CN103688855B - 一种小叶红豆离体胚培养及植株再生方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于经济林的栽培方法，特别是涉及小叶红豆离体胚培养及植株再生方法。本发明采用胚芽诱导培养、初代芽诱导培养、芽增殖培养、壮苗培养、诱导生根培养，完成小叶红豆的离体胚培养及植株再生培养，该培养方法扩繁系数较高，萌发时间短，增殖速度快，经壮苗培养，成苗移植后的成活率高，苗木健壮挺拔，长势良好，对高效保育珍稀濒危小叶红豆资源具有重要的理论意义和较高经济价值及开发利用前景。
Description
技术领域
本发明属于经济林的栽培方法，特别是涉及小叶红豆离体胚培养及植株再生方法。
背景技术
小叶红豆（Ormosiamicropylla）为蝶形花科Papilionaceae红豆树属OrmosiaG.Jacks.树种,稀有种。小叶红豆表现为衰退型，林下自然更新困难，自然繁衍能力、传播扩散能力不强，随着群落的发展与演替，将会被其他物种更替。小叶红豆木材坚硬、材质优良，其边材和心材区别明显，边材浅黄褐色，心材比例大，为深紫红色至紫黑色，民间称之为“紫檀木”，木材纹理通直，结构细匀，干缩小，耐腐性强，色泽及花纹美观，是制造高级家具、乐器、美术工艺品的特种珍贵用材，极为珍贵。分布于贵州、福建、广东、广西等地，生于海拔600-800m的山坡中。由于长期过度采伐，小叶红豆目前数量存量稀少，为濒临灭绝物种，有关小叶红豆种群及群落结构研究的资料较少，因而实施有效保护迫在眉睫。小叶红豆材树形高大干直优美，是良好的风景观赏树种。现有技术中小叶红豆自然资源少，成活率低，扁椭圆形种皮坚硬、蜡质、发芽不齐，有的种子在土壤中2年后才发芽，种子易遭鼠、鸟食;种子坚硬，种皮透水性差，种皮不易吸水萌发，必须经特殊催芽处理才能萌发，自然更新困难，自然繁衍能力、传播扩散能力不强，因此开展优良单株的研究并采取组织培养无性繁殖技术，对培育优质苗和高效保育珍稀濒危珍贵乡土树种小叶红豆资源，调整林种树种结构，促进林业可持续发展，为小叶红豆遗传改良、种苗繁殖技术、人工栽培技术、大树迁地移植以及对珍贵树种实施有效的保护与管理等研究工作提供技术支持，具有重要的理论意义和高经济价值的开发利用前景。
发明内容
本发明提供一种小叶红豆离体胚培养及植株再生方法，该培养方法扩繁系数较高，萌发时间短，增殖速度快，经壮苗培养，成苗移植后的成活率高，苗木健壮挺拔，长势良好，对高效保育珍稀濒危小叶红豆资源具有重要的理论意义和较高经济价值及开发利用前景。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
包括以下步骤：
1）取材方法：选取当年结实、籽粒饱满的豆荚为材料，采摘后置3-5℃冰箱冷藏保存备用；
2）培养基的配制：分别配制胚芽诱导培养基、初代芽诱导培养基、芽增殖培养基、壮苗培养基和生根培养基，这些培养基的PH值为5.7-5.9，培养基厚度为1.4～1.6cm；所述胚芽诱导培养基：1/2MS+0.5-2.0mg·L-1BA+0.1-1.0mg·L-1IAA+0.1-0.3mg·L-1NAA+5.0-7.0g·L-1Ag++18-22g·L-1Su+1.0-1.5g·L-1Ac，
所述初代芽诱导培养基：WPM+1.0-2.0mg·L-1BA+0.4-0.6mg·L-1KT+0.4-0.6mg·L-1IAA+0.4-0.6mg·L-1NAA+5.0-7.0g·L-1Ag++18-22g·L-1Su+1.0-1.5g·L-1Ac，
所述芽增殖培养基：WPM+1.0-2.0mg·L-1BA+0.5-1.5mg·L-1KT+0.1-0.5mg·L-1TDZ+0.4-0.6mg·L-1NAA+5.0-7.0g·L-1Ag++18-22g·L-1Su+1.0-1.5g·L-1Ac，
所述壮苗培养基：WPM+0.5-1.0mg·L-1BA+0.1-0.5mg·L-1KT+0.1-0.5mg·L-1NAA+0.5-1.0mg·L-1IAA+5.0-7.0g·L-1Ag++18-22g·L-1Su+1.0-1.5g·L-1Ac，
所述生根培养基：1/2WPM+0.1-0.5mg·L-1NAA+0.5-1.5mg·L-1IBA+5.0-7.0g·L-1Ag++18-22g·L-1Su+1.0-1.5g·L-1Ac；
3）材料消毒处理：豆荚用自来水进行表面冲洗，置饱和漂白粉上清液中浸泡15-20min，用自来水滴冲1-1.5h后去除豆荚外壳，取出种子，用双蒸水冲洗2-3遍，在超净工作台上用质量分数为75%酒精消毒20-40s，用质量分数为0.1%升汞消毒15-17min，无菌水冲3-4遍后，用消毒滤纸吸干种子表面水分，放在灭过菌的培养皿上，去除位于生长点1/10部分坚硬种子外壳及蜡质层后接种于胚芽诱导培养基上；
4）胚芽诱导培养：100～150g胚芽诱导培养基接种种胚2-4个；所述胚芽诱导的培养条件：培养室温度为23±2℃，前15～20天暗培养，后20～25天光照时间11-12h/d，光照强度为1000～1500lx；
5）初代芽诱导培养：将经上述胚芽诱导培养，得到的生长良好的芽切成1～2cm长的带腋芽茎段，接种在初代芽诱导培养基中进行诱导培养；培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间11-12h/d，光照强度为1500-2000lx，诱导培养时间30～50天；
6）芽增殖培养：将经上述初代芽诱导培养，得到的生长良好的增殖芽切成1～2cm长的带腋芽茎段，接种在芽增殖培养基中进行增殖培养；培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间11-12h/d，光照强度为1500-2000lx，增殖培养时间35～55天；
7）壮苗培养：将经上述芽增殖培养，得到高2-3cm完整的幼苗单株切下，接种在壮苗培养基中进行壮苗培养；培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间11-12h/d，光照强度为1500-2000lx，壮苗培养时间20～30天；
8）诱导生根培养：将经壮苗培养培养出来的带有2-4片叶子、株高2-4cm的幼苗单株转移到生根培养基中；所述生根培养的培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间11-12h/d，光照强度为1500-2000lx，生根培养时间25-35天；
9）试管苗完成：当试管苗长至2-4cm高，有3-5条形态正常的根，有4-6片叶子，叶长2-3cm时，完成小叶红豆的离体胚培养及植株再生培养。
将所述步骤9）完成的试管苗进行移栽：将试管苗放在自然光下炼苗3-5天，再打开瓶盖炼苗1-2天，用枪状镊把试管苗从培养瓶中逐渐取出并洗去附着在根部上的培养基，移入蛭石和腐殖土的质量比=1:2混合的基质中，用带2个气孔的玻璃罩罩住移栽试管苗，温度控制在20-28℃，湿度应保持在75％-85％。
本发明中培养基的配制：在基本培养基1/2MS，WPM、1/2WPM中分别添加生长激素细胞分裂素（BA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）、苯基噻二唑基脲（TDZ）、激动素（KT）、吲哚乙酸（IAA）中的几种，分别配制成胚芽诱导培养基、初代芽诱导培养基、芽增殖培养基、壮苗培养基、生根培养基，所述这些培养基中再另外加入Su、Ag+，PH值：5.7-5.9，附加物为活性炭；培养基厚度为1.4～1.6cm；基本培养基1/2MS是指：MS中大量元素减半，其余不变。基本培养基1/2WPM是指：WPM中大量元素减半，其余不变。
为了得到小叶红豆的胚芽诱导培养基，本发明以MS、1/2MS为基本培养基，附加不同浓度的BA、NAA，以找出诱导效果最佳的配方，使用的培养基种类见表1。
表1培养基种类
结果发现，在胚芽诱导初期采用1/2MS进行胚芽的诱导有助于芽的生长，比MS为基本培养基的效果好，但是在芽诱导阶段如果继续使用MS培养基培养就会出现新抽出的幼芽焦褐死亡，因此，必须根据植株生长情况及时调整基本培养基，如采用表1培养基进行芽诱导，芽萌发迟，不生长并焦褐死亡，萌发率仅5～10%。以WPM为基本培养基进行芽诱导，附加如表1所示不同浓度的BA、NAA，芽生长状况有所改善，芽萌发较快，但是芽生长不整齐，萌发率20～30%。由于小叶红豆为木本植物，繁殖难度大，因此本发明采用WPM为基本培养基，添加不同生长激素，经过一系列反复调整试验，得到适合本发明的初代芽诱导培养基、芽增殖培养基，萌芽快，萌芽率高，新生芽数最多并形成丛芽且长势好，增殖倍数大可达2-3倍。
本发明显著优点是：率先应用生物技术对珍贵树种小叶红豆进行高效保育，建立无菌体系并进行高频繁殖，采用本发明方法进行，胚经过胚芽诱导培养，20～25天萌发出生长健壮的新胚芽；再经过30～50天的初代芽诱导培养，35～55天芽增殖培养，20～30天壮苗培养；25～35天生根培养；经炼苗、移栽，成活率达99%以上；成品率（扣除病株后）达99%，该方法培养，萌发时间短，增殖速度快，扩繁系数高，成苗移植后成活率高，苗木健壮挺拔，长势良好，整齐一致，对高效保育珍稀濒危小叶红豆资源，为小叶红豆遗传改良研究、种苗繁殖技术研究、人工栽培技术研究、大树迁地移植以及对珍贵树种实施有效的保护与管理等工作提供技术支持，具有重要的理论意义和高经济价值的开发利用前景。
附图说明
图1为小叶红豆种子。
图2为除蜡质外壳后的接种情况。
图3为种子胚状体生长。
图4为种子胚状体生长成的芽苗。
图5为初代芽诱导培养。
图6为芽增殖繁殖。
图7为胚芽茎段组织形成的丛芽。
图8为形成根系的芽苗。
图9为移栽成活的小叶红豆苗。
具体实施方式
实施例1
1）取材方法：选取当年结实的籽粒饱满的豆荚为材料，采摘的豆荚用湿布包好，带回实验室置4℃冰箱保存备用；
2）培养基的配制
分别配制胚诱导培养基、初代芽诱导培养基、芽增殖培养基、壮苗培养基、生根培养基，所述这些培养基中再另外加入Su：20g·L-1，Ag：6.0g·L-1，PH值：5.8，附加物为活性炭Ac；培养基厚度为1.4cm；采用透气性好的包瓶材料可以减少培养物的水分供应，从而防止了木本植物生长过程的玻璃化现象发生，保证了培养苗的质量。
其中，胚诱导培养基：1/2MS（大量元素减半）+1.0mg·L-1BA+0.5mg·L-1IAA+0.2mg·L-1NAA+6.0g·L-1Ag+20g·L-1Su+1.0g·L-1Ac；
初代芽诱导培养基：WPM+1.5mg·L-1BA+0.5mg·L-1KT+0.5mg·L-1IAA+0.5mg·L-1NAA+6g·L-1Ag+20g·L-1Su+1.0g·L-1Ac；
芽增殖培养基：WPM+1.5mg·L-1BA+1.0mg·L-1KT+0.25mg·L-1TDZ+0.5mg·L-1NAA+6.0g·L-1Ag+20g·L-1Su+1.0g·L-1Ac；
壮苗培养基：WPM+1.0mg·L-1BA+0.5mg·L-1KT+0.5mg·L-1NAA+1.0mg·L-1IAA+6.0g·L-1Ag+20g·L-1Su+1.0g·L-1Ac；
生根培养基：1/2WPM（大量元素减半）+0.5mg·L-1NAA+1.0mg·L-1IBA+6.0g·L-1Ag+20g·L-1Su+1.0g·L-1Ac；
3）材料消毒处理：先对豆荚材料用自来水进行表面漂洗，置饱和漂白粉上清液中浸泡15min，自来水下滴冲1h，去除豆荚外壳，取出种子，双蒸水冲洗2次，置超净工作台用75%的酒精消毒30s后倒去酒精，加入0.1%升汞溶液处理15min，将汞液倒入废汞瓶，用无菌水冲3遍后，用消毒滤纸吸干种子表面水分，放在灭过菌的培养皿上，通过手术刀和枪状镊配合用机械力去除位于生长点1/10部分坚硬种子外壳及蜡质层，然后进行接种，有经过机械破皮的种子比没有经过机械破皮的种子接种于相同的培养基上的萌芽率高30%；
4）胚诱导培养：经消毒处理后分别接种于经高温、高压灭菌的胚芽诱导培养基中；100g培养基接种种胚3个；所述胚诱导的培养条件：培养室温度为23±2℃，前15天暗培养，15天以后光强度为1000lx，光照时间12h/d，诱导时间20天；
5）初代芽诱导培养：将经上述胚诱导培养，得到的生长良好的芽切成1cm长的带腋芽茎段，分别接种在芽诱导培养基中进行诱导培养；所述芽诱导的培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间12h/d，光照强度：光照强度为1500lx，芽诱导培养时间30～50天；
6）芽增殖培养：将经上述芽诱导培养，得到的生长良好的增殖芽切成1cm长的带腋芽茎段，接种在芽增殖培养基中进行增殖培养；所述芽增殖的培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间12h/d，光照强度：光照强度为1500lx，增殖培养时间35天；
7）壮苗培养：将经上述芽增殖培养，得到生长良好，高2-3cm完整的植株，幼苗单株切下，接种在壮苗培养基中进行壮苗培养；所述的培养壮苗培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间12h/d，光照强度：光照强度为1500lx，壮苗培养时间20天；
8）诱导生根培养：将壮苗培养出来的幼苗单株切下，带有2片叶子，株高1cm，转移到生根培养基中；所述生根培养的培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间12h/d，光照强度：光照强度为1500lx，生根培养时间25天；
9）试管苗移栽：瓶苗移栽：当瓶苗长至2cm，3条根，4片叶子，叶长约2cm时，即进行移栽，将试管苗放在自然光下炼苗3天，打开瓶盖先进行炼苗1天，增强试管苗对室外环境的适应能力；然后从培养瓶中取出，洗去附着在根系的培养基，移入蛭石和腐殖土的质量比1:2混合的基质中，保湿遮阴，温度控制在20℃，湿度应保持在75％，避免阳光直射，成活率可达97%。
实施例2
1）取材方法：选取当年结实的籽粒饱满的豆荚为材料，采摘的豆荚用湿布包好，带回实验室置4℃冰箱保存备用；
2）培养基的配置
分别配制胚诱导培养基、初代芽诱导培养基、芽增殖培养基、壮苗培养基、生根培养基，所述这些培养基中再另外加入Su、Ag，PH值：5.7，附加物为活性炭Ac；培养基厚度为1.6cm；（并采用透气性好的包瓶材料可以减少培养物的水分供应，从而防止了木本植物生长过程的玻璃化现象发生，保证了培养苗的质量）。
其中，胚诱导培养基：1/2MS（大量元素减半）+1.5mg·L-1BA+1.0mg·L-1IAA+0.3mg·L-1NAA+6.0g·L-1Ag+20g·L-1Su+1.5g·L-1Ac。
初代芽诱导培养基：WPM+2.0mg·L-1BA+0.6mg·L-1KT+0.6mg·L-1IAA+0.6mg·L-1NAA+6.0g·L-1Ag+20g·L-1Su+1.5g·L-1Ac。
芽增殖培养基：WPM+2.0mg·L-1BA+1.5mg·L-1KT+0.5mg·L-1TDZ+0.6mg·L-1NAA+6.0g·L-1Ag+20g·L-1Su+1.5g·L-1Ac。
壮苗培养基：WPM+0.7mg·L-1BA+0.25mg·L-1KT+0.25mg·L-1NAA+0.7mg·L-1 IAA+6.0g·L-1Ag+20g·L-1Su+1.5g·L-1Ac。
生根培养基：1/2WPM（大量元素减半）+0.6mg·L-1NAA+1.5mg·L-1IBA+6.0g·L-1Ag+20g·L-1Su+1.5g·L-1Ac；
3）材料消毒处理：先对豆荚材料进行表面漂洗，用自来水冲洗，置饱和漂白粉上清液中浸泡20min，自来水下滴冲1.5h，去除豆荚外壳，取出种子，双蒸水冲洗3次，置超净工作台用75%的酒精消毒40s后倒去酒精，加入0.1%升汞溶液处理17min，将汞液倒入废汞瓶，用无菌水冲4遍后，用消毒滤纸吸干种子表面水分，取出要接种的材料放在灭过菌的培养皿上，通过手术刀和枪状镊配合用机械力去除位于生长点1/10部分坚硬种子外壳及蜡质层，然后接种，有经过机械破皮的种子与没有经过机械破皮的种子接种于相同的培养基上的萌芽率高35%；
4）胚诱导培养：取当年结实的籽粒饱满的种子经消毒处理后分别接种于经高温、高压灭菌的胚芽诱导培养基中；150g培养基接种种胚4个；所述胚诱导的培养条件：培养室温度为23±2℃，前20天暗培养，20天以后光强度为1500lx，光照时间12h/d，胚诱导时间25天；
5）初代芽诱导培养：将经上述胚诱导培养，得到的生长良好的芽切成2cm长的带腋芽茎段，分别接种在芽诱导培养基中进行诱导培养；所述芽诱导的培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间12h/d，光照强度：光照强度为2000lx，芽诱导培养时间50天；
6）芽增殖培养：将经上述芽诱导培养，得到的生长良好的增殖芽切成2cm长的带腋芽茎段，接种在芽增殖培养基中进行增殖培养；所述芽增殖的培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间12h/d，光照强度：光照强度为2000lx，增殖培养时间55天；
7）壮苗培养：将经上述芽增殖培养，得到生长良好，高2-3cm完整的植株，幼苗单株切下，接种在壮苗培养基中进行壮苗培养；所述的培养壮苗培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间12h/d，光照强度：光照强度为2000lx，壮苗培养时间30天；
8）诱导生根培养：将继代诱导培养出来的幼苗单株切下，带有3片叶子，株高2cm，转移到生根培养基中；所述生根培养的培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间12h/d，光照强度：光照强度为2000lx，生根培养时间35天；
9）试管苗移栽：瓶苗移栽：当瓶苗长至4cm，5条根，6片叶子，叶长约3cm时，即进行移栽，将试管苗放在自然光下炼苗5天，打开瓶盖先进行炼苗3天，增强试管苗对室外环境的适应能力；然后从培养瓶中取出，洗去附着在根系的培养基，移入蛭石和腐殖土的质量比1:2混合的基质中，保湿遮阴，温度控制在28℃，湿度应保持在85％，避免阳光直射，成活率可达98%。
实施例3
1）取材方法：选取当年结实的籽粒饱满的豆荚为材料，采摘的豆荚用湿布包好，带回实验室置4℃冰箱保存备用；
2）培养基的配制
分别配制胚诱导培养基、初代芽诱导培养基、芽增殖培养基、壮苗培养基、生根培养基，所述这些培养基中再另外加入Su、Ag，PH值：5.9，附加物为活性炭Ac；培养基厚度为1.5cm；
其中，胚诱导培养基：1/2MS+0.5mg·L-1BA+0.4mg·L-1IAA+0.1mg·L-1NAA+6.0g·L-1Ag+20g·L-1Su+1.2g·L-1Ac；
初代芽诱导培养基：WPM+1.0mg·L-1BA+0.4mg·L-1KT+0.4mg·L-1IAA+0.4mg·L-1NAA+6.0g·L-1Ag+20g·L-1Su+1.2g·L-1Ac；
芽增殖培养基：WPM+1.0mg·L-1BA+0.5mg·L-1KT+0.1mg·L-1TDZ+0.4mg·L-1NAA+6.0g·L-1Ag+20g·L-1Su+1.2g·L-1Ac；
壮苗培养基：WPM+0.5mg·L-1BA+0.1mg·L-1KT+0.1mg·L-1NAA+0.5mg·L-1 IAA+6.0g·L-1Ag+20g·L-1Su+1.0g·L-1Ac。
生根培养基：1/2WPM+0.4mg·L-1NAA+0.5mg·L-1IBA+6.0g·L-1Ag+20g·L-1Su+1.2g·L-1Ac；
3）材料消毒处理：先对豆荚材料用自来水进行表面漂洗，置饱和漂白粉上清液中浸泡17min，自来水下滴冲1.2h，去除豆荚外壳，取出种子，双蒸水冲洗2次，置超净工作台用75%的酒精消毒20s后倒去酒精，加入0.1%升汞溶液处理16min，将汞液倒入废汞瓶，用无菌水冲3遍后，用消毒滤纸吸干种子表面水分，取出要接种的材料放在灭过菌的培养皿上，通过手术刀和枪状镊配合用机械力去除位于生长点1/10部分坚硬种子外壳及蜡质层，然后接种，有经过机械破皮的种子与没有经过机械破皮的种子接种于相同的培养基上的萌芽率高33%；
4）胚诱导培养：取当年结实的籽粒饱满的种子经消毒处理后分别接种于经高温、高压灭菌的胚芽诱导培养基中；150g培养基接种种胚3个；所述胚诱导的培养条件：培养室温度为23±2℃，前17天暗培养，然后光强度为1200lx，光照时间12h/d，胚诱导时间23天；
5）初代芽诱导培养：将经上述胚诱导培养，得到的生长良好的芽切成2cm长的带腋芽茎段，分别接种在芽诱导培养基中进行诱导培养；所述芽诱导的培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间12h/d，光照强度：光照强度为1700lx，芽诱导培养时间40天；
6）芽增殖培养：将经上述芽诱导培养，得到的生长良好的增殖芽切成2cm长的带腋芽茎段，接种在芽增殖培养基中进行增殖培养；所述芽增殖的培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间12h/d，光照强度：光照强度为1700lx，增殖培养时间45天；
7）壮苗培养：将经上述芽增殖培养，得到生长良好，高2-3cm完整的植株，幼苗单株切下，接种在壮苗培养基中进行壮苗培养；所述的培养壮苗培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间11/d，光照强度：光照强度为1700lx，壮苗培养时间25天；
8）诱导生根培养：将继代诱导培养出来的幼苗单株切下，带有3片叶子，株高2cm，转移到生根培养基中；所述生根培养的培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间12h/d，光照强度：光照强度为1700lx，生根培养时间30天；
9）试管苗移栽：瓶苗移栽：当瓶苗长至3cm，3～5条根，6片叶子，叶长约3cm时，即进行移栽，将试管苗放在自然光下炼苗4天，打开瓶盖先进行炼苗2天，增强试管苗对室外环境的适应能力；然后从培养瓶中取出，洗去附着在根系的培养基，移入蛭石和腐殖土的质量比1:2混合的基质中，保湿遮阴，温度控制在25℃，湿度应保持在80％，避免阳光直射，成活率可达98.5%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (2)
1.一种小叶红豆离体胚培养及植株再生方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
1）取材方法：选取当年结实、籽粒饱满的豆荚为材料，采摘后置3-5℃冰箱冷藏保存备用；
2）培养基的配制：分别配制胚芽诱导培养基、初代芽诱导培养基、芽增殖培养基、壮苗培养基和生根培养基；
所述胚芽诱导培养基：1/2MS+1.0mg·L-1BA+0.5mg·L-1IAA+0.2mg·L-1NAA+6.0g·L-1琼脂+20g·L-1蔗糖+1.0g·L-1活性炭；
初代芽诱导培养基：WPM+1.5mg·L-1BA+0.5mg·L-1KT+0.5mg·L-1IAA+0.5mg·L-1NAA+6g·L-1琼脂+20g·L-1蔗糖+1.0g·L-1活性炭；
芽增殖培养基：WPM+1.5mg·L-1BA+1.0mg·L-1KT+0.25mg·L-1TDZ+0.5mg·L-1NAA+6.0g·L-1琼脂+20g·L-1蔗糖+1.0g·L-1活性炭；
壮苗培养基：WPM+1.0mg·L-1BA+0.5mg·L-1KT+0.5mg·L-1NAA+1.0mg·L-1IAA+6.0g·L-1琼脂+20g·L-1蔗糖+1.0g·L-1活性炭；
生根培养基：1/2WPM+0.5mg·L-1NAA+1.0mg·L-1IBA+6.0g·L-1琼脂+20g·L-1蔗糖+1.0g·L-1活性炭；
这些培养基的PH值为5.8，培养基厚度为1.4cm；
或，
所述胚芽诱导培养基：1/2MS+1.5mg·L-1BA+1.0mg·L-1IAA+0.3mg·L-1NAA+6.0g·L-1琼脂+20g·L-1蔗糖+1.5g·L-1活性炭；
初代芽诱导培养基：WPM+2.0mg·L-1BA+0.6mg·L-1KT+0.6mg·L-1IAA+0.6mg·L-1NAA+6.0g·L-1琼脂+20g·L-1蔗糖+1.5g·L-1活性炭；
芽增殖培养基：WPM+2.0mg·L-1BA+1.5mg·L-1KT+0.5mg·L-1TDZ+0.6mg·L-1NAA+6.0g·L-1琼脂+20g·L-1蔗糖+1.5g·L-1活性炭；
壮苗培养基：WPM+0.7mg·L-1BA+0.25mg·L-1KT+0.25mg·L-1NAA+0.7mg·L-1 IAA+6.0g·L-1琼脂+20g·L-1蔗糖+1.5g·L-1活性炭；
生根培养基：1/2WPM+0.6mg·L-1NAA+1.5mg·L-1IBA+6.0g·L-1琼脂+20g·L-1蔗糖+1.5g·L-1活性炭；
这些培养基的PH值为5.7，培养基厚度为1.6cm；
或，
所述胚芽诱导培养基：1/2MS+0.5mg·L-1BA+0.4mg·L-1IAA+0.1mg·L-1NAA+6.0g·L-1琼脂+20g·L-1蔗糖+1.2g·L-1活性炭；
初代芽诱导培养基：WPM+1.0mg·L-1BA+0.4mg·L-1KT+0.4mg·L-1IAA+0.4mg·L-1NAA+6.0g·L-1琼脂+20g·L-1蔗糖+1.2g·L-1活性炭；
芽增殖培养基：WPM+1.0mg·L-1BA+0.5mg·L-1KT+0.1mg·L-1TDZ+0.4mg·L-1NAA+6.0g·L-1琼脂+20g·L-1蔗糖+1.2g·L-1活性炭；
壮苗培养基：WPM+0.5mg·L-1BA+0.1mg·L-1KT+0.1mg·L-1NAA+0.5mg·L-1 IAA+6.0g·L-1琼脂+20g·L-1蔗糖+1.0g·L-1活性炭；
生根培养基：1/2WPM+0.4mg·L-1NAA+0.5mg·L-1IBA+6.0g·L-1琼脂+20g·L-1蔗糖+1.2g·L-1活性炭；
这些培养基的PH值为5.9，培养基厚度为1.5cm；
3）材料消毒处理：豆荚用自来水进行表面冲洗，置饱和漂白粉上清液中浸泡15-20min，用自来水滴冲1-1.5h后去除豆荚外壳，取出种子，用双蒸水冲洗2-3遍，在超净工作台上用质量分数为75%酒精消毒20-40s，用质量分数为0.1%升汞消毒15-17min，无菌水冲3-4遍后，用消毒滤纸吸干种子表面水分，放在灭过菌的培养皿上，去除位于生长点1/10部分坚硬种子外壳及蜡质层后接种于胚芽诱导培养基上；
4）胚芽诱导培养：100～150g胚芽诱导培养基接种种胚2-4个；所述胚芽诱导的培养条件：培养室温度为23±2℃，前15～20天暗培养，后20～25天光照时间11-12h/d，光照强度为1000～1500lx；
5）初代芽诱导培养：将经上述胚芽诱导培养，得到的生长良好的芽切成1～2cm长的带腋芽茎段，接种在初代芽诱导培养基中进行诱导培养；培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间11-12h/d，光照强度为1500-2000lx，诱导培养时间30～50天；
6）芽增殖培养：将经上述初代芽诱导培养，得到的生长良好的增殖芽切成1～2cm长的带腋芽茎段，接种在芽增殖培养基中进行增殖培养；培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间11-12h/d，光照强度为1500-2000lx，增殖培养时间35～55天；
7）壮苗培养：将经上述芽增殖培养，得到高2-3cm完整的幼苗单株切下，接种在壮苗培养基中进行壮苗培养；培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间11-12h/d，光照强度为1500-2000lx，壮苗培养时间20～30天；
8）诱导生根培养：将经壮苗培养培养出来的带有2-4片叶子、株高2-4cm的幼苗单株转移到生根培养基中；所述生根培养的培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间11-12h/d，光照强度为1500-2000lx，生根培养时间25-35天；
9）试管苗完成：当试管苗长至2-4cm高，有3-5条形态正常的根，有4-6片叶子，叶长2-3cm时，完成小叶红豆的离体胚培养及植株再生培养。
2.根据权利要求1所述的小叶红豆离体胚培养及植株再生方法，其特征在于：将所述步骤9）完成的试管苗进行移栽：将试管苗放在自然光下炼苗3-5天，再打开瓶盖炼苗1-2天，用枪状镊把试管苗从培养瓶中逐渐取出并洗去附着在根部上的培养基，移入蛭石和腐殖土的质量比=1:2混合的基质中，用带2个气孔的玻璃罩罩住移栽试管苗，温度控制在20-28℃，湿度应保持在75％-85％。
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Granted publication date: 20160106 Termination date: 20191211 |