CN104094848B

CN104094848B - 油桐下胚轴愈伤组织诱导及高效再生植株的方法

Info

Publication number: CN104094848B
Application number: CN201410326807.4A
Authority: CN
Inventors: 谭晓风; 李泽; 张琳; 卢锟; 龙洪旭; 吴玲利; 林青; 吕佳斌
Original assignee: Central South University of Forestry and Technology
Current assignee: Central South University of Forestry and Technology
Priority date: 2014-07-10
Filing date: 2014-07-10
Publication date: 2015-09-09
Anticipated expiration: 2034-07-10
Also published as: CN104094848A

Abstract

本发明公开了油桐下胚轴愈伤组织诱导及高效再生植株的方法,属于植物细胞工程领域。主要通过油桐下胚轴诱导愈伤组织、愈伤组织诱导不定芽、继代增殖培养、壮苗培养、生根培养、炼苗移栽等过程,不仅为快速繁殖优良油桐植株提供了一条途径,而且为以后通过基因工程的方法改良油桐的抗性、加速油桐分子育种进程及提高油脂质量等性状,以及为油桐遗传体系的建立打下坚实的基础。

Description

油桐下胚轴愈伤组织诱导及高效再生植株的方法

技术领域

本发明属于油桐细胞工程领域,具体涉及一种利用油桐下胚轴愈伤组织诱导及高效再生植株的方法。

背景技术

油桐为大戟科(Euphorbiaceae)油桐属(Vernicia)植物的统称,是重要的工业油料树种,与油茶、核桃和乌桕并称我国四大木本油料树种。从油桐种子榨取的油称为桐油,是世界上最优质的植物干性油,为油漆、印刷墨油的优良原料。桐油具有干燥快、附着力强、比重轻、富光泽、耐酸碱、耐高温、抗冻裂、防水等优良特性。此外,桐油还是一种优良涂料,是合成新型复合材料的基本原料,具有广泛的用途。近年来,随着全球人口增加和经济的飞速增长,资源开发利用过度,发展油桐产业已迫在眉睫,如何挖掘油桐这一宝贵资源在生物质能源等领域的重要作用,推进油桐规模化发展是当前科研工作者艰巨的任务,也是帮助山区农民脱贫致富的手段之一。目前,油桐的常规育苗方法主要为实生苗及嫁接苗,嫁接苗虽然能够保持母本的优良性状,但成本较高,不利于规模化生产。同时,油桐枯萎病是我国油桐产区一种毁灭性病害,严重影响了油桐产业的稳定发展。通过组织培养可以快速繁殖油桐脱毒苗,在此基础上通过遗传体系转化而获得抗病植株,在木本油料植物遗传改良方面有广阔的前景。

油桐的离体培养研究很晚,到目前为止仅有以油桐离体叶片通过器官发生途径获得再生植株的报道,但由于叶片较嫩,在农杆菌侵染过程中特别容易受伤,再生活性降低,对实现油桐的遗传体系转化产生很大的障碍,并且,叶片容易失水,对卡那霉素的抗性较低,在卡那霉素筛选过程中容易死亡,而下胚轴是通过合子胚发育而来胚性器官,胚性较强,具有很高的活力及分化再生能力,在植物遗传体系转化中有广阔的前景。目前,通过农杆菌侵染下胚轴获得转基因植株已经在油菜及柑橘中获得成功,而这些植物通过离体叶片也可以获得再生植株,但在农杆菌侵染时的过程中,以及在卡那霉素筛选中叶片容易死亡,不能获得转基因植株,相反,这些植物的下胚轴对卡那霉素的抗性较强,有利于目的基因的介导、转化和再生。因此,通过利用油桐下胚轴愈伤组织诱导获得再生植株在油桐转基因领域有广阔的前景。本发明以油桐幼嫩的下胚轴为外植体,通过在高浓度的激素下诱导愈伤组织,然后转接到愈伤组织分化不定芽的培养基中进行不定芽的分化、继代增殖、生根和炼苗移栽等过程,旨在建立一个高效稳定的油桐下胚轴离体快繁体系,为油桐遗传改良奠定基础。

发明内容

本发明的目的是针对目前油桐采用叶盘法获得再生植株技术存在的缺陷,在此基础上,提供了利用油桐下胚轴愈伤组织诱导获得再生植株,该方法利用油桐幼嫩的下胚轴诱导愈伤组织,再通过愈伤组织分化不定芽,其诱导率高,不定芽健壮,不定芽继代增殖系数高,壮苗效果好,生根率高,关键还在于能够大大提高农杆菌浸染实现遗传转化的可能性。

本发明的目的是通过以下方式实现的。

油桐下胚轴愈伤组织诱导及高效再生植株的方法,包括以下步骤:

将油桐成熟胚在无菌条件下萌发30天的下胚轴,在无菌条件下切成长为0.5-1.0cm的小块,接种到WPM+5.0-10.0mg/L6-BA+1.0mg/L KT+0.1mg/L NAA的培养基中诱导愈伤组织,暗培养3天后,转到光照条件下培养10天；培养温度为26士1℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d；然后经过不定芽分化、继代增殖、壮苗和生根培养获得完整植株；最后进行炼苗、移栽。

上述方法中不定芽分化的具体过程如下:将下胚轴诱导的质地较好的愈伤组织接种到WPM+0.5-1.0mg/L6-BA+0.01-0.05mg/L NAA+2.0mg/L GA₃的培养基中进行不定芽的分化培养,暗培养1天后,转到光照条件下培养25-30天；培养温度为26士1℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d。

上述方法中继代增殖培养的具体过程如下:将愈伤组织分化培养得到的健壮不定芽切下接种到WPM+2.0-3.0mg/L KT+0.05mg/L IAA+2.0mg/L GA₃的培养基中进行不定芽的增殖培养,暗培养1天后,在光照条件下培养25-30天；培养温度为26士1℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d。

上述方法中壮苗培养的具体过程如下:将增殖培养得到的芽转接到WPM+0.5-1.0mg/LNAA+1.0-2.0mg/L GA₃的培养基中进行壮苗培养,暗培养1天后,在光照条件下培养15-20天；培养温度为26士1℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d。

上述方法中生根培养的具体过程如下:将壮苗培养获得2-4cm的苗接到1/4MS+0.1-0.3mg/L IBA的培养基中进行生根培养；培养温度为26士1℃,暗培养3-5天,再转到光照下培养5-7天即可生根,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d。

上述方法中炼苗、移栽的具体过程如下:

将生根后的苗先在人工气候箱中进行移栽前炼苗,炼苗保持空气相对湿度为80％以上,3-5天后从培养瓶中取出,洗净根部培养基,移栽到营养杯中,基质为泥炭土:珍珠岩:黄土＝2:1:1,用薄膜盖住营养杯口,保持恒定的气候条件,两周后取出薄膜,逐步进行正常水肥管理。

所述的油桐下胚轴愈伤组织诱导及高效再生植株的方法优选,

不定芽分化的培养基为:WPM+1.0mg/L6-BA+0.01mg/L NAA+2.0mg/L GA₃。

壮苗培养使用的培养基为:WPM+0.5-1.0mg/L NAA+2.0mg/L GA₃。

下胚轴的获得过程如下:

选取成熟的油桐当年生种子,取除种皮,将种仁用自来水冲洗5-8min,然后浸泡15-20h,中间换水3-4次,然后在超净工作台中用0.1％的HgCl₂消毒3-5min,用无菌水冲洗4-6次,接种在1/2MS基本培养基中,暗培养3-5天,再转到光照条件下培养20-30天即可使用下胚轴进行愈伤组织诱导；培养温度为26士1℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d。

所述方法中用到的培养基均附加蔗糖30g/L,琼脂7g/L,pH调至5.4-5.8。

本发明主要过程包括:主要通过油桐下胚轴诱导愈伤组织、愈伤组织分化不定芽、继代培养、增殖培养、壮苗培养、生根培养、炼苗移栽。该方法对油桐下胚轴愈伤组织诱导率高,愈伤组织再分化能力强,不定芽健壮有利于继代培养,增殖系数高,壮苗效果好,生根率高；不仅为快速繁殖大量优良油桐植株提供了一条新的技术途径,而且为以后通过基因工程的方法改良油桐抗性、培育抗病植株,提高油桐产量及油脂质量等性状,以及为油桐遗传体系的建立打下基础。这为油桐从传统的育种方式向分子育种方向迈进提供了可行性,为以后缓解生物能源短缺方面有着重要意义。

此外,油桐离体组织培养的研究比较少见。本发明的详细优势总结如下:

1、本发明采用的离体组织是下胚轴,是通过合子胚发育而来胚性器官,胚性较强,具有很高的活力及分化再生能力,在植物遗传体系转化中有广阔的前景；

2、下胚轴在农杆菌侵染时的过程中不易死亡,以及在卡那霉素筛选中抗性较强,有利于目的基因的介导、转化和再生。目前,通过下胚轴获得转基因植株已有报道,转基因油菜就是通过农杆菌介导下胚轴成功获得的,在木本植物柑橘中也通过农杆菌介导下胚轴获得了转基因植株,而柑橘叶片再生体系已建立,但是通过农杆菌侵染叶片的过程中,叶片容易死亡,此方法还不能得到柑橘转基因植株。因此,下胚轴在植物遗产体系转化过程中是较好的选择。本发明是在前人在其它植物研究过程中的到了启发,选取油桐下胚轴通过大量的试验组合得到了油桐下胚轴高效再生体系建立的培养基配方,为油桐转基因植株的培育提供更有效的途径。

3、本发明通过油桐下胚轴诱导的不定芽无论从长势、芽体长度、叶片数量、叶片颜色、芽的粗度及质地等方面都要好于叶片诱导的不定芽(图15-16)。由图可知,叶片诱导的不定芽虽然较密,芽体较多,但大部分芽畸形,没有明显的顶芽和茎,只长叶片,不利于后期的继代培养,因此,通过油桐下胚轴诱导的不定芽生长健壮,主茎明显,能过克服叶片诱导不定芽的不足,从而为油桐遗传改良提供了更广的途径。

4、试验表明,用诱导叶片的培养基配方对下胚轴不定芽的诱导效果较差,主要原因是不同器官组织所含的营养成分和内源激素的含量有所差异,因此,不同组织器官有合适他们的最适宜培养基配方,下胚轴是通过合子胚发育而来的,具有胚性,细胞活性较强,分化能力远远高于叶片和其他器官的分化能力。所以本发明重新考虑以下胚轴为外植体,通过在高浓度的激素下诱导愈伤组织,然后转接到愈伤组织分化不定芽的培养基中进行不定芽的分化、继代增殖、生根和炼苗移栽等过程,旨在建立一个新的高效稳定的油桐下胚轴离体快繁体系和途径,为油桐遗传改良奠定基础。关键还在于能够大大提高农杆菌浸染实现遗传转化的可能性。

5、黄艳等人用油桐下胚轴进行愈伤组织及不定芽的诱导,虽然愈伤组织诱导率可达100％,但后期分化的不定芽不利于继代增殖,容易死亡,且诱导率较低,最高诱导率仅为56％,不能实现油桐遗传体系转化。本发明前期采用该配方对油桐下胚轴进行诱导,发现诱导出的不定芽大部分畸形,继代过程荣慢慢死亡,不利于后期的继代增殖培养。本发明重新选择适合木本植物培养的WPM培养基添加高浓度的6-BA,附加KT和生长素NAA的不同组合快速诱导愈伤组织,等愈伤组织长出后及时转接到不定芽诱导的培养基中进行不定芽诱导,通过大量试验得到了适合油桐下胚轴稳定高效的培养基配方,极大的提高了愈伤组织分化率,更有利于后期的继代增殖培养。

附图说明

图1为本发明油桐下胚轴接种的照片；

图2为本发明油桐下胚轴诱导出愈伤组织的照片；

图3为本发明油桐下胚轴愈伤组织分化出不定芽初期的照片；

图4为本发明油桐下胚轴愈伤组织分化不定芽后的照片；

图5为本发明油桐下胚轴愈伤组织分化不定芽20d的照片；

图6为本发明油桐下胚轴愈伤组织分化不定芽15d的照片；

图7为本发明油桐下胚轴愈伤组织分化不定芽15d的照片；

图8为本发明不定芽继代增殖培养初期的照片；

图9为本发明不定芽增殖培养后期的照片；

图10为本发明不定芽壮苗培养的照片；

图11为本发明不定芽生根培养的照片；

图12为本发明不定芽生根培养的照片；

图13为本发明生根后移栽的组培苗的照片；

图14为本发明移栽后成活的组培苗的照片；

图15为叶片诱导不定芽做对照；

图16为叶片诱导不定芽做对照。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明,而非限制本发明。

实施例1

依次进行以下操作:

1、选取成熟的油桐当年生种子,取除种皮,将种仁用自来水冲洗5-8min,然后浸泡15-20h,中间换水3-4次,然后在超净工作台中用0.1％的HgCl₂消毒3-5min,用无菌水冲洗4-6次,接种在1/2MS基本培养基中,暗培养5天,再转到光照条件下培养25天,下胚轴高度可达3-4cm,在无菌条件下切成长为0.5-1cm的小块,按形态学顶端朝上的方式接种在WPM培养基+5.0-10.0mg/L6-BA+1.0mg/L KT+0.1mg/L NAA诱导愈伤组织,暗培养3天后,再到光照条件下培养10天,最高诱导率可达100％。附加蔗糖30g/L,琼脂7g/L,pH5.5。培养温度为(26士1)℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d；(见附图2)

表1不同激素配比对油桐下胚轴愈伤组织诱导的效果影响

2、将诱导的质地较好的愈伤组织接种到WPM培养基+0.5-1.0mg/L6-BA+0.01-0.05mg/LNAA+2.0mg/L GA₃中进行不定芽的诱导,暗培养1天,再到光照条件下培养25-30天,最高诱导率可达92.46％。附加蔗糖30g/L,琼脂7g/L,pH5.4-5.8；培养温度为26士1℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d；(见附图3-7)

表2不同激素配比对油桐下胚轴愈伤组织分化不定芽影响

3、将不定芽进行继代增殖培养,将继代的不定芽切下接种在WPM培养基+2.0-3.0mg/LKT+0.05mg/L IAA+2.0mg/L GA₃进行不定芽的增殖培养,暗培养1天,再转接到光照条件下培养25-30天,最高增殖系数为6.8。附加蔗糖30g/L,琼脂7g/L,pH5.5。培养温度为(26士1)℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d；(见附图8-9)

表3不同激素配比对油桐不定芽增殖系数的影响

4、将增殖的芽进行壮苗培养,将增殖的芽转接到WPM培养基0.5-1.0mg/L NAA+1.0-2.0mg/L GA₃进行壮苗培养,暗培养1天,再转到光照条件下培养15-20天,苗高为3-5cm,苗粗为0.3-0.5cm。附加蔗糖30g/L,琼脂7g/L,pH5.5,培养温度为(26士1)℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d；(见附图10)

表4不同激素配比对油桐不定芽壮苗的影响

5、待试管苗长到2-4cm时接到生根培养基1/4MS+0.1-0.3mg/L IBA,附加蔗糖25g/L,琼脂7g/L,pH5.5。培养温度为(26士1)℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d。暗处理5-7天再转到光照下培养,光照培养下一周左右就会生根,生根率98％以上。(见附图11-12)

表5不同激素配比对油桐试管苗生根的影响

6、将生根后的试管苗先在室内进行移栽前炼苗,约3-5天,然后从培养瓶中取出,洗净根部培养基,移栽到营养杯中,基质为泥炭土:珍珠岩:黄土＝2:1:1,组培苗移栽后保持湿度80％以上,覆盖薄膜并每天喷水1～2次,两周后即可逐步进行正常管理,移栽成活率可达96％以上。(见附图13-14)

Claims

1.油桐下胚轴愈伤组织诱导及高效再生植株的方法,其特征在于,包括以下步骤:

将油桐成熟胚在无菌条件下萌发30天的下胚轴,在无菌条件下切成长为0.5-1.0cm的小块,接种到WPM+5.0-10.0mg/L 6-BA+1.0mg/L KT+0.1mg/LNAA的培养基中诱导愈伤组织,暗培养3天后,转到光照条件下培养10天；培养温度为26士1℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d；然后经过不定芽分化、继代增殖、壮苗和生根培养获得完整植株；最后进行炼苗、移栽；

不定芽分化的具体过程如下:将下胚轴诱导的质地较好的愈伤组织接种到WPM+0.5-1.0mg/L 6-BA+0.01-0.05mg/L NAA+2.0mg/L GA₃的培养基中进行不定芽的分化培养,暗培养1天后,转到光照条件下培养25-30天；培养温度为26士1℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d；

继代增殖培养的具体过程如下:将愈伤组织分化培养得到的健壮不定芽切下接种到WPM+2.0-3.0mg/L KT+0.05mg/L IAA+2.0mg/L GA₃的培养基中进行不定芽的增殖培养,暗培养1天后,在光照条件下培养25-30天；培养温度为26士1℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d；

壮苗培养的具体过程如下:将增殖培养得到的芽转接到WPM+0.5-1.0mg/LNAA+1.0-2.0mg/L GA₃的培养基中进行壮苗培养,暗培养1天后,在光照条件下培养15-20天；培养温度为26士1℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d；

生根培养的具体过程如下:将壮苗培养获得2-4cm的苗接到1/4MS+0.1-0.3mg/L IBA的培养基中进行生根培养；培养温度为26士1℃,暗培养3-5天,再转到光照下培养5-7天生根,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d。

2.根据权利要求1所述的油桐下胚轴愈伤组织诱导及高效再生植株的方法,其特征在于,炼苗、移栽的具体过程如下:

3.根据权利要求1或2所述的油桐下胚轴愈伤组织诱导及高效再生植株的方法,其特征在于,不定芽分化的培养基为:WPM+1.0mg/L 6-BA+0.01mg/LNAA+2.0mg/L GA₃。

4.根据权利要求1或2所述的油桐下胚轴愈伤组织诱导及高效再生植株的方法,其特征在于,壮苗培养使用的培养基为:WPM+0.5-1.0mg/L NAA+2.0mg/LGA₃。

5.根据权利要求1所述的油桐下胚轴愈伤组织诱导及高效再生植株的方法,其特征在于,下胚轴的获得过程如下:

选取成熟的油桐当年生种子,取除种皮,将种仁用自来水冲洗5-8min,然后浸泡15-20h,中间换水3-4次,然后在超净工作台中用0.1％的HgCl₂消毒3-5min,用无菌水冲洗4-6次,接种在1/2MS基本培养基中,暗培养3-5天,再转到光照条件下培养20-30天使用下胚轴进行愈伤组织诱导；培养温度为26士1℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d。

6.根据权利要求1所述的油桐下胚轴愈伤组织诱导及高效再生植株的方法,其特征在于,所述方法中用到的培养基均附加蔗糖30g/L,琼脂7g/L,pH调至5.4-5.8。