CN107743870A

CN107743870A - 一种油茶半脱水种胚无菌再生植株的方法

Info

Publication number: CN107743870A
Application number: CN201711176060.9A
Authority: CN
Inventors: 曾艳玲; 杨宇元; 卢梦琪; 范晓明; 何超银; 蔡耀通; 吴旭平
Original assignee: Central South University of Forestry and Technology
Current assignee: Guizhou Camellia Industry Comprehensive Development Co.,Ltd.
Priority date: 2017-11-22
Filing date: 2017-11-22
Publication date: 2018-03-02
Anticipated expiration: 2037-11-22
Also published as: CN107743870B

Abstract

本发明公开了一种油茶半脱水种胚无菌再生植株的方法，属于植物细胞工程领域。采用油茶半脱水种胚为外植体材料，主要通过脱菌前处理、诱导胚状体、胚状体诱导不定芽、增殖培养、壮苗培养、生根培养、炼苗移栽等过程，建立了较为高效的再生体系。本技术方案的外植体选材突破了对油茶种仁新鲜取样的要求，克服了外植体选材的季节性，扩大了油茶再生体系的选材基础，不仅为大量繁殖无病毒优良油茶品种提供了新的选择途径，理论上还可用于农杆菌侵染进行转基因试验，为油茶分子设计育种提供技术支撑。

Description

一种油茶半脱水种胚无菌再生植株的方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种以油茶半脱水种胚为外植体诱导不定芽，继而培育获得完整无菌苗的方法。

背景技术

油茶(Camellia olefera)是山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)常绿灌木或小乔木，是我国南方丘陵红壤地区特色食用油料树种。主要分布于秦岭淮河以南的湖南、江西、广西、浙江、福建、广东等16省市。茶油色香味俱佳，且富含不饱和脂肪酸，具有软化血管，预防心血管疾病的作用。油茶副产物还是生产肥料、饲料、活性炭等产品的优质原料。目前，中国共有油茶林面积6400 万亩，国家林业产业规划2020年前需达到7200万亩以上。因油茶良种苗木供不应求，而且油茶病害比较严重，一旦染病很难去除，影响产量甚至导致植株死亡，这些都制约了油茶产业的发展。

植物组织培养是大量快速繁殖植物的有效途径之一，而且种子是不带病毒的材料，通过种胚组织培养可以达到无菌脱毒的效果。目前关于油茶组织培养的研究较多集中于带芽茎段离体快繁和叶片组织培养，但这些外植体取材有季节限制且有携带隐藏病毒的危险，且从细胞全能性的角度分析这些外植体明显没有种胚增殖能力强。张智俊等人利用油茶无性系萌发膨大的子叶为外植体培养获得了无菌苗，这些方案中的试验材料仍局限于鲜采样。如果果实存放时间较长，会明显增加外植体初代培养染菌率，甚至全部染菌死亡。因此目前关于油茶的组织培养和转基因转化体系研究中存在着诱导增殖率低和外植体取样时间受限等问题，限制了油茶良种苗木的繁育和遗传改良研究.

发明内容：

为解决目前油茶组织培养增殖率低和外植体取样时间限制等问题，本发明提供了一种油茶半脱水种胚无菌再生植株的方法，该方法通过接种前预处理大大降低外植体染菌率，诱导胚状体和不定芽效率高，继代增殖系数高，出苗率高。半脱水种胚没有试验季节与时间限制，扩大了油茶再生试验外植体的选择范围，突破了油茶外植体鲜采样必须即采即做对试验时间的限制，经过不断探索和研究以半脱水种胚为外植体建立了新的油茶再生植株的体系。

本发明的目的是通过以下方式实现的。

油茶半脱水种胚无菌再生植株的方法，包括以下步骤：

1)诱导胚状体：在无菌条件下将已经脱菌前处理的油茶半脱水种胚切除种皮和部分子叶，将与胚相连的部分子叶接种到胚状体诱导培养基中诱导胚状体，胚状体诱导培养基为：WPM+1.0-1.5mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA；

2)胚状体诱导不定芽：将诱导胚状体得到的胚状体转接到不定芽诱导增殖培养基中进行不定芽诱导增殖，不定芽诱导增殖培养基为：MS+1.0-3.0mg/L 6-BA+1.0-3.0mg/LIBA；

3)壮苗培养：将不定芽诱导增殖得到的芽转接到壮苗培养基中进行壮苗培养，壮苗培养基为：MS+0.5mg/L NAA；

4)生根培养：将壮苗培养后的芽转接到生根培养基中进行生根培养，生根培养基为：1/2MS+0.5mg/L NAA；

5)炼苗、移栽。

本发明通过对油茶存放时间较长的半脱水种胚预处理脱菌，再通过胚状体诱导、不定芽诱导、壮苗培养、生根培养和炼苗移栽等一系列操作，旨在建立一个不局限取样时间的油茶半脱水种胚无菌再生植株的体系。本发明方法采用现有技术中尚未进行过研究的半脱水种胚作为再生体系的材料，经过试验设计确立了合适的胚状体诱导培养基配方、不定芽诱导培养基配方、壮苗培养基配方和生根培养基配方，达到了胚状体诱导率高、出芽多的技术效果。解决了外植体取材季节性限制的技术问题，增加了新的油茶外植体选择范围，为获得优良无病毒油茶种苗提供了新的途径，对油茶产业的发展具有很好的实用价值和经济价值。

优选的，上述方法中脱菌前处理采取如下步骤：取油茶半脱水种胚，于超净工作台用无菌水清洗2～3次后，用70％的酒精浸泡5min，无菌水清洗3～5次，再用0.1％升汞浸泡除菌15min，期间每隔4min摇匀1min，用无菌水冲洗4～6 次，然后将处理好的油茶半脱水种胚置于已灭菌浸润MS液体培养基的脱脂棉上，全封闭无菌吸胀10-12天。本方案中通过多次试验确定的脱菌前处理步骤可以大大降低非新鲜采样种胚的染菌率，解决了现有技术中油茶果实存放时间较长而导致的外植体初代培养染菌率显著增加，甚至全部染菌死亡的问题。采用本方案的脱菌前处理步骤能够实现将半脱水种胚作为再生体系的外植体材料时，初代培养染菌率接近0％，因此克服了外植体选材的季节性限制的问题，扩大了油茶再生体系的外植体材料选择范围，为高效的油茶良种无性繁育体系奠定了基础。

优选的，上述方法中胚状体诱导培养基为：WPM+1.5mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA。经过试验筛选，油茶半脱水种胚在此优选配方的培养基中胚状体诱导率高且诱导时间相对较短，为后续的不定芽诱导提供了试验基础。

优选的，上述方法中油茶半脱水种胚接种于胚状体诱导培养基后，直接置于光照条件先培养50-60天，期间继代1次。经过试验筛选，发现接种后直接光照条件培养，胚状体诱导率更高。

优选的，上述方法中不定芽诱导增殖培养基为：MS+3.0mg/L 6-BA+2.0mg/L IBA。经过试验筛选，油茶胚状体在此优选的不定芽诱导增殖培养基中所得到的不定芽芽多，增殖快，植株高度较矮且较为健壮。

优选的，上述方法中油茶胚状体接种于不定芽诱导培养基后，直接置于光照条件下培养30-35天。

优选的，上述方法中壮苗培养时，接种后直接置于光照条件先培养20-30 天，生根培养时先暗培养7天，再转至光照培养20-25天能够生根。经过试验筛选发现生根培养时先暗培养7天再进行光照培养，生根率高。

优选的，上述方法中炼苗和移栽过程具体如下：将生根后的油茶无菌苗先在遮阳网下进行移栽前炼苗3-5天，然后从培养瓶中取出，清洗根部培养基后移栽至营养钵中，基质为泥炭土：黄土：珍珠岩＝5：4：1，组培苗移栽后用底部开口的一次性透明塑料杯倒扣保湿至展新叶，每隔5-7天钵底覆水至基质吸透水 1次，展新叶后进行正常管理。经过筛选发现采用此优选的基质配方，油茶组培苗生长健壮、成活率高。

优选的，上述方法中油茶半脱水种胚的获得过程如下：当年采收成熟油茶果实，室内通风处摊晾至果皮裂开，种子自然散落后，相同条件下再放置15-20 天至种仁与种皮分离，去除种皮获取种仁，内种皮褶皱，采用称重法测量种仁含水率为鲜种仁含水率的50％。此法获得的半脱水种胚能直接用于培育无菌再生植株，也可以用自封袋冷藏保存备用，待需要时再取出回复至自然室温下用于无菌再生试验。

优选的，上述方法中培养温度为25±2℃，光照强度为2000lx，光照时间 12h/d，方法中除脱菌前处理和生根培养中使用的培养基外其余培养基均附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH值5.6-5.8；生根培养基中附加蔗糖20g/L。

前述培养基中所使用到的外源激素全称为6-苄基氨基嘌呤 (6-Benzylaminopurine,6-BA)、a-萘乙酸(a-Naphthalene acetic acid,NAA)、吲哚丁酸(Indole-3-Butytric acid,IBA)。

附图说明

图1为本发明油茶半脱水种胚预处理脱菌的照片；

图2为本发明油茶胚胚状体的照片；

图3为本发明油茶胚状体出芽的照片；

图4为本发明油茶不定芽增殖的照片；

图5为本发明油茶不定芽壮苗的照片；

图6为本发明油茶不定芽生根的照片；

图7为本发明油茶组培苗移栽后的照片；

图8为本发明油茶组培苗移栽后展开新叶的照片。

具体实施方式

以下结合实施例具体阐述本发明申请的具体方案，所有实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1

一种油茶半脱水种胚无菌再生植株的方法，步骤如下：

1、获取油茶种胚

于2016年10月份，选取湖南省长沙市望城县东城镇油茶基地的‘华硕’ 油茶(Camellia olefera)当年成熟的果实，室内通风处摊晾至果皮裂开，种子自然散落后，相同条件下再放置15-20天至种仁与种皮分离，去除种皮可轻松获取种仁，内种皮褶皱，通过称重法检测含水率。首先，挑选无病菌虫害且大小和重量基本相同(15±0.5g)的油茶果实400颗，选择100颗新鲜采摘后的油茶果实剥出种仁作为对照组，测量种仁平均鲜重(6.71g)；其余的油茶果实分成数量均为100颗的三组，分别风干若干时间后，再取出种仁测量干重。鲜重与干重之间的重量差为种胚蒸发的水量，含水率＝[1-(鲜重-干重)/鲜重]×100％。

为探索不同含水率的种胚对后续试验的影响，设计20％、50％和80％三种不同含水率的种胚的进行再生体系的建立试验。从下表1中的对比可发现，含水率80％的种胚保存时易遭病虫害和霉变；含水率20％的种胚脱菌前处理时的吸胀时间显著长于含水率50％的种胚，且后期胚状体诱导率显著低于含水率50％的种胚。经过试验对比发现，油茶种胚50％的含水率便于储存，脱菌前处理时间适中，后期胚状体诱导率较为理想。因此后续在各个阶段进行优选培养基筛选时，均针对50％含水率的油茶种胚进行。为方便阅读，以下将含水率50％的种胚简称为半脱水种胚。

表1不同含水率油茶种仁的对比表

2、脱菌前处理：

取完整的半脱水油茶种子，去除种壳后获得种仁，然后分别采用如表2的方法处理种胚。脱菌前处理需要解决的两个问题是：①种胚进行后续胚状体的诱导前，需达到无菌状态；②种胚必须吸收足够水分和养分以满足后续胚状体和不定芽诱导所需。

表2不同处理方式对油茶半脱水种胚的除菌效果影响

从上述表2中6个试验方案的处理结果可以看出：

方案c1和c2采取的无菌水浸泡后再进行70％酒精处理和升汞处理，这种处理方案下的污染率很高(达到96％以上)；这说明非新鲜种胚采取现有技术中的常规脱菌前处理，效果不好，污染率很高。方案b1和b2中采取的是无菌水清洗、70％的酒精浸泡处理、再用升汞浸泡除菌，然后去除种皮接种至培养基上，意图先将种胚脱菌再接种到培养基上进行水分和营养吸收；试验结果显示污染率为80％左右。方案a1和a2中，采用无菌水清洗后依次用70％的酒精浸泡和升汞浸泡除菌，然后将处理好的油茶半脱水种胚置于已灭菌浸润MS液体培养基的脱脂棉上吸胀后，去除种皮接种至培养基上，污染率可以控制在30％以下。对比上述试验方案的结果，可以看出，对半脱水的种胚先进行脱菌处理，然后再置于浸润MS液体培养基的无菌脱脂棉进行水分的吸收污染率最低；且置于浸润MS 液体培养基的无菌脱脂棉比直接置于培养基上进行水分吸收的吸胀效果更好，更有利于后续的胚状体诱导。

为进一步获得污染率更低的试验方案，针对a1和a2方案中无菌水清洗2-3 次之后的步骤，进行如表3所示的试验研究。

表3不同处理时间对污染率及褐化率的影响

从上述表3中10个试验方案的处理结果可以看出：无菌水清洗2～3次，每次摇动1min，用70％的酒精浸泡5min，无菌水清洗3～5次，再用0.1％升汞(HgCl₂) 浸泡除菌15min，期间每隔4-5min摇匀1min，用无菌水冲洗4～6次，然后将处理好的油茶半脱水种胚置于已灭菌浸润MS液体培养基的脱脂棉上全封闭无菌吸胀6-12天的脱菌前处理方式，所获得的半脱水种胚的污染率在3％以下，褐化率在34％以下。其中A9和A10方案，油茶半脱水种胚吸胀10-12天，其污染率最低，且结合后续试验发现，相对于全封闭无菌吸胀6-8天的种胚，其诱导胚状体率更高(参见附图1)。这可能是因为半脱水的种胚需要吸收足够的水分和养分才可保证后续细胞分裂和分化所需。

3、诱导胚状体

前期试验发现，参考现有技术中的步骤，将无菌吸胀处理后的种胚切除种皮和部分子叶，将与胚相连的部分子叶直接接种到不定芽诱导培养基中不能诱导出不定芽。因此对于半脱水的种胚，需要探索合适的条件，将脱菌前处理后的种胚诱导出胚状体，再针对胚状体诱导出不定芽。

设计了表4所示的不同植物激素含量的WPM培养基用于诱导胚状体，将无菌吸胀处理后的种胚切除种皮和部分子叶，将与胚相连的部分子叶依次接种到序号为D1-D9的培养基中，试验发现WPM+1-1.5mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA的培养基其诱导率能达到52.4％左右，其中优选培养基为WPM+1.5mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA，光照培养50-60天可获得胚状体；培养温度25±2℃，光照强度为2000lx，光照12h/d(参见附图2)。通过设计合适的胚状体诱导培养基，对半脱水种胚的部分子叶诱导出胚状体，为后续进行不定芽的诱导提供基础。

表4不同激素配比对油茶半脱水种胚的胚状体诱导的影响

序号	6-BA(mg/L)	NAA(mg/L)	诱导率(％)
				D1	0.5	0.5	13.6
D2	0.5	1.0	16
				D3	0.5	1.5	26.4
D4	1.0	0.5	29.7
				D5	1.0	1.0	48.9
D6	1.0	1.5	33
				D7	1.5	0.5	40.1
D8	1.5	1.0	52.4
				D9	1.5	1.5	31.1

4、诱导不定芽

将诱导的胚状体接种至表5所示的E1-E9培养基配方中进行不定芽的诱导增殖，均附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.6。培养温度25±2℃，光照强度为2000lx，光照时间12h/d。试验发现MS+3.0mg/L 6-BA+2.0-3.0mg/L IBA 的培养基所获得的芽多且增殖快，其中优选培养基为MS+1.0-3.0mg/L 6-BA +1.0-3.0mg/L IBA获得的芽多增殖快且较为矮壮，接种后直接置于光照条件下培养30-35天，最高增殖系数可达4.32。(参见附图3-4)。

表5不同激素配比对油茶胚状体不定芽诱导增殖系数的影响

序号	培养基配方	增殖系数	生长情况
				E1	MS+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L IBA	3.95	芽小，较高，较细
E2	MS+1.0mg/L 6-BA+2.0mg/L IBA	4.09	芽小，较矮，较粗
				E3	MS+1.0mg/L 6-BA+3.0mg/L IBA	0.71	芽少，较高，有生根
E4	MS+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L IBA	2.38	芽小，较多，芽绿
				E5	MS+2.0mg/L 6-BA+2.0mg/L IBA	3.00	芽小，较多，芽绿
E6	MS+2.0mg/L 6-BA+3.0mg/L IBA	2.72	芽小，较多，较高
				E7	MS+3.0mg/L 6-BA+1.0mg/L IBA	1.30	芽少，畸形多
E8	MS+3.0mg/L 6-BA+2.0mg/L IBA	4.32	芽多，增殖快，较矮
				E9	MS+3.0mg/L 6-BA+3.0mg/L IBA	2.86	芽多，增殖快，较细弱

5、壮苗培养：将诱导的不定芽接种MS+0.5mg/L NAA培养基配方中进行壮苗培养，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.6。培养温度25±2℃，光照强度为2000lx，光照时间12h/d。接种后直接置于光照条件下培养20-30 天，苗高2-4cm，叶片3-6片(参见附图5)。

6、生根培养：前期试验发现，先进行暗培养之后再进行光照培养更有利于诱导生根。设计下表6中的10个不同处理的培养基，将壮苗培养后苗高3-4cm的不定芽接种进行生根培养，所有培养基中均附加蔗糖20g/L，琼脂7g/L，pH5.6。经过试验筛选，发现1/2MS+0.5mg/LNAA培养基配方，接种后先暗培养7天，为最优选的诱导生根培养条件。暗培养后再转至光照培养20-25天可生根，培养温度25±2℃，光照强度为2000lx，光照时间12 h/d(参见附图6)。

表6不同处理对生根率的影响

编号	IBA(mg/L)	NAA(mg/L)	暗培养(天)	生根率(％)
					F1	0	0.5	3	82.5
F2	0	0.5	7	90.7
					F3	0	1.0	3	78.9
F4	0	1.5	7	61
					F5	0	1.5	3	55.8
F6	0.5	0.5	7	71
					F7	0.5	0.5	3	63
F8	0.5	1.0	7	67.3
					F9	0.5	1.5	3	44.9
F10	0.5	1.5	7	52.5

7、炼苗移栽：将生根后的无菌苗先在遮阳网下进行一在前炼苗3-5天，然后从培养瓶中取出，清洗根部培养基后移栽至营养钵中，采用如下表7所示的不同移栽基质配方进行培养，发现油茶小苗在含黄土基质中相比含蛭石的基质中成长得更为矮壮，筛选得到最优选的基质配方为泥炭土：黄土：珍珠岩＝5：4： 1，油茶组培苗的移栽成活率可达85％以上。组培苗移栽后用底部开口的一次性透明塑料杯倒扣保湿至展新叶，每隔5-7天钵底覆水至基质吸透水1次，展新叶后进行正常管理(参见附图7-8)。

表7不同移栽基质配方对油茶组培苗成活率的影响

最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本申请的技术方案而非对其保护范围的限制，尽管参照上述实施例对本申请进行了详细的说明，所述领域的普通技术人员应当理解：本领域技术人员阅读本申请后依然可对申请的具体实施方式进行种种变更、修改或等同替换，但以上变更、修改或等同替换，均在本申请的待授权或待批准之权利要求保护范围之内。

Claims

1.一种油茶半脱水种胚无菌再生植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)诱导胚状体：在无菌条件下将已经完成脱菌前处理的油茶半脱水种胚切除种皮和部分子叶，将与胚相连的部分子叶接种到胚状体诱导培养基中诱导胚状体，所述胚状体诱导培养基为：WPM+1.0-1.5mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA；

2)胚状体诱导不定芽：将诱导胚状体得到的胚状体转接到不定芽诱导增殖培养基中进行不定芽诱导增殖，所述不定芽诱导增殖培养基为：MS+1.0-3.0mg/L 6-BA+1.0-3.0mg/LIBA；

3)壮苗培养：将不定芽诱导增殖得到的芽转接到壮苗培养基中进行壮苗培养，所述壮苗培养基为：MS+0.5mg/L NAA；

4)生根培养：将壮苗培养后的芽转接到生根培养基中进行生根培养，所述生根培养基为：1/2MS+0.5mg/L NAA；

5)炼苗、移栽。

2.根据权利要求1所述的油茶半脱水种胚无菌再生植株的方法，其特征在于，所述脱菌前处理采取如下步骤：取油茶半脱水种胚，于超净工作台用无菌水清洗2～3次后，用70％的酒精浸泡5min，无菌水清洗3～5次，再用0.1％升汞浸泡除菌15min，期间每隔4min摇匀1min，再用无菌水冲洗4～6次，然后将处理好的油茶半脱水种胚置于已灭菌浸润MS液体培养基的脱脂棉上，全封闭无菌吸胀10-12天。

3.根据权利要求2所述的油茶半脱水种胚无菌再生植株的方法，其特征在于，所述胚状体诱导培养基为：WPM+1.5mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA。

4.根据权利要求3所述的油茶半脱水种胚无菌再生植株的方法，其特征在于，诱导胚状体时，接种后直接置于光照条件先培养50-60天，期间继代1次。

5.根据权利要求2所述的油茶半脱水种胚无菌再生植株的方法，其特征在于，所述不定芽诱导增殖培养基为：MS+3.0mg/L 6-BA+2.0mg/L IBA。

6.根据权利要求5所述的油茶半脱水种胚无菌再生植株的方法，其特征在于，胚状体诱导不定芽时，接种后直接置于光照条件先培养30-35天。

7.根据权利要求6所述的油茶半脱水种胚无菌再生植株的方法，其特征在于，壮苗培养时，接种后直接置于光照条件先培养20-30天，生根培养时先暗培养7天，再转至光照培养20-25天能够生根。

8.根据权利要求7所述的油茶半脱水种胚无菌再生植株的方法，其特征在于，所述炼苗和所述移栽过程具体如下：将生根后的油茶无菌苗先在遮阳网下进行移栽前炼苗3-5天，然后从培养瓶中取出，清洗根部培养基后移栽至营养钵中，基质为泥炭土：黄土：珍珠岩＝5：4：1，组培苗移栽后用底部开口的一次性透明塑料杯倒扣保湿至展新叶，每隔5-7天钵底覆水至基质吸透水1次，展新叶后进行正常管理。

9.根据权利要求1-8任一项所述的油茶半脱水种胚无菌再生植株的方法，其特征在于，所述油茶半脱水种胚的获得过程如下：当年采收成熟油茶果实，室内通风处摊晾至果皮裂开，种子自然散落后，相同条件下再放置15-20天至种仁与种皮分离，去除种皮获取种仁，内种皮褶皱，采用称重法测量种仁含水率为鲜种仁含水率的50％。

10.根据权利要求1-8任一项所述的油茶半脱水种胚无菌再生植株的方法，其特征在于，培养温度为25±2℃，光照强度为2000lx，光照时间12h/d，所述方法中除所述脱菌前处理和所述生根培养中使用的培养基外，其余培养基均附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH值5.6-5.8；所述生根培养基中附加蔗糖20g/L。