CN104604677A - 一种降低俄罗斯橡胶草组织培养褐化率的组培繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物细胞工程技术植物组织培养领域，具体涉及的是一种降低俄罗斯橡胶草组织培养褐化率的组培繁殖方法。本发明包括：接种：选橡胶草品系的成熟种子；诱导分化愈伤组织：诱导愈伤组织形成；不定芽增殖；生根培养：将丛生芽分成单株后转至生根培养基上进行生根培养；炼苗移栽：得到橡胶草再生植株。本发明建立了一种有效降低俄罗斯橡胶草组织培养褐化率与快速繁殖的方法，通过调整各阶段培养基的成分并添加了抗氧化剂等技术手段极大地降低了俄罗斯橡胶草组织培养褐化率，提高了橡胶草的繁殖系数，使用本发明的培养基可以将褐化率降低到35％以下,添加本发明所述的Na2S2O3能够将褐化率进一步降低到10％以下。
Description
技术领域
本发明属于植物细胞工程技术植物组织培养领域，具体涉及的是一种降低俄罗斯橡胶草组织培养褐化率的组培繁殖方法。
背景技术
橡胶草(Taraxacum kok-saghyz Rodin)是菊科蒲公英属多年生宿根草本植物，其根中天然橡胶含量平均为22.4％，并且其质量与巴西橡胶树产的橡胶相似，同时还含有25－40％的菊糖，被公认为是有发展潜力的优良天然橡胶植物之一，同时也是研究调控橡胶合成与贮藏分子过程的理想模式植物。
橡胶草繁殖过程中，自交不育，所以其种子是个体间及不同品系之间杂交的结果，这样难以用种子保存优良个体及遗传品系以便进一步育种；同时由于橡胶草野生生境受到严重破坏，目前其资源量非常稀少，限制了其试验研究，所以需要开发组织培养的方法，同时也为橡胶草遗传转化体系的建立及其育种提供技术支持。目前我国的研究有：中国热带农业科学院橡胶研究所林伯煌《热带农业工程》中发表的“橡胶草的组织培养研究”和石河子大学罗成华《北方园艺》发表的“橡胶草高频再生体系的建立”等，根据目前的研究成果分析，现有的技术大多是以新疆野生的橡胶草为材料，然而与橡胶含量更高的俄罗斯橡胶草相比，上述研究直接以俄罗斯橡胶草为客体，发现俄罗斯橡胶草叶片外植体经直接消毒后接种至培养基上极易导致褐化，尤其在我国大陆的亚热带和温带气候及土壤环境下，褐化率竟高达80％，同时在我国的生长率和成活率也较低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种降低俄罗斯橡胶草组织培养褐化率的组培繁殖方法。
本发明的目的是这样实现的：
(1)接种：选俄罗斯橡胶草品系的成熟种子，消毒处理后在无菌条件下接种于诱导培养基上培养，在接种初期在人工气候箱中暗培养5天，再移至培养间中自然光下培养，所述的诱导培养基为：MS+6-BA1.5～2.0mg/L+NAA0.1～0.2mg/L；
(2)诱导分化愈伤组织：将经步骤(1)处理得到的种子萌发后诱导愈伤组织形成，接种于分化培养基上，进行不定芽的分化培养，所述的分化培养基为：MS+6-BA 0.5～1.0mg/L+NAA 0.05～0.1mg/L+GA30.1～0.2mg/L；
(3)不定芽增殖：将步骤(2)的不定芽接种于增殖培养基上进行增殖培养，在增殖培养基中添加抗氧化剂，生成丛生芽，所述的增殖培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L；
(4)生根培养：将丛生芽分成单株后转至生根培养基上进行生根培养，生成生根苗，所 述的生根培养基为：1/2MS+NAA 0.3mg/L；
(5)炼苗移栽：将生根苗在炼苗室开盖锻炼3～5天后，移栽至细沙、蛭石、珍珠岩等比例混合的基质中，得到橡胶草再生植株。
所有培养基均添加蔗糖30g/L，琼脂粉5g/L，pH值为5.8～6.0。
在所述的增殖培养基还加入Na2S2O3，含量为15g/L。
步骤(1)选用的橡胶草品系的成熟种子为外植体材料，首先浸泡4小时，用洗洁精溶液洗净后，用流水冲2～4小时，在超净工作台上，用75％体积百分比酒精消毒10s，用0.1％质量百分比HgCL2溶液消毒5min，最后用无菌水冲洗5～6次，接种于诱导培养基上培养，在接种初期在人工气候箱中暗培养5天，再移至培养间中自然光下培养。
步骤(2)中愈伤组织置于分化培养基上培养，4周后愈伤组织分化形成不定芽。
所述步骤(1)的培养条件是，人工气候箱中暗培养5d，培养温度为23±2℃，再移至培养间中自然光下培养，培养温度为25±2℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为16小时/天。
所述步骤(2)、(3)、(4)的培养条件是，培养温度为25±2℃、光照强度为1500～2000lx、光照时间为16小时/天。
所述步骤(5)的培养条件是，培养温度为24-26℃，炼苗室中4遮光，使光照强度为自然光的60％，湿度控制在80％。
本发明的有益效果在于：本发明建立了一种有效降低俄罗斯橡胶草组织培养褐化率与快速繁殖的方法，相比传统的橡胶草组培繁殖方法，通过调整各阶段培养基的成分并添加了抗氧化剂等技术手段极大地降低了俄罗斯橡胶草组织培养褐化率，提高了橡胶草的繁殖系数，经过试验研究,使用本发明的培养基可以将褐化率降低到35％以下,添加本发明所述的Na2S2O3能够将褐化率进一步降低到10％以下。因此本发明能够在较短时间内获得大量遗传性状一致的优质壮苗，一致性强，成苗容易，易于管理。摆脱了季节与气候的限制因素，从而缩短了育苗周期，增加了繁殖量。解决了橡胶草个体间及种间容易杂交而难以保存优良个体及遗传品系的问题，同时也为橡胶草遗传转化体系的建立与育种提供技术支持。
附图说明
图1为本发明的流程图。
图2为本发明为诱导培养基BA含量褐化率变化图。
图3为本发明为诱导培养基NAA含量褐化率变化图。
图4为本发明Na2S2O3含量褐化率变化图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步描述：
如图1所示，本发明的目的是提供一种有效降低俄罗斯橡胶草组织培养褐化率与快速组培繁殖的方法，该方法操作简单、可有效降低褐化率，进行快速组培繁殖，可快速生产大量性状一致的优质种苗，解决种子难以保存优良个体及遗传品系的问题，同时也为橡胶草遗传转化体系的建立奠定技术基础。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。这种有效降低俄罗斯橡胶草组织培养褐化率与快速组培繁殖的方法，包括如下步骤：
(1)培养基的配制：
A.诱导培养基：MS+6-BA1.5～2.0mg/L+NAA0.1～0.2mg/L；
B.分化培养基：MS+6-BA 0.5～1.0mg/L+NAA 0.05～0.1mg/L+GA30.1～0.2mg/L；
C.增殖培养基：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Na2S2O3 15g/L；
D.生根培养基：1/2MS+NAA 0.3mg/L；
其中各阶段培养基均添加蔗糖30g/L，琼脂粉5g/L，pH值为5.8～6.0；
(2)材料与接种：材料为引自俄罗斯的橡胶草品系的成熟种子，将消毒处理后的种子在无菌条件下接种于诱导培养基上培养，在接种初期先在人工气候箱中暗培养5d，再移至培养间中自然光下培养，可有效降低外植体诱导的褐化率至35％以下；
(3)愈伤组织的诱导分化：将步骤(2)种子萌发后诱导愈伤组织形成后接种于分化培养基上，进行不定芽的分化培养；
(4)不定芽的增殖：将步骤(3)的不定芽接种于增殖培养基上进行增殖培养，在增殖培养基中添加抗氧化剂Na2S2O3，有效防止了褐化，将褐化率降至10％以下，从而达到快速繁殖的目的；
(5)生根培养：将步骤(4)丛生芽分成单株后转至生根培养基上进行生根培养。
(6)炼苗移栽：将步骤(5)的生根苗在炼苗室开盖锻炼3～5d后，移栽至细沙：蛭石：珍珠岩＝1：1：1的基质中，得到橡胶草再生植株。
在所述步骤(1)中，所述的培养基包括基本培养基和组培各阶段培养基的组分具体为：
A.诱导培养基：MS+6-BA1.5～2.0mg/L+NAA0.1～0.2mg/L；
B.分化培养基：MS+6-BA 0.5～1.0mg/L+NAA 0.05～0.1mg/L+GA30.1～0.2mg/L；
C.增殖培养基：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Na2S2O3 15g/L；
D.生根培养基：1/2MS+NAA 0.3mg/L；
其中各阶段培养基均添加蔗糖30g/L，琼脂粉5g/L，pH值为5.8～6.0；
在所述步骤(2)中，选用橡胶草的成熟种子为外植体材料，先浸泡4h，用洗洁精溶液 洗净后，用流水冲2～4h，在超净工作台上，先用75％(体积百分比)酒精消毒10s，再用0.1％(质量百分比)HgCL2溶液消毒5min，最后用无菌水冲洗5～6次，接种于诱导培养基上培养，在接种初期先在人工气候箱中暗培养5d，再移至培养间中自然光下培养，可有效降低外植体诱导的褐化率至35％以下。如图2、3所示
在所述步骤(3)中，种子培养3～4周后陆续萌发，萌发后的幼苗在诱导培养基上培养2～3周后有愈伤组织形成，选取生长状态好的愈伤组织置于分化培养基上培养，4周后愈伤组织分化形成不定芽。
在所述步骤(4)中，不定芽接种于增殖培养基上进行继代增殖培养，在增殖培养基中添加抗氧化剂Na2S2O3，有效防止了褐化，将褐化率降至10％以下，3周后形成丛生芽。如图4所示。
在所述步骤(5)中，丛生芽分成单株后转至生根培养基上进行生根培养，培养2～3周后成为具有根系的壮苗。
在所述步骤(6)中，将生根苗在炼苗室开盖锻炼3～5d后，移栽至细沙：蛭石：珍珠岩＝1：1：1的基质中，培养4～5周后得到橡胶草再生植株。
在所述步骤(2)中，所述的培养条件是，先在人工气候箱中暗培养5d，培养温度为23士2℃，再移至培养间中自然光下培养，培养温度为25士2℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为16h/d。
在所述步骤(3)、(4)、(5)中，所述的培养条件是，培养温度为25士2℃、光照强度为1500～2000lx、光照时间为16h/d。
在所述步骤(6)中，所述的培养条件是，培养温度为24-26℃，前一周适当遮光，使光照强度为自然光的60％，湿度控制在80％左右，以后逐渐降低湿度，恢复光照强度，直至将移栽苗置于自然条件下。
实施例1
本发明提供了一种有效降低俄罗斯橡胶草组织培养褐化率与快速组培繁殖的方法，其步骤为：
(1)培养基的配制
A.诱导培养基：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L；
B.分化培养基：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+GA30.2mg/L；
C.增殖培养基：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Na2S2O3 15g/L；
D.生根培养基：1/2MS+NAA 0.3mg/L；
其中各阶段培养基均添加蔗糖30g/L，琼脂粉5g/L，pH值为5.8～6.0；
(1)材料与接种
材料为引自俄罗斯的橡胶草成熟种子。先浸泡4h，用洗洁精溶液洗净后，用流水冲2～4h，在超净工作台上先用75％(体积百分比)酒精消毒10s,再用0.1％(质量百分比)HgCL2溶液消毒5min，最后用无菌水冲洗5～6次，然后将种子接种到诱导培养基上，先在人工气候箱中暗培养5d，温度为23士2℃，再移至培养间中自然光下培养，培养温度为25士2℃、光照强度为1500～2000lx、光照时间为16h/d。
(3)愈伤组织的诱导及分化
种子培养3～4周后陆续萌发,萌发后的橡胶草在诱导培养基上培养2～3周后有愈伤组织形成,选取生长状态好的愈伤组织至于分化培养基上培养,4周后愈伤组织分化成不定芽；培养温度为25士2℃、光照强度为1500～2000lx、光照时间为16h/d。
(4)继代增殖
将橡胶草的不定芽接种于增殖培养基上进行增殖培养，在增殖培养基中添加抗氧化剂Na2S2O3，有效防止了褐化，将褐化率降至10％以下，从而达到快速繁殖的目的；大约3周后形成丛生芽；培养温度为25士2℃、光照强度为1500～2000lx，光照时间为16h/d。
(5)生根培养
将不定芽丛在无菌条件下分成单株后转接到基本培养基上进行生根培养,培养2～3周后成为具有根系的壮苗；培养温度为25士2℃、光照强度为1500～2000lx，光照时间为16h/d。
(6)炼苗移栽
当生根苗根系达2cm以上时，打开培养瓶盖，在室温下炼苗3～5d后，将生根苗小心自瓶中取出，洗去培养基，移栽至细沙：蛭石：珍珠岩＝1：1：1的基质中，得到橡胶草再生植株；温度控制在24-26℃，前一周适当遮光，使光照强度为自然光的60％，湿度控制在70％左右，以后逐渐降低湿度，恢复光照强度，直至将移栽苗置于自然条件下。
实施例2
本发明提供了一种有效降低俄罗斯橡胶草组织培养褐化率与快速组培繁殖的方法，其步骤为：
(1)培养基的配制
A.诱导培养基：MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.1mg/L；
B.分化培养基：MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+GA30.1mg/L；
C.增殖培养基：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Na2S2O3 15g/L；
D.生根培养基：1/2MS+NAA 0.3mg/L；
其中各阶段培养基均添加蔗糖30g/L，琼脂粉5g/L，pH值为5.8～6.0；
(2)材料与接种
材料为引自俄罗斯的橡胶草成熟种子。先浸泡4h，用洗洁精溶液洗净后，用流水冲2～4h，在超净工作台上先用75％(体积百分比)酒精消毒10s,再用0.1％(质量百分比)HgCL2溶液消毒5min，最后用无菌水冲洗5～6次，然后将种子接种到诱导培养基上，先在人工气候箱中暗培养5d，温度为23±2℃，再移至培养间中自然光下培养，培养温度为25±2℃、光照强度为1500～2000lx、光照时间为16h/d。
(3)愈伤组织的诱导及分化
种子培养3～4周后陆续萌发,萌发后的橡胶草在诱导培养基上培养2～3周后有愈伤组织形成,选取生长状态好的愈伤组织至于分化培养基上培养，培养温度为25±2℃、光照强度为1500～2000lx、光照时间为16h/d；
(4)继代增殖
将橡胶草的不定芽丛接种于增殖培养基上进行增殖培养，在增殖培养基中添加抗氧化剂Na2S2O3，有效防止了褐化，将褐化率降至10％以下，从而达到快速繁殖的目的；大约3周后形成丛生芽；培养温度为培养温度为25±2℃、光照强度为1500～2000lx、光照时间为16h/d。
(5)生根培养
将不定芽丛在无菌条件下分成单株后转接到基本培养基上进行生根培养,培养2～3周后成为具有根系的壮苗；培养温度为25±2℃、光照强度为1500～2000lx，光照时间为16h/d。
(6)炼苗移栽
当生根苗根系达2cm以上时，打开培养瓶盖，在室温下炼苗3～5d后，将生根苗小心自瓶中取出，洗去培养基，移栽至细沙：蛭石：珍珠岩＝1：1：1的基质中，得到橡胶草再生植株；温度控制在24-26℃，前一周适当遮光，使光照强度为自然光的60％，湿度控制在70％左右，以后逐渐降低湿度，恢复光照强度，直至将移栽苗置于自然条件下。
本发明的方法可有效降低俄罗斯橡胶草组织培养褐化率，可进行俄罗斯橡胶草的快速组培繁殖，不受季节限制，可常年生产橡胶草组培苗，并可实现橡胶草组培苗的规模化生产。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
Claims (8)
1.一种降低俄罗斯橡胶草组织培养褐化率的组培繁殖方法，其特征在于：
(1)接种：选俄罗斯橡胶草品系的成熟种子，消毒处理后在无菌条件下接种于诱导培养基上培养，在接种初期在人工气候箱中暗培养5天，再移至培养间中自然光下培养，所述的诱导培养基为：MS+6-BA1.5～2.0mg/L+NAA0.1～0.2mg/L；
(2)诱导分化愈伤组织：将经步骤(1)处理得到的种子萌发后诱导愈伤组织形成，接种于分化培养基上，进行不定芽的分化培养，所述的分化培养基为：MS+6-BA 0.5～1.0mg/L+NAA 0.05～0.1mg/L+GA30.1～0.2mg/L；
(3)不定芽增殖：将步骤(2)的不定芽接种于增殖培养基上进行增殖培养，在增殖培养基中添加抗氧化剂，生成丛生芽，所述的增殖培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L；
(4)生根培养：将丛生芽分成单株后转至生根培养基上进行生根培养，生成生根苗，所述的生根培养基为：1/2MS+NAA 0.3mg/L；
(5)炼苗移栽：将生根苗在炼苗室开盖锻炼3～5天后，移栽至细沙、蛭石、珍珠岩等比例混合的基质中，得到橡胶草再生植株。
2.根据权利要求1所述的一种降低俄罗斯橡胶草组织培养褐化率的组培繁殖方法，其特征在于：所述的所有培养基均添加蔗糖30g/L，琼脂粉5g/L，pH值为5.8～6.0。
3.根据权利要求1或2所述的一种降低俄罗斯橡胶草组织培养褐化率的组培繁殖方法，其特征在于：在所述的增殖培养基还加入Na2S2O3，含量为15g/L。
4.根据权利要求1或2所述的一种降低俄罗斯橡胶草组织培养褐化率的组培繁殖方法，其特征在于：
所述步骤(1)选用的橡胶草品系的成熟种子为外植体材料，首先浸泡4小时，用洗洁精溶液洗净后，用流水冲2～4小时，在超净工作台上，用75％体积百分比酒精消毒10s，用0.1％质量百分比HgCL2溶液消毒5min，最后用无菌水冲洗5～6次，接种于诱导培养基上培养，在接种初期在人工气候箱中暗培养5天，再移至培养间中自然光下培养。
5.根据权利要求1或2所述的一种降低俄罗斯橡胶草组织培养褐化率的组培繁殖方法，其特征在于：
所述步骤(2)中愈伤组织置于分化培养基上培养，4周后愈伤组织分化形成不定芽。
6.根据权利要求2所述的一种降低俄罗斯橡胶草组织培养褐化率的组培繁殖方法，其特征在于：所述步骤(1)的培养条件是，人工气候箱中暗培养5d，培养温度为23±2℃，再移至培养间中自然光下培养，培养温度为25±2℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为16小时/天。
7.根据权利要求1或2所述的一种降低俄罗斯橡胶草组织培养褐化率的组培繁殖方法，其特征在于：所述步骤(2)、(3)、(4)的培养条件是，培养温度为25±2℃、光照强度为1500～2000lx、光照时间为16小时/天。
8.根据权利要求1或2所述的一种降低俄罗斯橡胶草组织培养褐化率的组培繁殖方法，其特征在于：所述步骤(5)的培养条件是，培养温度为24-26℃，炼苗室中遮光，使光照强度为自然光的60％，湿度控制在80％。
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