CN112616671B - 一种获得工业大麻单性植株组培苗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种获得工业大麻单性植株组培苗的方法，(1)外植体的选择与灭菌，取工业大麻种子，先用水冲洗，然后进行消毒处理(2)灭菌后材料的培养，接种完的外植体放置于培养间，先暗培养再进行正常培养，直至长出新芽，每个种子发出来的新芽作为单独株系标记，转接到培养基上进行后续培养，至此工业大麻无菌体系建立；(3)单性无菌植株获得，取第2步培养出来的新芽，接种到分化培养基中，分化培养基配方如下：MS+1.0mg·L‑16‑BA+0.3g·L‑1活性炭+25g·L‑1蔗糖+5g·L‑1琼脂粉(琼脂粉凝胶强度为1300g/cm2)，该方法比通过大田观察筛选单性植株的方法时间缩短60％‑80％，大大提高了选择效率。

Description

一种获得工业大麻单性植株组培苗的方法
技术领域
本发明属于植物的人工栽培技术领域，具体涉及一种获得工业大麻单性植株组培苗的方法。
背景技术
工业用途的大麻又称为hemp，属于大麻科大麻属一年生草本植物，植株高大，为雌雄异株。原产于亚洲中部，是人类最早种植的农作物之一，工业大麻浑身是宝，可从农业种植延伸到纺织、服装、造纸、军需、化工、新型建材、生物能源、食品保健、医药、饲料等十几个产业链，现今已经遍布世界各地。
由于工业大麻是雌雄异株植物，因此人工培育的工业大麻品种也为雌雄异株品种，并且雌株与雄株的比例也接近1：1。但是根据已有研究表明，工业大麻雄株纤维产量和品质均优于雌株，因此以收获纤维为目的时，宜多留雄株，而雌株花叶中CBD的含量明显高于雄株，若是想利用CBD，则在种植过程中就需要去掉雄株，因为雌株授粉后其花叶内的CBD含量会降低很多。目前有关工业大麻组织培养的报道相对较少，利用组培技术获得单性种组培苗的方法更是没有相关报道，这在一定程度上制约了工业大麻产业发展，尤其是近期以CBD利用为目的的药用方向的工业大麻，由于使用的是雌性植株，当生产中收到比较大的限制，面对国内数十万亩的栽植需求，研发的能获得工业大麻单性植株的种苗方法在实际生产上具有重要价值。
发明内容
本发明为了克服上述现有技术的不足，提供了一种获得工业大麻单性植株组培苗的方法，该方法比通过大田观察筛选单性植株的方法时间缩短60％-80％，大大提高了选择效率。
为实现上述发明目的，本发明通过如下技术方案实现：
一种获得工业大麻单性植株组培苗的方法，包括以下步骤：
1.外植体的选择与灭菌
取工业大麻种子，先用水冲洗，然后进行消毒处理：先用无菌水浸泡，待种子露白后取出来，用75％的酒精震荡冲洗，无菌水震荡冲洗，0.1％的氯化汞溶液，滴入2～3滴吐温，震荡冲洗，无菌水震荡冲洗后将种子接种于基质中，待种子发芽后再转接到MS培养基上进行诱导培养；
优选的：取籽粒饱满的种子，先用流水冲洗1小时，洗净后进行消毒处理。
优选的：具体的消毒步骤是：先用无菌水浸泡24-48小时；待种子露白后取出来，用75％的酒精震荡冲洗15～30s，无菌水震荡冲洗2～5min，0.1％的氯化汞溶液，滴入2～3滴吐温，震荡冲洗10～15min；无菌水震荡冲洗3～5min；重复无菌水冲洗7次。
优选的：所述灭菌基质体积配比为草炭：珍珠岩：蛭石＝4：2：1。
2.灭菌后材料的培养
接种完的外植体放置于培养间，先暗培养(优选：所述暗培养的时间为：一周)再进行正常培养，直至长出新芽，每个种子发出来的新芽作为单独株系标记，转接到培养基上进行后续培养，至此工业大麻无菌体系建立；
优选的：所述培养条件如下：温度25℃±1℃，湿度25％-40％，暗培养不需要光照，正常培养时光照强度5000lx-6000lx，光照时间14h-16h。
3.单性无菌植株获得
取第2步培养出来的新芽，接种到分化培养基中，分化培养基配方如下：MS+1.0mg·L-16-BA+0.3g·L-1活性炭+25g·L-1蔗糖+5g·L-1琼脂粉(琼脂粉凝胶强度为1300g/cm2)，将接种后的幼苗放置于培养间培养，3-5个周期后，区分出雌雄植株，选择出需要的株系，进行继代扩繁，从而得到所需的单性株系组培苗。
优选的：所述培养条件：温度25℃±1℃，湿度30％-50％，光照强度6000lx-8000lx，光照时间10-13h。
优选的：每个所述培养周期为：25-30d。
本发明的有益效果如下：
(1)选用灭菌后的基质作为种子发芽环境，大大提高了发芽率。传统方式为将灭菌后的种子播种到培养基上进行发芽，发芽率一般不高于30％，而本发明用灭菌后的基质进行播种，发芽率能达到80％以上。
(2)利用瓶内开花技术，可尽早获得单性种苗，本发明首次明确使用瓶内开花培养技术选择出单性株系，这种获得单性植株的方法，比通过大田观察筛选单性植株的方法时间缩短60％-80％，大大提高了选择效率。
附图说明
图1为工业大麻瓶内催化培养；
图2为工业大麻继代扩繁中的继代苗；
图3为工业大麻在生根培养基培养的生根苗；
图4为工业大麻生根苗在温室驯化的穴盘苗。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中所使用的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例一.工业大麻组织培养育苗方法
第一，外植体消毒获得无菌种子。做法是：1、挑选籽粒饱满的种子，用流水冲洗干净。2、用250ml规格的组培瓶装入四分之三纯净水，用不带透气孔的封口膜扎紧封口，用高压灭菌锅125℃灭菌30min制得无菌水，冷却备用。3、将冲洗干净的种子浸泡到无菌水中，时间24-48小时，注意观察种子露白。4、将放置在超净工作台内的接种器灭菌器打开，手术剪、手术刀、枪状镊等工具插入接种器灭菌器灭菌，将75％的酒精、无菌水等工具放入超净工作台内，将接种间和超净工作台的紫外灯打开，密闭灭菌30min。5、穿戴好无菌服，戴好无菌乳胶手套正坐于超净工作台前，将露白的种子放入超净工作台。6、倒入75％的酒精至四分之三瓶处，震荡冲洗15-30s，然后倒掉酒精。8、倒入无菌水，盖好瓶盖，震荡冲洗2-5min，倒掉无菌水。9、倒入0.1％的氯化汞溶液，滴入两三滴吐温，盖好瓶盖，震荡冲洗10-15min，倒掉溶液。10、将消毒后的茎段倒入装有无菌水的三角瓶中，震荡冲洗3-5min，倒掉无菌水，再转到新无菌水瓶中震荡冲洗2-5min，如此重复此操作7次。
第二，进行接种催芽操作。具体步骤是：1、将灭好菌的工业大麻种子置于灭菌过的空组培瓶中，备用。2、用插在接种器灭菌器中灭完菌的枪状镊夹取不锈钢接种盘用酒精灯烧烤灭菌，每个部位都要烧烤充分，以达到灭菌效果。3、用浸满75％酒精的干净小手绢浸满75％的酒精，擦拭装有灭菌基质的培养瓶(240ml的组培瓶)，整齐的排放在超净工作台的边缘。4、拧开培养瓶，在酒精灯上烧烤瓶口，边烤边均匀旋转瓶口。5、右手握枪状镊夹取种子，左手执培养瓶，使瓶口向内，将种子轻轻插入基质土中，深度1cm左右，每瓶可接种4-6棵，盖好瓶盖，在组培瓶上标明材料名称、消毒时间和日期。
第三，接种完的外植体放置于培养间，先进行一周时间的暗培养，再进行正常培养，条件如下：温度25℃±1℃，湿度25％-40％，暗培养不需要光照，正常培养时光照强度5000lx-6000lx，光照时间14h-16h；瓶苗应排放整齐，瓶间距3-5cm左右即可。
第四，开花培养：种子发芽后，应每天观察培养间种子生长情况及污染情况，待幼芽逐渐长大，高4-6cm，胚叶包叶脱落，长出1-2对功能叶后，便可以进行转瓶，进行瓶内开花培养。具体步骤如下:1、用灭好菌的枪状镊夹取带有幼芽的种苗，用手术剪剪去下端的根系，然后插入到催花培养基中，培养基配方如下：MS+1.0mg·L-16-BA+0.3g·L-1活性炭+25g·L-1蔗糖+5g·L-1琼脂粉(琼脂粉凝胶强度为1300g/cm2)；将接种后的幼苗放置于培养间培养。培养条件：温度25℃±1℃，湿度30％-50％，光照强度6000lx-8000lx，光照时间10-13h，培养周期25-30d。3-5个周期后，即可观察到工业大麻无菌植株在瓶内开花现象，见图1，即可区分出雌雄植株，选择出需要的株系，进行分化扩繁。
第五，分化扩繁阶段。将选择出来的单性株系转接到分化扩繁培养基上进行扩繁，具体步骤如下:1、用灭好菌的枪状镊夹取选择好的植株，用手术剪剪去花蕾和过大的叶片，剪成带芽的小段，然后插入到分化扩繁培养基中，配方如下：DKW+1.0～1.5mg·L-16-BA+0.3～1.0mg·L-1IBA+0.1～0.5mg·L-1ZT+0.1～0.2mg·L-1KT+25g·L-1蔗糖+5g·L-1琼脂粉；2、将接种好的瓶苗放入培养间进行培养，培养条件：温度25℃±1℃，湿度40％-70％，光照强度4000lx-6000lx，光照时间14h-17h，培养周期20-25d。3、每天观察幼苗生长状况，将污染苗及时清除并灭菌；长到25天左右，及时更换新培养基继续培养。4、待有新芽长出幼苗逐渐长高的3cm左右时，可以转接到新的继代培养基中，进行继代培养。所获得的组培苗如图2所示。
第六，生根培养。步骤如下：1、用枪状镊和手术剪将分化培养基中3cm以上健壮的工业大麻幼苗分成单棵，接到生根培养基中。生根培养基如下：DKW+0.1～1.0mg·L-1IBA+0.05～0.5mg·L-1NAA+30g·L-1蔗糖+5g·L-1琼脂粉(琼脂粉凝胶强度为1300g/cm2)+0.3g·L-1活性炭(创造有利生根的黑暗环境)。2、将接种后的幼苗放置于培养间培养，培养条件如下：温度25℃±2℃，湿度40％-70％，光照强度4000lx-6000lx，光照时间14-16h。培养15-25d，便可有根生出。3、每天观察幼苗生根情况，接种于本培养基中的工业大麻幼苗生根率可达到80％以上，平均每颗幼苗生根条数大于3。当80％幼苗根长度大于2cm时，就要进入大棚进行驯化炼苗。生根苗如图3所示。
第七，组培苗的大棚驯化炼苗：1、温室内大环境的控制为：温度控制白天在23-28℃左右，夜间不低于18℃，相对湿度一般在60％-80％。将生根后的瓶苗放置到苗床上适应3-5天，即可洗苗定植。2、定植前的基质准备：基质配比为草炭：珍珠岩：蛭石＝4：2：1，用2‰多菌灵喷均匀后，用不漏气的塑料膜盖住，放太阳下暴晒10-15d进行基质消毒。消毒好的基质装入32孔穴盘中，定植前浇透水后，放置到基质达到半干半湿待用。3、洗苗：洗苗时注意不要伤到根系，洗好的苗用1000倍的多菌灵消毒3-5min，放在带水的小盆里准备定植。4、定植：定植时注意不要窝根和定植过深以免埋心。边定植后边喷水，定植后要及时浇透定根水，然后搭小拱棚，覆盖非常薄的塑料薄膜，在上覆盖遮荫网。5、定植后的管理：温室内大环境的温度控制在23-28℃，相对湿度在70％-90％。定植后当天用0.5‰的多菌灵进行杀菌，小拱棚内相对湿度控制在不低于90％，光强控制在5000lx左右；第3-6天，光强升高光强到6000-8000lx，相对湿度在85％-90％之间；第7-10天，增加光强至8000-10000lx，相对湿度控制在80％左右；第10-12天，相对湿度控制在70％-75％，光强控制在10000-12000lx左右；第13-15天，相对湿度在70％左右，光强12000-15000lx；第15天以后，进入温室常规管理模式，穴盘炼苗成活率90％以上。如图4所示。6、病虫害防治：驯化炼苗过程中病虫害的防治，以防为主，可定期随喷施叶面肥时，加入多菌灵/百菌清和氯氰菊酯/灭幼脲进行预防，并注意观察，一旦发现病虫害及时对症下药；除常规病虫害外，需特别注意根蛆和蝇虫的防治，注意挂黄板进行物理预防。

Claims (1)

1.一种获得工业大麻单性植株组培苗的方法，其特征是：包括以下步骤：
（1）外植体的选择与灭菌
取大麻种子，先用水冲洗，然后进行消毒处理：先用无菌水浸泡，待种子露白后取出来，用75%的酒精震荡冲洗，无菌水震荡冲洗，0.1%的氯化汞溶液，滴入2~3滴吐温，震荡冲洗，无菌水震荡冲洗后将种子接种于灭菌的基质中，待种子发芽后再转接到MS培养基上进行诱导培养；
（2）灭菌后材料的培养
接种完的外植体放置于培养间，先进行一周时间的暗培养，再进行正常培养，条件如下：温度25℃±1℃，湿度25%-40%，暗培养不需要光照，正常培养时光照强度5000lx-6000lx，光照时间14h-16h；瓶苗应排放整齐，瓶间距3-5cm；
开花培养：种子发芽后，待幼芽高4-6cm，胚叶包叶脱落，长出1-2对功能叶后，进行转瓶，进行瓶内开花培养；具体步骤如下:用灭好菌的枪状镊夹取带有幼芽的种苗，用手术剪剪去下端的根系，然后插入到催花培养基中，培养基配方如下：MS+1.0mg·L-16-BA+0.3g·L-1活性炭+25g·L-1蔗糖+5 g·L-1琼脂粉，琼脂粉凝胶强度为1300g/cm2；将接种后的幼苗放置于培养间培养；培养条件：温度25℃±1℃，湿度30%-50%，光照强度6000lx-8000lx，光照时间10-13h，培养周期25-30 d；3-5个周期后，选择出需要的株系，进行分化扩繁；
分化扩繁阶段
将选择出来的单性株系转接到分化扩繁培养基上进行扩繁，具体步骤如下:用灭好菌的枪状镊夹取选择好的植株，用手术剪剪去花蕾和过大的叶片，剪成带芽的小段，然后插入到分化扩繁培养基中，配方如下：DKW+1.0~1.5mg·L-16-BA+0.3~1.0mg·L-1IBA+0.1~0.5mg·L-1ZT+0.1~0.2mg·L-1KT+25g·L-1蔗糖+5g·L-1琼脂粉；将接种好的瓶苗放入培养间进行培养，培养条件：温度25℃±1℃，湿度40%-70%，光照强度4000lx-6000lx，光照时间14h-17h，培养周期20-25 d；每天观察幼苗生长状况，将污染苗及时清除并灭菌；长到25天，及时更换新培养基继续培养；待有新芽长出幼苗逐渐长高的3cm时，进行继代培养；
生根培养
步骤如下：用枪状镊和手术剪将分化培养基中3cm以上健壮的大麻幼苗分成单棵，接到生根培养基中，生根培养基如下：DKW +0.1~1.0 mg·L-1IBA+0.05~0.5 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+5g·L-1琼脂粉，琼脂粉凝胶强度为1300g/cm2+0.3g·L-1活性炭；将接种后的幼苗放置于培养间培养，培养条件如下：温度25℃±2℃，湿度40%-70%，光照强度4000lx-6000lx，光照时间14-16h，培养15-25d，便可有根生出。
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