天后逐渐撤去遮阳网和塑料薄膜，统计成活率，移栽到露地中。
2.根据权利要求1所述的一种诱导辽东楤木体细胞胚发生及植株再生的方法，其特征在于，所述S1中外植体的最佳选择为茎。
3.根据权利要求1所述的一种诱导辽东楤木体细胞胚发生及植株再生的方法，其特征在于，所述叶片诱导愈伤的最佳2,4-D浓度为0.5mg/L，茎和叶柄诱导愈伤的最佳2,4-D浓度为1.0mg/L，培养条件为暗培养15天后转为光培养。
4.根据权利要求1所述的一种诱导愈伤组织增殖的方法，其特征在于，所述S3中IBA为0.5mg/L和2,4-D浓度为0.5mg/L，培养条件为温度25±1℃，湿度：60％-70％，光12h/暗12h光周期。
5.根据权利要求1所述的一种诱导辽东楤木体细胞胚发生及植株再生的方法，其特征在于，所述S4中IBA浓度3.0mg/L，6-BA浓度为0.5mg/L，培养条件为温度25±1℃，湿度60％-70％，光8h/暗16h光周期。
6.根据权利要求1所述的一种诱导辽东楤木体细胞胚发生及植株再生的方法，其特征在于，所述S5中增殖后的胚性愈伤组织需要分瓶培养，每瓶接种1-2g，愈伤组织均匀平铺在培养基上。
7.根据权利要求1所述的一种诱导辽东楤木体细胞胚发生及植株再生的方法，其特征在于,所述S6中再生根培养基为添加了IBA1.0mg/L，NAA0.2mg/L,蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L的WPM培养基。
8.根据权利要求1所述的一种诱导辽东楤木体细胞胚发生及植株再生的方法，其特征在于,所述S7中，优选的营养土体积配比灭菌的田土：草炭土：蛭石为(1:1:1)，优选的培养条件14h/10h光周期，温度25±1℃，湿度80-90％，光照强度2000lx。
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