CN104054579B - 一种油桐叶柄直接再生植株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种油桐叶柄直接再生植株的方法,属于植物细胞工程领域。主要通过油桐叶柄直接诱导不定芽、继代增殖培养、壮苗培养、生根培养、炼苗移栽等过程,不仅为快速繁殖优良油桐植株提供了一条途径,而且为以后通过基因工程的方法改良油桐的抗性、提高油桐产量及油脂质量等性状,以及为油桐遗传体系的建立打下坚实的基础,为培育转基因油桐提供更广的途径和技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于油桐细胞工程领域,具体涉及一种油桐叶柄直接再生植株的方法。
背景技术
油桐(Verniciafordii)为大戟科(Euphorbiaceae)油桐属(Vernicia)植物的统称,是重要的工业油料树种,与油茶、核桃和乌桕并称我国四大木本油料树种。从油桐种子榨取的油称为桐油,是世界上最优质的植物干性油,为油漆、印刷墨油的优良原料。桐油具有干燥快、附着力强、比重轻、富光泽、耐酸碱、耐高温、抗冻裂、防水等优良特性。此外,桐油还是一种优良涂料,是合成新型复合材料的基本原料,具有广泛的用途。近年来,随着全球人口增加和经济的飞速增长,资源开发利用过度,发展油桐产业已迫在眉睫,如何挖掘油桐这一宝贵资源在生物质能源等领域的重要作用,推进油桐规模化发展是当前科研工作者艰巨的任务,也是帮助山区农民脱贫致富的手段之一。目前,油桐的常规育苗方法主要为实生苗及嫁接苗,嫁接苗虽然能够保持母本的优良性状,但成本较高,不利于规模化生产。同时,油桐枯萎病是我国油桐产区一种毁灭性病害,严重影响了油桐产业的稳定发展。通过组织培养可以快速繁殖油桐脱毒苗,在此基础上通过遗传体系转化而获得抗病植株,在木本油料植物遗传改良方面有广阔的前景。
油桐的离体培养研究很晚,到目前为止仅有以油桐离体叶片通过间接器官发生途径获得再生植株的报道,但由于叶片较嫩,在农杆菌侵染过程中特别容易受伤,再生活性降低,对实现油桐的遗传体系转化产生很大的障碍,并且,叶片容易失水,对卡那霉素的抗性较低,在卡那霉素筛选过程中容易死亡,而叶柄较叶片健壮,目前试验证明,叶柄在侵染过程中不容易死亡,对卡那霉素的抗性较强,因此,叶柄在油桐遗传体系转化过程中比叶片更有优势。同时,叶柄是茎中韧皮部和木质部的延伸,它是由一层或多层没有特定功能的薄壁细胞组成,这些细胞有较强的细胞分裂能力。这些薄壁细胞对植物生长调节剂和环境条件的变化非常敏感,因此,叶柄周围的薄壁细胞比其它细胞更容易分化成新的器官。利用植物离体器官直接再生不定芽不需经过愈伤组织诱导,培养周期短,且在培养过程中外植体不易发生变异的优点在其他植物中已有报道,但油桐离体组织直接再生不定芽比较少见。本发明人前期曾用离体油桐叶片来再生植株,当用此相同的培养基和培养条件以及步骤在本发明的叶柄培养时并未取得很好的效果(如表1)。所以本发明重新考虑以油桐无菌苗叶柄为外植体,寻求新的配方及培养条件,通过一步直接诱导不定芽、继代增殖、生根和炼苗移栽等过程,旨在建立一个高效稳定的油桐叶柄离体快繁体系,为油桐快速繁殖及遗传转化奠定基础。关键还在于能够大大提高农杆菌浸染实现遗传转化的可能性,为油桐快速繁殖及遗传转化提供更广的途径和技术支撑。
发明内容
本发明的目的是针对目前油桐采用叶盘法直接诱导不定芽再生植株技术存在的缺陷,在此基础上,提供了一种油桐叶柄高效直接再生植株的方法,该方法利用油桐无菌苗叶柄直接诱导出不定芽,其诱导率高,不定芽健壮,不定芽继代增殖系数高,壮苗效果好,生根率高,关键还在于能够大大提高农杆菌浸染实现遗传转化的可能性。
本发明的目的是通过以下方式实现的。
一种油桐叶柄直接再生植株的方法,包括以下步骤:
将油桐无菌苗叶柄,在无菌条件下切成长为0.5-1.0cm的叶柄,接种到WPM+1.0-4.0mg/LKT+0.01-0.1mg/LNAA的培养基中诱导不定芽,暗培养3天后,转到光照条件下培养20-25天,培养温度为26士1℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d；然后经过继代、增殖、壮苗和生根培养获得完整植株；最后进行炼苗、移栽。
上述方法中增殖培养的具体过程如下:将叶柄诱导的不定芽切下接种到WPM+2.0-3.0mg/LKT+0.05-0.1mg/LIBA+1.0-2.0mg/LGA3的培养基中进行不定芽的继代增殖培养,暗培养3天后,在光照条件下培养20-35天；培养温度为26士1℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d。
上述方法中壮苗培养的具体过程如下:将增殖培养得到的芽转接到WPM+0.5mg/LKT+1.0-2.0mg/LNAA+2.0mg/LGA3的培养基中进行壮苗培养,暗培养1天后,在光照条件下培养15-20天；培养温度为26士1℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d。
上述方法中生根培养的具体过程如下:将壮苗培养获得2-4cm的苗接到1/4MS+0.1-0.3mg/LIBA的培养基中进行生根培养；培养温度为26士1℃；暗培养3-5天,再转到光照下培养5-7天即可生根,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d。
上述方法中炼苗、移栽的具体过程如下:
将生根后的苗先在人工气候箱中进行移栽前炼苗,炼苗保持空气相对湿度为70-80％,3-5天后从培养瓶中取出,洗净根部培养基,移栽到营养杯中,基质为泥炭土:珍珠岩:黄土＝2:1:1,用薄膜盖住营养杯口,保持恒定的气候条件,两周后取出薄膜,逐步进行正常水肥管理。
上述的油桐叶柄直接再生植株的方法优选:
叶柄诱导不定芽使用的培养基为:WPM+3.0mg/LKT+0.05mg/LNAA；
增殖培养使用的培养基为:WPM+3.0mg/LKT+0.05mg/LIBA+2.0mg/LGA3；
所述的油桐无菌苗的获得过程如下:
选取成熟的油桐当年生种子,取除种皮,将种仁用自来水冲洗5-8min,然后浸泡15-20h,中间换水3-4次,然后在超净工作台中用0.1％的HgCl2消毒3-5min,用无菌水冲洗4-6次,接种在1/2MS基本培养基中,暗培养3-5天,再转到光照条件下培养20-30天即可长大成苗；培养温度为26士1℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d。
所述方法中用到的培养基均附加蔗糖30g/L,琼脂7g/L,pH调至5.4-5.8。
本发明主要过程包括:油桐叶柄直接诱导不定芽,通过继代增殖培养、壮苗培养、生根培养、炼苗及移栽。该方法对油桐叶柄直接不定芽诱导率高,不定芽继代增殖系数高,壮苗效果好,生根率高；不仅为快速繁殖大量优良油桐植株提供了一条新的技术途径,而且为以后通过基因工程的方法改良油桐抗性、培育抗病植株,提高油桐产量及油脂质量等性状,以及为油桐遗传体系的建立打下基础。这为油桐从传统的育种方式向分子育种方向迈进提供了可行性,为以后缓解生物能源短缺方面有着重要意义。
此外,油桐离体组织直接再生不定芽比较少见。本发明的详细优势总结如下:
1、本发明采用的离体组织是叶柄,较健壮,在农杆菌侵染过程中不容易死亡,对卡那霉素的抗性也较强,因此,叶柄在油桐遗传体系转化过程中比叶片更有优势；
2、叶柄是茎中韧皮部和木质部的延伸,它是由一层或多层没有特定功能的薄壁细胞组成,这些细胞有较强的细胞分裂能力。这些薄壁细胞对植物生长调节剂和环境条件的变化非常敏感,因此,叶柄周围的薄壁细胞比其它细胞更容易分化成新的器官；
3、本发明采用离体叶柄直接再生植株,基本不会产生愈伤组织,叶柄接种23天就可以长出不定芽,且芽体长势正常、健壮,更有利于继代增殖,比叶片诱导不定芽的时间缩短了23.33％,这在转基因过程中具有更大的可操作性。
4、本发明通过油桐叶柄诱导的不定芽无论从长势、芽体长度、叶片数量、叶片颜色、芽的粗度及质地等方面都要好于叶片诱导的不定芽(图15-16)。由图可知,叶片诱导的不定芽虽然较密,芽体较多,但大部分芽畸形,没有明显的顶芽和茎,只长叶片,不利于后期的继代培养,因此,通过油桐叶柄诱导的不定芽生长健壮,主茎明显,能过克服叶片诱导不定芽的不足,从而为油桐遗传改良提供了更广的途径。
5、本发明人前期曾用离体油桐叶片来再生植株,当用此相同的培养基和培养条件以及步骤在本发明的叶柄培养时并未取得很好的效果(如表1)。试验表明,用诱导叶片的培养基配方对叶柄不定芽的诱导效果较差,主要原因是叶柄和叶片所含的营养成分及内源激素的含量是不同的。所以本发明重新考虑以油桐无菌苗叶柄为外植体,从培养基类别、植物生长调节剂种类等方面寻求新的配方及培养条件,通过一步直接诱导不定芽、继代增殖、生根和炼苗移栽等过程,旨在建立一个高效稳定的油桐叶柄离体快繁体系,为油桐快速繁殖及遗传转化奠定基础。关键还在于能够大大提高农杆菌浸染实现遗传转化的可能性,为油桐转基因植株的培育提供更广的途径和技术支撑。
表1植物生长调节剂对油桐叶片与叶柄不定芽诱导的影响
附图说明
图1为本发明油桐无菌苗叶柄接种的照片；
图2为本发明油桐无菌苗叶柄10d后柄端膨大的照片；
图3为本发明油桐无菌苗叶柄诱导出不定芽初期的照片；
图4为本发明油桐无菌苗叶柄诱导的不定芽30d的照片；
图5为本发明油桐无菌苗叶柄诱导的不定芽30d的照片；
图6为本发明不定芽继代增殖培养初期的照片；
图7为本发明不定芽增殖培养的照片；
图8为本发明不定芽增殖培养的照片；
图9为本发明不定芽壮苗培养的照片；
图10为本发明不定芽生根培养的照片；
图11为本发明不定芽生根培养的照片；
图12为本发明不定芽生根培养的照片；
图13为本发明生根后移栽的组培苗的照片；
图14为本发明移栽后成活的组培苗的照片；
图15为叶片诱导不定芽做对照；
图16为叶片诱导不定芽做对照。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明,而非限制本发明。
实施例1
依次进行以下操作:
1、选取成熟的油桐当年生种子,取除种皮,将种仁用自来水冲洗5-8min,然后浸泡15-20h,中间换水3-4次,然后在超净工作台中用0.1％的HgCl2消毒3-5min,用无菌水冲洗4-6次,接种在1/2MS基本培养基中,暗培养3-5天,再转到光照条件下培养20-30天即可长大成苗；培养温度为26士1℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d；
表2不同消毒处理方式对油桐种胚的消毒效果影响
| 75％酒精 | 0.1％升汞 | 污染率 | 褐化率 |
| 0 | 2 | 26.65 | 0 |
| 0 | 3 | 3.83 | 0 |
| 0 | 4 | 3.03 | 0 |
| 0 | 5 | 2.78 | 1.27 |
| 10 | 3 | 3.05 | 4.54 |
| 10 | 5 | 0 | 49 |
| 20 | 5 | 0 | 54 |
| 30 | 5 | 0 | 67 |
2、选取油桐试管无菌苗叶柄,在无菌条件下切成长为0.5-1cm的叶柄,接种在培养基为WPM培养基+1.0-4.0mg/LKT+0.01-0.1mg/LNAA诱导不定芽,暗培养3天后,再到光照条件下培养20-25天,最高诱导率可达92.46％。附加蔗糖30g/L,琼脂7g/L,pH5.5。培养温度为(26士1)℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d；(见附图3-5)
表3不同激素配比对油桐叶柄不定芽诱导的效果影响
3、将诱导的不定芽切下接种到WPM培养基+2.0-3.0mg/LKT+0.05-0.1mg/LIBA+1.0-2.0mg/LGA3中进行不定芽的继代增殖培养,暗培养3天,再到光照条件下培养20-35天,附加蔗糖30g/L,琼脂7g/L,pH5.4-5.8；培养温度为26士1℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d；(见附图6-8)
表4不同激素配比对油桐不定芽增殖系数的影响
4、将增殖的芽进行壮苗培养,将增殖的芽转接到WPM培养基+0.5mg/LKT+1.0-2.0mg/LNAA+2.0mg/LGA3进行壮苗培养,暗培养1天,再转到光照条件下培养15-20天,苗高为3-5cm,苗粗为0.3-0.5cm。附加蔗糖30g/L,琼脂7g/L,pH5.5,培养温度为(26士1)℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d；(见附图9)
表5不同激素配比对油桐不定芽壮苗的影响
5、待试管苗长到2-4cm时接到生根培养基1/4MS+0.1-0.3mg/LIBA,附加蔗糖30g/L,琼脂7g/L,pH5.5。培养温度为(26士1)℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d。暗处理3-5天再转到光照下培养,光照培养下一周左右就会生根,生根率98％以上。(见附图10-12)
表6不同激素配比对油桐试管苗生根的影响
6、将生根后的试管苗先在室内进行移栽前炼苗,约3-5天,然后从培养瓶中取出,洗净根部培养基,移栽到营养杯中,基质为泥炭土:珍珠岩:黄土＝2:1:1,组培苗移栽后保持湿度80％以上,覆盖薄膜并每天喷水1～2次,两周后即可逐步进行正常管理,移栽成活率可达98％以上。(见附图13-14)
Claims (6)
1.一种油桐叶柄直接再生植株的方法,其特征在于,包括以下步骤:
将油桐无菌苗叶柄,在无菌条件下切成长为0.5-1.0cm的叶柄,接种到WPM+1.0-4.0mg/LKT+0.01-0.1mg/LNAA的培养基中诱导不定芽,暗培养3天后,转到光照条件下培养20-25天,培养温度为26士1℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d；然后经过继代增殖、壮苗和生根培养获得完整植株；最后进行炼苗、移栽；
继代培养的具体过程如下:将叶柄诱导的不定芽切下接种到WPM+1.0-2.0mg/LKT+0.1-0.5mg/LIBA+2.0mg/LGA3的培养基中进行不定芽的继代培养,暗培养3天后,转到光照条件下培养10-20天；培养温度为26士1℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d；
增殖培养的具体过程如下:将继代培养得到的健壮不定芽切下接种到WPM+2.0-3.0mg/LKT+0.05-0.1mg/LIBA+1.0-2.0mg/LGA3的培养基中进行不定芽的增殖培养,暗培养1天后,在光照条件下培养20-35天；培养温度为26士1℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d；
壮苗培养的具体过程如下:将增殖培养得到的芽转接到WPM+0.5mg/LKT+1.0-2.0mg/LNAA+2.0mg/LGA3的培养基中进行壮苗培养,暗培养1天后,在光照条件下培养15-20天；培养温度为26士1℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d；
生根培养的具体过程如下:将壮苗培养获得2-4cm的苗接到1/4MS+0.1-0.3mg/LIBA的培养基中进行生根培养；培养温度为26士1℃；暗培养3-5天,再转到光照下培养5-7天即可生根,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d。
2.根据权利要求1所述的油桐叶柄直接再生植株的方法,其特征在于,炼苗、移栽的具体过程如下:
将生根后的苗先在人工气候箱中进行移栽前炼苗,炼苗保持空气相对湿度为80％,3-5天后从培养瓶中取出,洗净根部培养基,移栽到营养杯中,基质为泥炭土:珍珠岩:黄土＝2:1:1,用薄膜盖住营养杯口,保持恒定的气候条件,两周后取出薄膜,逐步进行正常水肥管理。
3.根据权利要求1或2所述的油桐叶柄直接再生植株的方法,其特征在于,叶柄诱导不定芽使用的培养基为:WPM+3.0mg/LKT+0.05mg/LNAA。
4.根据权利要求1或2所述的油桐叶柄直接再生植株的方法,其特征在于,增殖培养使用的培养基为:WPM+3.0mg/LKT+0.05mg/LIBA+2.0mg/LGA3。
5.根据权利要求1所述的油桐叶柄直接再生植株的方法,其特征在于,所述的油桐无菌苗的获得过程如下:
选取成熟的油桐当年生种子,取除种皮,将种仁用自来水冲洗5-8min,然后浸泡15-20h,中间换水3-4次,然后在超净工作台中用0.1％的HgCl2消毒3-5min,用无菌水冲洗4-6次,接种在1/2MS基本培养基中,暗培养3-5天,再转到光照条件下培养20-30天即可长大成苗；培养温度为26士1℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d。
6.根据权利要求1所述的油桐叶柄直接再生植株的方法,其特征在于,所述方法中用到的培养基均附加蔗糖30g/L,琼脂7g/L,pH调至5.4-5.8。
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