CN104938335A - 利用油茶下胚轴获得再生植株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了油茶下胚轴获得再生植株的方法，属于植物细胞工程领域。主要通过油茶下胚轴诱导不定芽，通过不定芽的继代增殖培养、壮苗培养、生根培养、炼苗移栽等过程，不仅为快速繁殖优良油茶植株提供了一条新途径，而且为以后通过基因工程的方法改良油茶抗性、加速油茶分子育种进程及提高油脂质量等性状，为油茶遗传体系的建立打下坚实的基础。

Description

利用油茶下胚轴获得再生植株的方法
技术领域
本发明属于油茶细胞工程领域，具体涉及一种以油茶下胚轴为外植体诱导不定芽，继而获得完整试管苗的组织培养培养方法。
背景技术
油茶(Camellia Oleifera)是山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)常绿灌木或小乔木，是我国特有的木本食用油料树种，与油橄榄、油棕、椰子并称为世界四大木本油料植物。茶油不饱和脂肪酸含量达90％以上，色佳味香，风味独特，营养丰富，耐贮藏，有降血压、血脂及软化血管的作用，对心血管疾病的预防有重要作用，是优质的食用油之一，被誉为“东方橄榄油”。同时，油茶副产物还是生产肥料、农药、栲胶的优质原料。油茶主要分布于我国长江流域以南地区，湖南和江西是油茶主要种植区。目前，中国共有油茶林4531.2万亩，年产茶油20多万吨，平均亩产茶油5.8kg，油茶产业普遍存在着单位面积产量低和经济效益差两大问题。油茶低产低效的重要原因之一就是良种化程度低，品种混乱，大部分油茶林处于野生状态，产量较低，良种苗木短缺不能大面积推广种植。同时，油茶炭疽病Glomerellacingulata(Stonem.)Spauld et Schrenk是油茶的主要病害。在长江流域以南各省的大面积油茶栽培区，以及河南、陕西南部地区发生普遍。病害发生后，引起严重落果、落蕾、枝梢枯死，甚至整株衰亡，严重影响了油茶产业的健康发展。通过组织培养可以快速繁殖油茶脱毒苗，在此基础上通过遗传体系转化而获得抗病植株，在木本油料植物遗传改良方面有广阔的前景。
组织培养是快速繁殖优良植物品种的一条重要途径，具有广阔的商业化前景。关于油茶组织培养的研究较多，张智俊等人利用油茶无性系子叶通过体细胞胚胎发生途径获得了再生植株，李泽等人利用油茶带芽茎段获得再生植株，但以上研究只能在油茶组织培养快繁方面有重要意义，不能应用到油茶遗传体系转化获得转基因植株。植物遗传体系转化最常用的方法是农杆菌介导法侵染植物叶片、下胚轴、叶柄、胚根等器官，而油茶叶片诱导不定芽的诱导率仅为17.86％，目前还不能应用在油茶遗传体系转化方面，油茶转基因至今还未找到合适的外植体。下胚轴是通过合子胚发育而来胚性器官，胚性较强，具有很高的活力及分化再生能力，在植物遗传体系转化中有广阔的前景。本发明通过利用油茶下胚轴诱导不定芽，再通过不定芽的继代增殖、生根和炼苗移栽等一系列过程，旨在建立一个高效稳定的油茶下胚轴离体快繁体系，为油茶快速繁殖及工厂化育苗奠定基础。关键还在于能够通过农杆菌浸染实现油茶遗传转化的可能性，为油茶快速繁殖及遗传转化提供更广的途径和技术支撑。
发明内容
本发明的目的是针对目前油茶采用叶盘法获得再生植株技术还未建立，在此基础上，提供了利用油茶下胚轴愈伤组织诱导获得再生植株的方法，该方法利用油茶幼嫩的下胚轴诱导不定芽，其诱导率高，不定芽健壮，不定芽继代增殖系数高，壮苗效果好，生根率高，关键还在于能够通过农杆菌浸染实现油茶遗传转化的可能性。
本发明的目的是通过以下方式实现的。
利用油茶下胚轴获得再生植株的方法
1)诱导不定芽：在无菌条件下切取长为1.0-2.0cm的油茶无菌苗下胚轴轴段，接种到培养基为1/2MS+3.0-5.0mg/L 6-BA+0.05-0.1mg/L IAA+0-0.1mg/L NAA+2.0mg/L GA3诱导不定芽；
2)继代培养：将下胚轴诱导的不定芽切下接种到1/2MS+2.0-3.0mg/L 6-BA+0.05-0.1mg/L IBA+0-1.0mg/L GA3的培养基中进行不定芽的继代培养；
3)壮苗培养：将增殖培养得到的芽转接到WPM+0.5mg/L NAA+3.0-5.0mg/L GA3的培养基中进行壮苗培养；
4)生根培养；
5)炼苗、移栽。
上述方法中诱导不定芽时暗培养2天后，再到光照条件下培养20-25天。
上述方法中继代增殖培养时暗培养3天，再到光照条件下培养20-30天。
上述方法中壮苗培养时暗培养2天，再转到光照条件下培养20-25天。
上述方法中将壮苗培养获得3-4cm的苗接到1/2MS+1.0-2.0mg/L IBA+1.0-2.0mg/LNAA+35g/L珍珠岩的培养基中进行生根培养。
上述方法中生根培养时暗培养5天，再转到光照下培养20天即可生根。
上述方法中培养温度为26±1℃，光照培养时光照强度为2100-2200lx，光照时间12-14h/d；所述方法中用到的培养基均附加蔗糖30g/L,琼脂6g/L,pH调至5.4-5.6。
上述方法中下胚轴诱导不定芽使用的培养基优选为：1/2MS+3.0mg/L 6-BA+0.05-0.1mg/L IAA+0.05mg/L NAA+2.0mg/L GA3；
上述方法中增殖培养使用的培养基优选为：1/2MS+2.0-3.0mg/L 6-BA+0.05mg/LIBA+0-1.0mg/L GA3。
上述方法中炼苗、移栽的具体过程如下：
将生根后的油茶试管苗先在室内进行移栽前炼苗3-5天，然后从培养瓶中取出，附带珍珠岩直接移栽到营养杯中，基质为泥炭土：珍珠岩：黄土＝2:1:1，组培苗移栽后保持湿度80％以上，覆盖薄膜并每天喷水1-2次，两周后即逐步进行正常管理。
上述方法中油茶无菌苗的获得过程如下：
选取成熟的当年生油茶种子，取除种皮，将种仁用自来水冲洗3-5min，然后浸泡10-15h，中间换水2-3次，然后在超净工作台中先用75％的酒精浸泡20-30s无菌水冲洗3-5次，再用0.1％的HgCl2消毒3-6min，用无菌水冲洗5-6次，切掉胚乳的大部分，把附带胚乳的种胚接种在WPM基本培养基中，暗培养2-3天后转到光照条件下培养20-25天即可获得无菌苗；培养温度为26±1℃，光照强度为2100-2200lx，光照时间12-14h/d。
本发明主要过程包括：油茶种胚无菌苗的获得，下胚轴不定芽诱导、继代增殖培养、壮苗培养、生根培养、炼苗及移栽。该方法对油茶下胚轴不定芽诱导率高，出芽数多，继代增殖系数高，壮苗效果好，生根率高；不仅为快速繁殖油茶植株提供了一条新的技术途径，而且为以后通过基因工程的方法改良油茶抗性、培育抗病植株，提高油茶产量及油茶遗传体系的建立打下基础。这为油茶从传统的育种方式向分子育种方向迈进提供了可行性，为以后缓解我国粮油安全方面有着重要意义。
附图说明
图1为本发明油茶下胚轴诱导出不定芽初期的照片；
图2为本发明油茶下胚轴诱导不定芽30天的照片；
图3为本发明油茶不定芽增殖培养的照片；
图4为本发明不定芽增殖培养后期的照片；
图5为本发明油茶不定芽壮苗培养的照片；
图6为本发明油茶不定芽壮苗培养的照片；
图7为本发明油茶不定芽生根培养的照片；
图8为本发明油茶不定芽生根培养的照片；
图9为本发明油茶生根后移栽的组培苗的照片；
图10为本发明油茶移栽后成活的组培苗的照片。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1
依次进行以下操作：
1、选取成熟的当年生油茶种子，取除种皮，将种仁用自来水冲洗3-5min，然后浸泡10-15h，中间换水2-3次，然后在超净工作台中先用75％的酒精浸泡20-30s，无菌水冲洗3-5次，再用0.1％的HgCl2消毒3-5min，用无菌水冲洗5-6次，切掉胚乳的大部分，把附带胚乳的种胚接种在WPM基本培养基中，暗培养2-3天后转到光照条件下培养20-25天即可获得无菌苗；培养温度为26±1℃，光照强度为2100-2200lx，光照时间12-14h/d。
表1不同消毒处理方式对油茶种胚的消毒效果影响
2、选取油茶无菌苗下胚轴，在无菌条件下切成长为1.0-2.0cm的轴段，接种到表2所示的A1-A18培养基配方中进行诱导不定芽，优选培养基为1/2MS+3.0-5.0mg/L 6-BA+0.05-0.1mg/L IAA+0-0.1mg/L NAA+2.0mg/L GA3，暗培养2天后，再到光照条件下培养20-25天，最高诱导率可达83.35％。附加蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH 5.4。培养温度为26±1℃，光照强度为2100-2200lx，光照时间12-14h/d；(见附图1-2)
表2不同激素配比对油茶下胚轴不定芽诱导的效果影响
3、将诱导的不定芽切下接种到表3所示的B1-B12培养基配方中进行不定芽的继代增殖培养，优选1/2MS+2.0-3.0mg/L 6-BA+0.05-0.1mg/L IBA+0-1.0mg/L GA3，暗培养3天，再到光照条件下培养20-30天，附加蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH 5.4-5.8；培养温度为26±1℃，光照强度为2100-2200lx，光照时间12-14h/d；(见附图3-4)
表3不同激素配比对油茶不定芽增殖系数的影响
4、将增殖的不定芽进行壮苗培养，将增殖的芽转接到表4所示的C1-C12培养基配方中进行不定芽的壮苗培养，优选WPM+0.5mg/L NAA+3.0-5.0mg/L GA3，暗培养2天，再转到光照条件下培养20-25天，苗高为3-5cm，叶片数为3-6个。附加蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH 5.5，培养温度为26±1℃，光照强度为2100-2200lx，光照时间12-14h/d；(见附图5-6)
表4不同激素配比对油茶不定芽壮苗的影响
5、待试管苗长到3-4cm时接到表5所示的D1-D10培养基配方中进行不定芽的生根培养，优选1/2MS+1.0-2.0mg/L IBA+1.0-2.0mg/L NAA+35g/L珍珠岩，暗培养5d后转到光照培养下20d后统计最高生根率达89.16％，附加蔗糖20g/L，琼脂(sigma)2.5g/L，pH 5.5。培养温度为26±1℃，光照强度为2100-2200lx，光照时间12-14h/d。(见附图7-8)
表5不同激素配比对油茶不定芽生根的影响
编号 IBA(mg/L) NAA(mg/L) 珍珠岩(g/L) 生根率/％ 生根数/条
D1 0 1.0 35 0 0
D2 0.5 1.0 35 68.20 2.8
D3 1.0 1.0 35 86.28 4.6
D4 2.0 1.0 35 88.02 4.2
D5 0.5 2.0 35 74.26 4.6
D6 1.0 2.0 35 89.16 5.4
D7 2.0 2.0 35 86.35 3.8
D8 0.5 3.0 35 74.22 3.6
D9 1.0 3.0 35 78.26 3.2
D10 2.0 3.0 35 72.14 2.6
6、将生根后的试管苗先在室内进行移栽前炼苗，约3-5天，然后从培养瓶中取出，附带珍珠岩直接移栽到营养杯中，基质为泥炭土：珍珠岩：黄土＝2:1:1，组培苗移栽后保持湿度80％以上，覆盖薄膜并每天喷水1-2次，两周后即可逐步进行正常管理，移栽成活率可达83％以上。(见附图9-10)

Claims (10)

1.利用油茶下胚轴获得再生植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)诱导不定芽：在无菌条件下切取长为1.0-2.0cm的油茶无菌苗下胚轴轴段，接种到培养基为1/2MS+3.0-5.0mg/L 6-BA+0.05-0.1mg/L IAA+0-0.1mg/L NAA+2.0mg/L GA3诱导不定芽；
2)继代培养：将下胚轴诱导的不定芽切下接种到1/2MS+2.0-3.0mg/L 6-BA+0.05-0.1mg/L IBA+0-1.0mg/L GA3的培养基中进行不定芽的继代培养；
3)壮苗培养：将增殖培养得到的芽转接到WPM+0.5mg/L NAA+3.0-5.0mg/L GA3的培养基中进行壮苗培养；
4)生根培养；
5)炼苗、移栽。
2.根据权利要求1所述的利用油茶下胚轴获得再生植株的方法，其特征在于，诱导不定芽时暗培养2天后，再到光照条件下培养20-25天。
3.根据权利要求1所述的利用油茶下胚轴获得再生植株的方法，其特征在于，继代增殖培养时暗培养3天，再到光照条件下培养20-30天。
4.根据权利要求1所述的利用油茶下胚轴获得再生植株的方法，其特征在于，壮苗培养时暗培养2天，再转到光照条件下培养20-25天。
5.根据权利要求1所述的利用油茶下胚轴获得再生植株的方法，其特征在于，将壮苗培养获得3-4cm的苗接到1/2MS+1.0-2.0mg/L IBA+1.0-2.0mg/L NAA+35g/L珍珠岩的培养基中进行生根培养。
6.根据权利要求1所述的利用油茶下胚轴获得再生植株的方法，其特征在于，生根培养时暗培养5天，再转到光照下培养20天即可生根。
7.根据权利要求1-6任一项所述的利用油茶下胚轴获得再生植株的方法，其特征在于，培养温度为26±1℃，光照培养时光照强度为2100-2200lx，光照时间12-14h/d；所述方法中用到的培养基均附加蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH调至5.4-5.6。
8.根据权利要求1所述的利用油茶下胚轴获得再生植株的方法，其特征在于，
下胚轴诱导不定芽使用的培养基为：1/2MS+3.0mg/L 6-BA+0.05-0.1mg/L IAA+0.05mg/LNAA+2.0mg/L GA3；
增殖培养使用的培养基为：1/2MS+2.0-3.0mg/L 6-BA+0.05mg/L IBA+0-1.0mg/L GA3。
9.根据权利要求1所述的利用油茶下胚轴获得再生植株的方法，其特征在于，炼苗、移栽的具体过程如下：
将生根后的油茶试管苗先在室内进行移栽前炼苗3-5天，然后从培养瓶中取出，附带珍珠岩直接移栽到营养杯中，基质为泥炭土：珍珠岩：黄土＝2:1:1，组培苗移栽后保持湿度80％以上，覆盖薄膜并每天喷水1-2次，两周后即逐步进行正常管理。
10.根据权利要求1所述的利用油茶下胚轴获得再生植株的方法，其特征在于，所述的油茶无菌苗的获得过程如下：
选取成熟的当年生油茶种子，取除种皮，将种仁用自来水冲洗3-5min，然后浸泡10-15h，中间换水2-3次，然后在超净工作台中先用75％的酒精浸泡20-30s无菌水冲洗3-5次，再用0.1％的HgCl2消毒3-6min，用无菌水冲洗5-6次，切掉胚乳的大部分，把附带胚乳的种胚接种在WPM基本培养基中，暗培养2-3天后转到光照条件下培养20-25天即可获得无菌苗；培养温度为26±1℃，光照强度为2100-2200lx，光照时间12-14h/d。
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