CN115281081B - 一种微型试管脱毒种姜的繁育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生姜微型试管脱毒种姜的繁育方法，包括下述步骤：1）生姜种姜脱毒处理；2）茎尖脱毒；3）诱导生姜芽点分化；4）微型试管种姜的繁育等步骤。该方法应用无植物激素诱导的配方使生姜在组培瓶内形成生姜微型试管种姜，组培生产周期短、效率高，可缩短生姜组培苗的田间制种周期，简化传统组培苗移栽的驯化流程，大大提高生姜组培苗的驯化成活率，提升生姜脱毒种苗繁育数量与质量。

Description

一种微型试管脱毒种姜的繁育方法

技术领域

本发明属于植物育种领域，具个涉及生姜种姜繁育，更具体涉及生姜微型试管脱毒种姜的繁育方法。

背景技术

生姜属姜科姜属多年生宿根植物，营养丰富，是药、食、加工等多用途经济作物，是我国重要的外贸产品。生姜在生产上长期采用无性繁殖，重茬种植，易感染多种病毒，使姜体内积累多种病毒，从而导致生姜产量下降、品质降低，种性退化，严重制约了生姜的生产发展。国内外目前尚无高抗病毒的生姜品种和高效杀病毒药剂，因此亟需通过组织培养手段对现有优良品种进行脱毒和复壮，提高品种自身抗逆性和增产潜力。

运用推广脱毒生姜组培苗可恢复生姜品种本身的生理功能和生产特性，防止生姜因病毒的不断侵染和积累引起的品种退化，使之达到优良品种本身的商品质量和产量。但目前生姜的组培脱毒技术还停留在生产传统的生根组培苗上，繁殖效率不高，通常只能继代6-8次，继代多次后生姜组培苗的品质变差，大规模生产受到限制，且应用生姜生根组培苗进行驯化移栽的成活率较低，产量也较低。摸索一套可直接应用于大规模工厂化育苗生姜组培技术，加速生姜脱毒种姜生产系统的推广应用。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，建立了一套可直接应用于大规模工厂化生产的一种生姜微型试管脱毒种姜的繁育方法，该方法应用无植物激素诱导的配方使生姜在组培瓶内形成生姜种姜（块茎），可简化传统组培苗移栽的驯化流程，大大提高生姜组培苗的驯化成活率，提高生姜脱毒种苗繁育数量与质量。

本发明提供的技术方案是：一种生姜微型试管脱毒种姜的繁育方法，该方法包括下述步骤：

1）生姜种姜脱毒处理：在人工光照培养箱内，设置温度为36-42℃，湿度为60-80%，黑暗下催芽2-3周，待新芽长至1cm-2cm时，取出待用；

2）茎尖脱毒

外植体灭菌后，剥取茎尖：将完成消毒灭菌操作的生姜芽段吸干水分，剥取带一个叶原基的茎尖；

3）诱导生姜芽点分化

将生姜芽点迅速接入诱导培养基A中进行培养，培养到芽点转绿，继续培养至成苗，苗高3-5cm，并分化至3-5个芽点，其中培养基A配方为：在MS培养基的基础上，加入激素NAA 0.4-0.6 mg/L、6-BA 1.0-3.0mg/L、糖25-35g/L和5-6g/L琼脂；

4）微型试管种姜的繁育

整株取出接入培养基B中进行培养；其中，培养基B以MS培养基的基础上，添加椰肉，白砂糖和琼脂，优选地，添加椰肉30-80g/L，白砂糖50-90 g/L和5-6 g/L琼脂；

切取从生芽转入培养基C中进行培养；其中，培养基C 在MS培养基的基础上，添加白砂糖和琼脂，优选地，添加白砂糖50-90 g/L和5-6 g/L琼脂。

进一步地，所述的繁育方法还包括下述步骤：

5) 炼苗：移栽前一周，将生姜组培苗放置与温室大棚内，接受自然光照，在移栽前2天，将组培瓶盖打开，喷少量清水。

更进一步地，所述的繁育方法，还包括下述步骤：

6）移栽：将炼苗后的生姜组培苗去除琼脂，清洗干净，进行蘸根处理，优选地蘸根剂使用代森锰锌或者多菌灵稀释1000倍，待根系稍微晾干之后移栽至准备好的基质中。

上述的繁育方法，所述移栽是在每年3-4月进行移栽，种植株行距为8*10cm；进一步地，在移栽后半个月后，适当补充大量元素水溶肥。

上述的繁育方法，所述外植体灭菌的具体操作如下：选取粗壮的芽切下，用清洁剂冲洗，转入超净工作台，将芽段用75%酒精清洗，无菌水冲洗，再用0.1%HgCl溶液浸泡8-10min，期间一直摇晃，最后用无菌水冲洗5-6次。

上述的繁育方法，优选地，所述培养基A配方为：在MS培养基的基础上，加入激素NAA 0.5mg/L、6-BA 2.0mg/L、糖30g/L和5.5g/L琼脂。

上述的繁育方法，所述培养基B以MS培养基的基础上，添加椰肉60g/L，白砂糖60g/L和5.5 g/L琼脂。

上述的繁育方法，所述培养基C 在MS培养基的基础上，添加白砂糖60 g/L和5.5g/L琼脂。

上述的繁育方法，步骤2）中，在30-40倍解剖镜剥取带一个大小为0.2mm-0.5mm叶原基的茎尖。

上述的繁育方法，步骤3）中，培养条件为控制温度25℃±2℃，相对湿度30%-50%，光照强度1500lx-3000lx，光照培养时间为16h/d，黑暗培养8h/d。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

1、本发明的生姜微型试管脱毒种姜的繁育方法，其配方采用无激素诱导配方，简化传统培养基复杂配方，仅通过调整培养基中糖的浓度调节生姜组培苗增殖与试管种姜繁育的比例，诱导生姜组培苗产生块茎。使用该配方可使生姜组培苗平均增殖系数达到6，生长周期较短，继代次数高，直接在组培瓶内形成微型试管脱毒种姜（生姜原原种），省略了由试管苗到生姜原原种的田间生产流程，缩短了传统生姜组培苗的田间制种周期。

2、微型试管脱毒种姜繁育的培养基B中添加适量的椰汁，可增加生姜组培苗的继代次数2-3次，组培苗叶片翠绿，平均株高可达13.8cm，达到壮苗的效果，到种苗繁育后期，每增加继代次数1次，都可大大增加了种苗繁育的速度和效率，提高了种苗质量。

3、最后，本发明采用带块茎的生姜组培苗进行驯化移栽，可大大提高生姜组培苗的移栽成活率，解决大规模工厂化繁育生姜脱毒种姜的组培技术难题。

附图说明

图1 生姜微型试管种姜生产流程图。

图2 生姜分化组培苗芽。

图3 生姜继代增殖组培苗。

图4 微型试管种姜（生姜原原种）。

图5 应用微型脱毒种姜生产的生姜原种一代、原种二代和生产种（从左至右）。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

1、生姜微型试管种姜生产流程

选择生姜外植体进行茎尖脱毒，诱导生姜芽点分化，获得生姜分化组培苗；将组培苗进行继代增殖培养，扩大生姜组培苗数量，获得大量的生姜增殖组培苗；在移栽前2-3月，转入培养基C中进行培养，诱导生姜微型试管种姜形成，获得生姜原原种；将生姜原原种进行驯化移栽，收获生姜原种一代；将生姜原种一代进行繁育，收获生姜原种二代；将生姜原种二代进行繁育，收获生姜生产种（生产流程请参见图1）。

2、生姜种姜的选择与脱毒处理

选材：选取外观健壮饱满、外皮光亮、肉质新鲜、无腐无病害的姜块。

种姜催芽（高温脱毒）：在人工光照培养箱内，设置温度为40℃，湿度为70%，黑暗下催芽，约2-3周（本实施例中为2.5周），待新芽长至1.5cm时，取出待用。高温可使病毒钝化失活。

3、 茎尖脱毒

外植体灭菌：待种姜芽点萌发至2cm左右时，选取粗壮的芽，用解剖刀切下，放入器皿中用洗衣粉等清洁剂冲洗20 min，转入超净工作台进行操作，将芽段放入灭菌后的烧杯内，用75%酒精清洗30s，无菌水冲洗1次，根据外植体形态及大小，用0.1%HgCl溶液浸泡8-10min，期间一直摇晃，最后用无菌水冲洗5-6次。

剥取茎尖：将完成消毒灭菌操作的生姜芽段放在无菌滤纸上吸干水分，在30-40倍解剖镜下用无菌的解剖刀、解剖针剥取带一个叶原基的茎尖（大小约0.4mm），将生长点迅速按无菌操作程序接入诱导培养基A中。

4、诱导生姜芽点分化

将生姜芽点接入诱导培养基A中进行培养，培养条件为控制温度25℃±2℃，相对湿度30%-50%（本实施例中为40%），光照强度1500lx-3000lx（本实施例中为2200 lx），光照培养时间为16h/d，黑暗培养8h/d。观察接入培养基A中的生姜芽点， 30天后，芽点转绿，60-80天后成苗，苗高3-5cm，并分化至3-5个芽点，获得生姜分化组培苗（见附图2），整株取出接入培养基B中进行培养。

其中，培养基A配方为：在MS培养基的基础上，加入激素NAA 0.5mg/L、6-BA 2.0mg/L、糖30g/L和5.5g/L琼脂。

6-BA（6-苄氨基嘌呤）是一种细胞分裂素，可促进芽的形成，也可诱导愈伤组织发生，是最常用的生长调节物质之一。NAA（萘乙酸）是一种生长素，主要作用是促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根。6-BA与NAA按照一定浓度配比配合使用，可诱导芽的分化或者形成愈伤组织，通过实验筛选最佳比例，具体过程如下：

对6-BA和NAA的配比进行了优化，设置四个不同浓度配比处理，每个处理设计20瓶（20个生姜芽头，长菌污染的除外），培养3个月后，观察统计成活率和分化率，结果见表3。

表1 不同配比培养基对诱导生姜分化生长的影响

结果分析：处理4为最优处理，确定基础诱导分化培养基最佳配方为：MS+6-BA 2.0mg/L +NAA 0.5 mg/L +糖30 g/L +琼脂粉5.5 g/L。

5、微型试管种姜的繁育

微型试管种姜指的是在培养瓶等容器内通过植物组织培养或者其他方法生产繁育出来的微型生姜块茎。本发明通过生姜分化组培苗进行继代增殖和诱导微型种姜培养获得微型试管种姜，本发明所繁育的微型试管种姜为生姜原原种（见图3和图4），可省略传统生姜试管苗从试管苗-原原种的田间生产过程，缩短生姜试管苗的田间制种周期，提高种苗驯化成活率。具体涉及到的微型试管种姜的两种繁育配方为：

培养基B-1：在MS培养基的基础上，添加椰肉60g/L，白砂糖60 g/L和5.5g/L琼脂。

培养基B-2：在MS培养基的基础上，添加白砂糖80 g/L和5.5g/L琼脂。

具体实验过程如下：

1）不同浓度的糖对诱导生姜组培苗生长的影响。试验设5个不同糖的浓度处理，每个处理设计20个重复，观察植株生长情况，统计各项生长指标，结果见下表：

表2 不同配比培养基对生姜微型试管种姜繁育的影响

结果分析：生姜在MS基础培养基中便可产生一定的增殖率和生根率，通过调节培养基中不同的糖浓度，可达到高增殖率，在试管瓶内诱导形成微型种姜。通过结果来看，处理3和处理4均为最优配方，但处理3相对处理4来说，处理3诱导形成微型种姜的生成率较低，时间相对较长，但糖的添加量较低，可节约成本，更适用于生姜的继代增殖培养，处理4对诱导形成微型种姜的生成率和时间更有优势，适用于生姜移栽前的微型种姜培养，因此，处理3和处理4相互配合，形成调节机制。根据试验结果筛选出培养基配方B-1：MS+糖60 g/L+琼脂粉5.5和培养基配方为C：MS+糖80g/L+琼脂粉5.5为最优选择。

通过两种配方进行调控生产微型试管种姜，以上两种配方均可生产出微型试管种姜，其中培养基B-1相较于培养基B-2而言，其增殖率相近，微型种姜较小，形成微型姜块时间较长，可继代次数为10-12次，适用于生姜的组培继代培养，继代周期为35天左右，培养条件同步骤3。移栽前2-3月（本实施例中为2.5月），切取生姜丛生芽转入培养基C中，45天左右形成生姜块茎，苗高10-16cm，叶片翠绿，生长周期为45-60天（本实施例中为50天），在组培瓶内生长不宜超过3个月，培养条件同步骤3，进行驯化移栽。

2）探索椰汁对生姜组培苗繁育继代培养的影响

根据上述试验结果，以诱导分化的生姜组培苗为材料，以上述继代增殖培养基配方B-1为基础培养基：MS+糖60 g/L +琼脂粉5.5。

本试验不可再继代指标为：在接种以后30天左右，植株出现明显的黄化，矮化，死株等长势退化现象。

本试验在培养基B-1中设置5个不同浓度椰肉添加量处理，椰肉在试验过程中，通过榨汁机搅打成椰汁使用，每个处理设置20个重复，观察各项生长指标。

表3 不同椰肉添加量对生姜组培苗生长的影响

结果分析：通过结果表明，在培养基中加入椰汁，可提高生姜组培苗的继代次数，增加组培苗株高，使其茎秆更为粗壮，叶片翠绿，显著提高了生姜组培苗的质量。通过探索，生姜组培苗的品质随着椰肉添加量的增加而增加，到达一定浓度后，没有显著变化，在培养基一中添加椰肉量为60 g/L时，生姜组培苗的可继代次数最多，品质最佳。结合以上所有试验结果，确定适用于生姜继代增殖的培养基配方B为MS+糖60 g/L +椰肉60 g/L+琼脂粉5.5。

因此，在培养基B-1的基础上添加适量的椰肉，将椰肉通过榨汁机搅打成汁液加入培养基中，椰汁含有多种氨基酸等营养成分，通过调节用量可起到壮苗的效果。通过试验论证在培养基配方B-1中加入椰肉的量为60g/L，加入椰汁的有益效果为可增加生姜组培苗的继代次数2-3次，达到壮苗的效果，在增殖继代后期，种苗繁育数量呈几何倍数增长，每多继代一次，都可大大增加种苗的繁育量，因此本发明方法可大大提高生姜种苗繁育后期的生产数量，适用于工厂化大规模生产。

6、生姜原种一代的繁育

1）炼苗：移栽前一周，将生姜组培苗放置与温室大棚内，接受自然光照，在移栽前2天，将组培瓶盖打开，喷少量清水。

2）种植场地准备：原原种生产场地要求采用温室或网棚隔离设施并具有40目以上的防虫网，将日光温室、自控温室或网棚的土地，除去杂草整平，均匀撒上生石灰和杀虫、杀菌剂；在整理好的地表倒入经过消毒处理的营养土或者疏松的园土5cm-6cm（在本实施例中为5.5cm），在营养土或园土上撒上厚度为3cm-4cm的基质（在本实施例中为4cm），一次性浇透水，再翻松、刮平基质。

3）移栽：将炼苗后的生姜组培苗去除琼脂，清洗干净，进行蘸根处理，蘸根剂使用代森锰锌或者多菌灵稀释1000倍，待根系稍微晾干之后移栽至准备好的基质中。于每年3月底到4月初进行移栽，种植株距为8cm，行距为10cm（以下简称为株行距8*10cm）。

4）培管措施：在早春季节，通常温度较低时，需覆盖小拱棚或者采取其他加温设施进行保温，白天温度较高时，需及时揭膜通风，适时中耕锄草，防治病虫害，在移栽后半个月后，适当补充大量元素水溶肥，后期根据植株长势追肥1-2次（本实施例为1次）。于每年11月左右进行采收。

5)收获生姜原种一代：11月份前后，待生姜地上部分黄化后即可收获姜块（原种一代，见图5中的左图），将收获的生姜地上部分拔除，稍微晾干表面水分后，储存于生姜地窖中。

本试验中，选择传统生姜组培生产的生根组培苗（不带块茎）和微型试管种姜进行驯化移栽对比试验。观察统计成活率和产量。

实验结果如下表4所示。

表4 两种不同的生姜组培苗驯化移栽对比试验结果

	成活率（%）	株高（cm）	平均株产量（kg）
				生根组培苗	70	48	0.08
微型试管种姜	95	56	0.11

结果分析：应用微型试管种姜进行移栽，其移栽成活率、植株长势和产量都比应用传统的生姜生根组培苗更好。

7、生姜原种二代的繁育

参照生姜原种一代的繁育方法，将种植株行距调整为15*20cm，适当增加施肥量，于11月左右收获生姜块茎，该收获块茎为生姜原种二代（见图5的中间图）。

8、生姜生产种的繁育

在大田网室或者温室内进行繁育，种植株行距为25*60 cm，其他施肥及管理措施参照DB42/T 187-2021 生姜生产技术规程进行。收获的生姜块茎为生产种（见图5中的右图）。

Claims (9)

1.一种生姜微型试管脱毒种姜的繁育方法，其特征在于，包括下述步骤：

1）生姜种姜脱毒处理：在人工光照培养箱内，设置温度为36-42℃，湿度为60-80%，黑暗下催芽2-3周，待新芽长至1cm-2cm时，取出待用；

2）茎尖脱毒

外植体灭菌后，将完成消毒灭菌操作的生姜芽段吸干水分，在30-40倍解剖镜下剥取带一个大小为0.2mm-0.5mm叶原基的茎尖；

3）诱导生姜芽点分化

将生姜芽点迅速接入诱导培养基A中进行培养，培养到芽点转绿，继续培养至成苗，苗高3-5cm，并分化至3-5个芽点，其中培养基A配方为：在MS培养基的基础上，加入激素NAA0.4-0.6 mg/L、6-BA 1.0-3.0mg/L、糖25-35g/L和5-6g/L琼脂；

4）微型试管种姜的繁育

整株取出接入培养基B中进行培养；其中，培养基B以MS培养基的基础上，添加椰肉30-80g/L，白砂糖60 g/L和5-6 g/L琼脂；切取从生芽接入培养基C中进行培养；其中，培养基C在MS培养基的基础上，添加白砂糖80 g/L和5-6 g/L琼脂。

2.如权利要求1所述的繁育方法，其特征在于，还包括下述步骤：

5) 炼苗：移栽前一周，将生姜组培苗放置于温室大棚内，接受自然光照，在移栽前2天，将组培瓶盖打开，喷少量清水。

3.如权利要求2所述的繁育方法，其特征在于，还包括下述步骤：6）移栽：将炼苗后的生姜组培苗去除琼脂，清洗干净，进行蘸根处理，待根系稍微晾干之后移栽至准备好的基质中。

4.如权利要求3所述的繁育方法，其特征在于，所述蘸根处理是使用代森锰锌或者多菌灵稀释1000倍进行蘸根处理。

5.如权利要求3所述的繁育方法，其特征在于，所述移栽是在每年3-4月进行移栽，种植株行距为8*10cm；在移栽后半个月后，适当补充大量元素水溶肥。

6.如权利要求1所述的繁育方法，其特征在于，上述的繁育方法，所述外植体灭菌的具体操作如下：选取粗壮的芽切下，用清洁剂冲洗，转入超净工作台，将芽段用75%酒精清洗，无菌水冲洗，再用0.1%HgCl₂溶液浸泡8-10min，期间一直摇晃，最后用无菌水冲洗5-6次。

7.如权利要求1所述的繁育方法，其特征在于，所述培养基A配方为：在MS培养基的基础上，加入激素NAA 0.5mg/L、6-BA 2.0mg/L、糖30g/L和5.5g/L琼脂。

8.如权利要求1所述的繁育方法，其特征在于，所述培养基B以MS培养基的基础上，添加椰肉60g/L，白砂糖60 g/L和5.5 g/L琼脂；所述培养基C在MS培养基的基础上，添加白砂糖80 g/L和5.5 g/L琼脂。

9.如权利要求1所述的繁育方法，其特征在于，步骤3）中，培养条件为控制温度25℃±2℃，相对湿度30%-50%，光照强度1500lx-3000lx，光照培养时间为16h/d，黑暗培养8h/d。

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