CN112293252A - 一种檀香石斛的人工高效无性系繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种檀香石斛的人工高效无性系繁殖方法，包括将消毒灭菌处理后的檀香石斛带芽茎段外植体接种于培养基A中培养，在光照度1500‑2000lx，光照时间10h/d，温度控制在25±1℃的条件下进行启动增殖培养，以扩大材料基数，75d后可有2.35左右的增殖系数。将上述材料剪为包含2‑3个节的茎段接入培养基B中培养，60d后可形成多芽的簇生系统，繁殖系数达6.0以上；在该培养基中可同步诱导不定根发生，生根率达100％；生根苗经过炼苗驯化60d后成活率亦达100％。本发明成本低、周期短、试管苗质量和成活率高，为保护野生资源、优质种苗繁育提供了技术支撑，可在短时间内生产基因型背景一致的优良种苗。
Description
技术领域
本发明涉及观赏植物繁殖技术领域，具体为一种檀香石斛的人工高效无性系繁殖方法。
背景技术
檀香石斛(Dendrobium anosmum Lindl.)属春石斛类，花型小巧而鲜艳，花期长且具淡淡的檀香味，分布于越南、马来半岛、泰国等东南亚国家；檀香石斛在石斛兰中极具观赏和商业价值，同是也是育种的重要亲本材料，近年在东南亚地区已成为炙手可热的兰花种类。
檀香石斛其果实为蒴果，种子细小无胚乳，自然条件下极难萌发。与其他已有报道的石斛兰植物类似，檀香石斛种子在人工辅助下进行非同生性萌发并不困难，但生长缓慢，原球茎分化成苗率不高，且幼苗变异极大，存在很大比例的畸形苗，难以进行规模化生产、标准化(基因型背景一致)种植和高品质种苗的大面积推广。因此，需要寻求一种新的成本低、周期短、质量和成活率高，且能将优良性状固定下来的高效人工繁殖方法来扩大檀香石斛种苗的繁殖量，进行其高品质种苗的工厂化生产，以满足市场种植需求。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了一种檀香石斛的人工高效无性系繁殖方法，以解决檀香石斛通常以其种子为繁殖单位，存在萌发率极低，实生苗生长缓慢且生物量较小、后代变异大，并受到萌发季节的限制，难以进行规模化、标准化种植，高品质品种难以大面积推广的问题。
根据本发明的目的，本发明提供如下技术方案：
一种檀香石斛的人工高效无性系繁殖方法，包括将消毒灭菌处理后的带节茎段外植体经启动增殖培养、茎段再生增殖和不定根诱导同步培养、驯化移栽过程，具体包括如下步骤：
步骤1：外植体的获取
选择生长势好、无病虫害、无畸形的健壮植株，取其茎尖下含2-4节茎段；
步骤2：消毒处理
将步骤1的带节茎段进行消毒处理；
步骤3：启动增殖培养
将经过步骤2消毒灭菌好的带节茎段为材料，接入培养基A中，控制光照度、温度、光照时间的条件下进行腋芽萌发诱导；
步骤4：茎段再生增殖和不定根诱导同步培养
在步骤3培养基A中继代增殖2代时，将步骤3中培养的增殖苗转入培养基B中，控制光照度、温度、光照时间的条件下进行再生增殖和不定根诱导培养；
步骤5：
炼苗和移栽。
进一步地，步骤1中所述带节茎段进行消毒处理的方法为：去除叶片流水洗净后，用质量比为15％的洗衣粉溶液浸泡10min，流水冲洗30min后置于超净工作台中；
用体积比75％的乙醇溶液浸泡10-15s，然后用质量比为0.1％的升汞水溶液消毒6min，期间不断摇晃瓶身以达到最佳灭菌效果，最后无菌水冲洗3次，每次不低于3min，置于滤纸上吸干残留无菌水，最终得到消毒灭菌处理的外植体。
进一步地，步骤3中，所述A培养基包括以下原料：
1/3MS培养液
进一步地，所述A培养基的pH值为5.4-5.6。
进一步地，步骤4中，所述B培养基，包括以下原料：
1/3MS培养液
进一步地，所述B培养基的pH值为5.4-5.6。
进一步地，步骤5中炼苗和移栽的方法如下：
取4步骤的生根苗，连培养瓶一起置于室温下炼苗，打开瓶盖，从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入多菌灵溶液中浸泡3-5min后，移栽至经高温蒸煮消毒后的碎松树皮(约1.0×1.0cm)中保温保湿培养，即得移栽苗。
进一步地，步骤3-步骤4中，培养条件：在光照度1500-2000lx，光照时间10h/d，温度控制在25±1℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明一种檀香石斛的人工高效无性系繁殖方法，利用组织培养技术，可进行周年工厂化连续生产，生产效率高，克服了传统繁殖方式效率低、周期长且无法周年进行生产的难点。使所有种苗保持同一基因型背景，易于标准化、工厂化操作，解决了传统种子繁殖后代分离大、性状不稳定而导致的种苗品质不一的难题。
2、本发明一种檀香石斛的人工高效无性系繁殖方法，增殖速度快，增殖系数大，属直接器官发生，基本无变异，且60d为一个培养周期，繁殖系数达6.0以上。由于无愈伤组织出现，试管苗不定根均与茎段有维管束相连，使得试管苗炼苗驯化成活率大大提高，基本可以达100％。
3、本发明一种檀香石斛的人工高效无性系繁殖方法，对檀香石斛快速繁殖体系进行了优化，在同一培养基中，可同时进行增殖与生根，大大简化了培养程序；在启动增殖培养成功后，整个快速体系只需1种培养基就解决了再生增殖与生根的问题，大大缩短了繁殖周期，从通常的12-14个月变为3-5个月，十分利于安排生产计划。
4、本发明一种檀香石斛的人工高效无性系繁殖方法，为保护檀香石斛野生资源和发展人工种植奠定技术基础，同时可将优良性状固定下来，从而提供基因型背景一致的优质种苗以满足大面积推广种植的需求。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对发明的限制。在附图中：
图1为檀香石斛的启动增殖培养图；
图2为檀香石斛茎段再生增殖及生根培养图；
图3为檀香石斛试管苗炼苗移栽图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
如图1、图2和图3所示，一种檀香石斛的人工高效无性系繁殖方法，包括以下步骤：
1、外植体的获取：选择生长势好、无病虫害、无畸形的健壮植株，取其茎尖下茎段，含第2至第3节，用手术刀切割为1.0cm左右长茎段。
2、将步骤1的带节茎段去除叶片流水洗净后，用质量比为15％的洗衣粉溶液浸泡10min，流水冲洗30min后置于超净工作台中；用体积比75％的乙醇溶液浸泡10-15s，然后用质量比为0.1％的升汞水溶液消毒6min，期间不断摇晃瓶身以达到最佳灭菌效果，最后无菌水冲洗3次，每次不低于3min，置于滤纸上吸干残留无菌水。在整个消毒过程中充分摇动器皿。
3、启动培养：将经过步骤2消毒灭菌好的带节茎段为材料，接入下列培养基A中：
1/3MS培养液
培养条件：在光照度1500-2000lx，光照时间10h/d，温度控制在25±1℃的条件下进行启动增殖培养以扩大材料基数；在此培养基中尽管生长较缓慢，但材料基本没有死亡，培养75d后材料均有腋芽萌发、新叶伸展的现象，但增殖系数较低，仅2.0左右。
4、茎段再生增殖和不定根诱导同步培养：在步骤3培养基A中继代增殖2代、材料基数足够时，将步骤3中培养的增殖苗去除茎尖后切割为1.0cm长、具2个节转接至转入下列培养基B中：
1/3MS培养液
培养条件：在光照度1500-2000lx，光照时间10h/d，温度控制在25±1℃的条件下，培养培养10d后，随着不定根的出现，节上腋芽随即萌发；20d后，不定根与腋芽迅速生长，茎段上每个节均有腋芽萌发；40d后，每个材料腋芽萌发，生长正常，无畸形芽出现，同时不定根多而粗壮；50-60d时，根生长速度明显增强，而腋芽生长逐渐减慢；此时，增殖系数达6.0以上，生根率则100％。
5、炼苗和移栽：取步骤4长至4-5cm高的生根苗，连培养瓶一起置于室温下炼苗3d后，打开瓶盖，从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入多菌灵溶液中浸泡3min后，移栽至经高温蒸煮消毒后(至少12小时)的碎松树皮(约1.0×1.0cm)中保温保湿培养，即得移栽苗，成活率100％。
实施例2
如图1、图2和图3所示，一种檀香石斛的人工高效无性系繁殖方法，包括以下步骤：
1、外植体的获取：选择生长势好、无病虫害、无畸形的健壮植株，取其茎尖下茎段，含第2至第4节，用手术刀切割为1.5cm左右长茎段。
2、将步骤1的带节茎段去除叶片流水洗净后，用质量比为15％的洗衣粉溶液浸泡10min，流水冲洗30min后置于超净工作台中；用体积比75％的乙醇溶液浸泡10-15s，然后用质量比为0.1％的升汞水溶液消毒6min，期间不断摇晃瓶身以达到最佳灭菌效果，最后无菌水冲洗3次，每次不低于3min，置于滤纸上吸干残留无菌水。在整个消毒过程中充分摇动器皿。
3、启动培养：将经过步骤2消毒灭菌好的带节茎段为材料，接入下列培养基A中：
1/3MS培养液
培养条件：在光照度1500-2000lx，光照时间10h/d，温度控制在25±1℃的条件下进行启动增殖培养以扩大材料基数；在此培养基中尽管生长较缓慢，但材料基本没有死亡，培养75d后材料均有腋芽萌发、新叶伸展的现象，但增殖系数较低，仅2.0左右。
4、茎段再生增殖和不定根诱导同步培养：在步骤3培养基A中继代增殖2代、材料基数足够时，将步骤3中培养的增殖苗去除茎尖后切割为1.5cm长、具3个节转接至转入下列培养基B中：
1/3MS培养液
培养条件：在光照度1500-2000lx，光照时间10h/d，温度控制在25±1℃的条件下，培养培养10d后，随着不定根的出现，节上腋芽随即萌发；20d后，不定根与腋芽迅速生长，茎段上每个节均有腋芽萌发；40d后，每个材料腋芽萌发，生长正常，无畸形芽出现，同时不定根多而粗壮；50-60d时，根生长速度明显增强，而腋芽生长逐渐减慢；此时，增殖系数达6.0以上，生根率则100％。
5、炼苗和移栽：取步骤4长至5-6cm高的生根苗，连培养瓶一起置于室温下炼苗3d后，打开瓶盖，从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入多菌灵溶液中浸泡4min后，移栽至经高温蒸煮消毒后(至少12小时)的碎松树皮(约1.0×1.0cm)中保温保湿培养，即得移栽苗，成活率100％。
实施例3
如图1、图2和图3所示，一种檀香石斛的人工高效无性系繁殖方法，包括以下步骤：
1、外植体的获取：选择生长势好、无病虫害、无畸形的健壮植株，取其茎尖下茎段，含第2至第5节，用手术刀切割为2.0cm左右长茎段。
2、将步骤1的带节茎段去除叶片流水洗净后，用质量比为15％的洗衣粉溶液浸泡10min，流水冲洗30min后置于超净工作台中；用体积比75％的乙醇溶液浸泡10-15s，然后用质量比为0.1％的升汞水溶液消毒6min，期间不断摇晃瓶身以达到最佳灭菌效果，最后无菌水冲洗3次，每次不低于3min，置于滤纸上吸干残留无菌水。在整个消毒过程中充分摇动器皿。
3、启动培养：将经过步骤2消毒灭菌好的带节茎段为材料，接入下列培养基A中：
1/3MS培养液
培养条件：在光照度1500-2000lx，光照时间10h/d，温度控制在25±1℃的条件下进行启动增殖培养以扩大材料基数；在此培养基中尽管生长较缓慢，但材料基本没有死亡，培养75d后材料均有腋芽萌发、新叶伸展的现象，但增殖系数较低，仅2.0左右。
4、茎段再生增殖和不定根诱导同步培养：在步骤3培养基A中继代增殖2代、材料基数足够时，将步骤3中培养的增殖苗去除茎尖后切割为2.0cm长、具4个节转接至转入下列培养基B中：
1/3MS培养液
培养条件：在光照度1500-2000lx，光照时间10h/d，温度控制在25±1℃的条件下，培养培养10d后，随着不定根的出现，节上腋芽随即萌发；20d后，不定根与腋芽迅速生长，茎段上每个节均有腋芽萌发；40d后，每个材料腋芽萌发，生长正常，无畸形芽出现，同时不定根多而粗壮；50-60d时，根生长速度明显增强，而腋芽生长逐渐减慢；此时，增殖系数达6.0以上，生根率则100％。
5、炼苗和移栽：取步骤4长至5-6cm高的生根苗，连培养瓶一起置于室温下炼苗3d后，打开瓶盖，从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入多菌灵溶液中浸泡5min后，移栽至经高温蒸煮消毒后(至少12小时)的碎松树皮(约1.0×1.0cm)中保温保湿培养，即得移栽苗，成活率100％。
上述实施例中，图1中：A为接种15d后，节处腋芽开始萌发；B为接种45d后腋芽迅速生长图；C为接种75d后茎段再生图。
图2中：A为培养10d后出现不定根后，腋芽开始萌发图；B、C为20d后的生长情况图；D为2个腋芽生长图；E为3个腋芽生长图；F为4个腋芽生长图；G为50d后芽生长速度减慢，而根生长速度明显增强图；H为60d后，芽和不定根的生长情况图。
图3中：A为移栽30d后的再生苗图；B为移栽60d后的试管苗图；C开花试管苗图。
上述实施例中，采用的技术原理说明如下：
1、外植体选用茎段，保证了其优质基因型的稳定性，解决了通过种子非共生性萌发存在基因型参差不齐的问题。
2、本发明在野生材料有限的情况下，首先采用启动培养，诱导腋芽萌发的方式对檀香石斛进行初步增殖，解决了起始培养进材料严重不足的问题。
3、本发明在启动培养以后，在同一培养基中，可同时进行茎段再生增殖和不定根诱导，简化了培养程序；整个快速繁殖过程只需1种培养基就解决了从增殖到生根的过程，大大缩短了育苗周期。
4、本发明增殖和过程中，无愈伤组织产生，不定根与试管苗维管束直接相连，达到了试管苗移栽的高成活率目标。
5、本发明提供的檀香石斛人工高效无性系繁殖方法成本低、时间短、质量和成活率高，且能将优良性状固定下来；该方法可扩大檀香石斛种苗的繁殖量，进行高品质种苗的工厂化生产，以满足种植需求。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种檀香石斛的人工高效无性系繁殖方法，其特征在于，包括将消毒灭菌处理后的带节茎段外植体经启动增殖培养、茎段再生增殖和不定根诱导同步培养、驯化移栽过程，具体包括如下步骤：
步骤1：外植体的获取
选择生长势好、无病虫害、无畸形的健壮植株，取其茎尖下含2-4节茎段；
步骤2：消毒处理
将步骤1的带节茎段进行消毒处理；
步骤3：启动增殖培养
将经过步骤2消毒灭菌好的带节茎段为材料，接入培养基A中，控制光照度、温度、光照时间的条件下进行腋芽萌发诱导；
步骤4：茎段再生增殖和不定根诱导同步培养
在步骤3培养基A中继代增殖2代时，将步骤3中培养的增殖苗转入培养基B中，控制光照度、温度、光照时间的条件下进行再生增殖和不定根诱导培养；
步骤5：
炼苗和移栽。
2.根据权利要求1所述的一种檀香石斛的人工高效无性系繁殖方法，其特征在于，步骤1中所述带节茎段进行消毒处理的方法为：去除叶片流水洗净后，用质量比为15％的洗衣粉溶液浸泡10min，流水冲洗30min后置于超净工作台中；
用体积比75％的乙醇溶液浸泡10-15s，然后用质量比为0.1％的升汞水溶液消毒6min，期间不断摇晃瓶身以达到最佳灭菌效果，最后无菌水冲洗3次，每次不低于3min，置于滤纸上吸干残留无菌水，最终得到消毒灭菌处理的外植体。
3.根据权利要求1所述的一种檀香石斛的人工高效无性系繁殖方法，其特征在于，步骤3中，所述A培养基包括以下原料：
4.根据权利要求1所述的一种檀香石斛的人工高效无性系繁殖方法，其特征在于，所述A培养基的pH值为5.4-5.6。
5.根据权利要求1所述的一种檀香石斛的人工高效无性系繁殖方法，其特征在于，步骤4中，所述B培养基，包括以下原料：
6.根据权利要求1所述的一种檀香石斛的人工高效无性系繁殖方法，其特征在于，所述B培养基的pH值为5.4-5.6。
7.根据权利要求1所述的一种檀香石斛的人工高效无性系繁殖方法，其特征在于，步骤5中炼苗和移栽的方法如下：
取4步骤的生根苗，连培养瓶一起置于室温下炼苗，打开瓶盖，从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入多菌灵溶液中浸泡3-5min后，移栽至经高温蒸煮消毒后的碎松树皮(约1.0×1.0cm)中保温保湿培养，即得移栽苗。
8.根据权利要求1所述的一种檀香石斛的人工高效无性系繁殖方法，其特征在于，步骤3-步骤4中，培养条件：在光照度1500-2000lx，光照时间10h/d，温度控制在25±1℃。
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