CN102217550A - 红芽芋脱毒苗快繁技术及培养基组成 - Google Patents

Abstract

红芽芋脱毒苗组培快繁技术，是选取健壮、无病虫的球茎，经杀菌、消毒，挑取0.2mm大小的茎尖，接种到诱导培养基中进行分化培养；培养成丛生芽后，将丛生芽顶端剪除，放入增殖培养基中进行快繁；当丛生芽芽叶展开时，放入生根培养基中进行壮苗生根培养，然后转入炼苗。该方法在繁殖中采用两次脱毒技术，挑取试管苗茎尖，提高了脱毒效果。在培养基配制中优化了配方，利于试管苗生长。克服了传统的用球茎作为繁殖材料用种量大、成本高的弊端，可人为的控制培养生长条件，不受自然条件的影响，取材量小，培养材料经济，生长周期短，繁殖系数大，降低了生产成本，保持了品种种性，提高了产量和品质，可实现工厂化育苗和产业化生产。

Description

红芽芋脱毒苗快繁技术及培养基组成

技术领域

本发明涉及一种植物的组织培养与脱毒快繁技术，确切地说是用红芽芋的茎尖分生组织进行脱毒、用丛生芽进行快速繁殖，以及繁育所用培养基的配比组成。

背景技术

红芽芋(Clocasia escalozta Schott) 属天南星科多年生宿根性草本植物，通常作一年生栽培，我国各地均有种植，以珠江流域及台湾省最多，长江及淮河流域次之，北方地区栽培较少。

红芽芋又称芋艿、红眼芋，其球茎富含大量淀粉、蛋白质、粘液汁以及各种维生素和矿物质，由于淀粉颗粒小，其消化率可达98.8﹪。红芽芋既是蔬菜，又是粮食，可熟食、也可作为加工淀粉和酒精的原料。红芽芋营养丰富，品质佳，风味特殊，是很好的碱性食品，能增强人体的免疫功能，可作为防治癌症的常用药膳主食，深受广大消费者的喜爱。

红芽芋多以块茎或根状茎作为繁殖材料，在长期无性繁殖过程中，裁培芋已普遍受到病毒侵染，导致种性退化、品质下降、产量降低，严重影响红芽芋的生产、品种的交换和种质资源的保存工作。侵染天南星科植物的病毒主要有芋花叶病毒(Dasheen mosaic virus，DMV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，T08WV)、南芥菜花叶病毒(Arabismosaic virus，ArMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、芋瘦小病毒(Colocasia bobone diseasevirus，CBDV)、芋羽状斑驳病毒(Taro feathery mottle virus，TFMoV)、芋脉褪绿病毒(Taro chlorotic vein viru TCVV)、魔芋花叶病毒(Konjak mosaic virus，KoMV)等 。其中，传播范围最广，对红芽芋生产危害最大的是芋花叶病毒。据研究，感染这种病毒的植株生活力降低、球茎小、数量少、品质下降，产量损失近6O%。目前没有特效药防治这类病毒，只有利用脱毒组培技术脱除红芽芋体内病毒，才能从根本上解决问题。

植物组织培养是指通过无菌操作分离植物体的一部分，接种到含有植物营养和调节剂等组成的培养基中，在人工控制的条件下进行培养，使其产生完整植株的过程。植物脱毒是利用植物组织培养技术，脱除植物细胞中浸染的病毒，生产健康的繁殖材料。植物组织培养的理论依据是植物细胞的全能性。植物脱毒和快速繁育技术已经在多种作物上大量使用。目前通过这种方法已经得到了朱顶红、香石竹、菊花、唐菖蒲、球根鸢尾、百合、水仙、马铃薯、甘薯、甜菜和甘蔗等作物的脱毒苗，经检测鉴定，脱毒效果显著。

培养基是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官。在建立红芽芋脱毒苗快繁技术的培养系统时，首先必须找到合适的培养基，培养才能成功。

目前，我国大面积的红芽芋生产仍采用球茎作为繁殖材料，不仅用种量大，成本高，而且还要解决种球的体眠以及发芽问题。红芽芋较易感染病毒，一般红芽芋原种种植三代后必须更换。随着人们生活水平的提高，人们追求和谐，崇尚健康，红芽芋已成为居家生活的席上佳肴。现在市场上急需高产、抗病、高淀粉的红芽芋新品种，农民急需优质脱毒种苗。但是市场上至今未有脱毒苗，限制了生产发展。因此，系统研究红芽芋的组培快繁和脱毒技术，找到红芽芋脱毒培养方法和最佳培养基组成，对于加快红芽芋的生产发展具有非常重要的意义。

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发明内容

本发明的目的是提供一种红芽芋的茎尖分生组织培养脱毒与快速繁育种苗的技术，以及用于红芽芋脱毒繁育的最佳培养基组成，通过试管克隆繁殖可以不受季节和时间场地限制，可以快速、高效的繁殖，保证品种的纯度和基因型不变。

本发明的脱毒组培繁育技术是：

1、茎尖分生组织培养

选取健壮、无病虫的球茎，洗干净表面，在28℃下催芽，待芽长3cm时，掰掉芽子，放于干净玻璃瓶中。加入水和洗衣粉少许，用手捂住上口进行震荡摇晃洗涤10-15min。再用蒸馏水冲洗干净，放在准备好的高压灭过菌的容器内。在无菌室超净工作台上，用0.1%的升汞消毒10min，无菌水冲洗6遍，在解剖镜下，利用解剖针剥离茎尖，所剥茎尖为0.2mm，带1-2个叶原基，快速接种到诱导培养基中，诱导培养基采用MS为基本培养基，不加琼脂，做成液体培养基，在培养瓶中加入用脱脂棉做成的滤纸条。茎尖接种在滤纸条上，每瓶接种4个茎尖。然后在温度25℃，光照强度为2000Lx,光照时间14h/d下培养，25天后转入成苗培养基中培养，待苗长到8cm高时进行病毒检测。为了提高脱病毒效果，选茎尖培养得到的试管苗再次剥取小于0.2mm 的茎尖，于上述培养基中诱导芽分化，如此连续进行，可以获得较好的脱毒效果。约45天茎尖分化形成球状愈伤组织。将其分割转接到分化培养基上，培养30天可分化形成丛生的地上部幼苗。愈伤组织的分化成苗率比较高，繁殖系数可达30。由愈伤组织分化形成的幼苗转接在生根培养基中，平均l8天幼苗即能长出粗壮的根，从而形成完整的幼苗。从茎尖剥离培养到形成完整的试管幼苗，全过程需90天。

2、试管苗丛生芽快速繁殖

将生长旺盛的无菌丛生芽切掉顶端，纵切成大小为0.5cm的组织接种到增殖培养基上。10天后纵切口处长出芽体，20天后芽体伸长1-2cm。在芽体基部产生1 -2个绿芽点，生长缓慢，30天后，芋芽的切块主芽长3—4 cm，有2-3个侧芽。然后再进行第2次继代增殖，周而复始，继代培养8-l0代即可生根。在继代过程中，从第1代到第4代，每次继代增殖系数为1.5倍。从第5代开始，增殖系数逐渐提高，每次增殖2.6倍。如果每次继代时间延长至30-40天，增殖系数可达4-5倍。此时芽基周围出现许多绿色不定芽，逐渐伸长形成丛生状。个别芽伸长形成幼苗。这样快速繁殖体系即可建立起来，可以长期保持高效繁殖状态增殖。

3、壮苗培养及生根

当丛芽长至4-5cm，芽叶展开时，将芽苗转接到生根培养基上，7天后有根长出，15天后长成2-3cm的根，25天长成2-3片叶、3-4条粗根的壮苗。在这个过程中如发现，个别苗较弱，可以将叶片和叶鞘从苗基部剪去，根系也可完全剪去，在转接到生根培养基中，培养出叶片和根系，经2-3代培养后，芋苗健壮，达到栽培的标准。也可在生根培养基中加入PP₃₃₃20mg/L壮苗培养，小苗将矮化健壮生长，比不加的生长缓慢。

4、炼苗移栽

炼苗前要进行低温锻炼，在20℃下锻炼7天，再洗苗栽苗，洗干净根部琼脂，栽入蛭石基质中，浇透水，上覆盖塑料薄膜保湿3-4天，在25℃下7天生根，待芋艿幼苗成活后除去遮盖物。进行常规管理。加强光照，一般15天即可移入防虫隔离网室或大田，生产核心原原种，如果4-6月炼苗可以在室内用育苗盘炼苗，保持通风和温度在20-30℃之间，经常叶面喷水，7天后即可成活移入温室，炼苗成活率在95%以上。

本发明的培养基及配比：

由基本培养基、生长调节剂附加食用白糖和琼脂组成分化诱导培养基、增殖培养基和生根培养基。基本培养基为MS，基本培养基MS的配制方法为公知技术，生长调节剂分别由6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、ａ-萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)、赤霉素(GA₃)和多效唑（PP₃₃₃）组合而成。

1、茎尖分生组织培养基

MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.05mg/L+ GA₃0.1mg/L+白糖35g

以上表达式所表示的意思是：在每升培养基中加入6-苄基腺嘌呤（6-BA）1.5mg、ａ-萘乙酸（NAA）0.05mg、赤霉素（GA₃）0.1mg、琼脂6.5g、白糖35g。本发明所列表达式均按此解释。

2、试管苗快速繁殖培养基

MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.05mg/L+ GA₃0.1mg/L+琼脂6.5g+白糖35g

3、生根培养基

MS+IBA 0.01mg/L+GA₃0.01mg/L+白糖35g

4、壮苗培养基

MS+IBA 0.01mg/L+PP₃₃₃20mg/L +琼脂6.5g+白糖35g

本发明的积极效果是：

一是利用茎尖脱毒组培和丛生芽快繁，解决了病毒导致的种性退化问题，确保了种苗纯度，提高了红芽芋的产量和品质，有利于推进红芽芋产业化生产。脱除病毒后的球茎数量明显增加，产量比常规芋增产20％以上，并且糯性高、口感好、芋体均匀无畸形，成熟早，上市时间提早了3个月。

二是PP₃₃₃的加入使红芽芋的试管苗茎节缩短，长势好，苗壮，叶色深绿，茎秆增加1-2mm粗度。IBA的加入使红芽芋根系发达,较不加任何激素的根系发达粗壮，根多根长。优化了培养基配方，有利于试管苗生长。

具体实施方式

本实施例是用安徽省阜阳市农科院和安徽省农科院联合培育的高抗、高产、高淀粉的新品系“红芽1号”，进行脱毒组培快繁的实例。

1、茎尖分生组织培养

选取健壮、无病虫的球茎洗干净表面，在28℃下催芽，待芽长3cm时，掰掉芽子，放于干净玻璃瓶中。加入水和洗衣粉少许，用手捂住上口进行震荡摇晃洗涤10-15min。再用蒸馏水冲洗干净，放在准备好的高压灭过菌的容器内。在无菌室超净工作台上，用0.1%的升汞消毒10min，无菌水冲洗6遍，在解剖镜下，利用解剖针剥离茎尖，所剥茎尖为0.2mm，带1-2个叶原基，快速接种到诱导培养基中，封口后做好标记。迅速转到培养室内培养。MS为基本培养基，不加琼脂，做成液体培养基MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.05mg/L+ GA₃0.1mg/L+白糖35g，pH值控制在5.8。在培养瓶中加入用脱脂棉花做成的滤纸条。茎尖接种在滤纸条上，每瓶接种4个茎尖。然后在温度25℃，光照强度为2000Lx,光照时间14h/d下培养，25天后转入成苗培养基中培养，待苗长到8cm高时进行病毒检测。为了提高脱病毒效果，选茎尖培养得到的试管苗再次剥取小于0.2mm 的茎尖，于上述培养基中诱导芽分化，如此连续进行，可以获得较好的脱毒效果。约45天茎尖分化形成球状愈伤组织。将这些球状愈伤组织分割转接到分化培养基MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.05mg/L+ GA₃0.1mg/L+琼脂6.5g+白糖35g上，培养30天可分化形成丛生的地上部幼苗。其愈伤组织的分化成苗率比较高，繁殖系数可达30。由愈伤组织分化形成的幼苗转接在生根培养基中，平均l8天幼苗即能长出粗壮的根，从而形成完整的幼苗。从茎尖剥离培养到形成完整的试管幼苗，全过程需90天。

2、试管苗丛生芽快速繁殖

将生长旺盛的无菌丛生芽切掉顶端，纵切成大小为0.5cm的组织接种到增殖培养基MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.05mg/L+ GA₃0.1mg/L+琼脂6.5g+白糖35g上。10天后纵切口处长出芽体，20天后芽体伸长1-2cmm。在芽体基部产生1 -2个绿芽点，生长缓慢，30天后，芋芽的切块主芽长3-4cm，有2-3个侧芽。然后再进行第2次继代增殖，周而复始，继代培养8-l0代即可生根。在继代过程中，从第1代到第4代，每次继代增殖系数为1.5倍。从第5代开始，增殖系数逐渐提高，每次增殖2.6倍。如果每次继代时间延长至30 -40天，增殖系数可达4-5倍。此时芽基周围出现许多绿色不定芽，逐渐伸长形成丛生状。个别芽伸长形成幼苗。这样快速繁殖体系即可建立起来，可以长期保持高效繁殖状态增殖。

3、壮苗培养及生根

当丛芽长至4-5cm，芽叶展开时，将芽苗转接到生根培养基ＭＳ+ＩＢＡ０.０１ｍｇ/L+GA₃0.01mg/L+白糖35g，吲哚丁酸（IBA）上，7天后有根长出，15天后长成2-3cm的根，25天长成2-3片叶、3-4条粗根的壮苗。在这个过程中如发现，个别苗较弱，可以将叶片和叶鞘从苗基部剪去，根系也可完全剪去，在转接到生根培养基中，培养出叶片和根系，经2-3代培养后，芋苗健壮，达到栽培的标准。也可在生根培养基中加入PP₃₃₃20mg/L壮苗培养，培养基为MS+IBA 0.01mg/L+PP₃₃₃20mg/L+琼脂6.5g+白糖35g。小苗将矮化健壮生长，比不加的生长缓慢。

4、炼苗移栽

炼苗前要进行低温锻炼，在20℃下锻炼7天，再洗苗栽苗，洗干净根部琼脂，栽入蛭石基质中，浇透水，上覆盖塑料薄膜保湿3-4天，在25℃下7天生根，待芋艿幼苗成活后除去遮盖物。进行常规管理。加强光照，一般15天即可移入防虫隔离网室或大田，生产核心原原种，如果4-6月炼苗可以在室内用育苗盘炼苗，保持通风和温度在20-30℃之间，经常叶面喷水，7天后即可成活移入温室，炼苗成活率在95%以上。

Claims (14)

1.红芽芋脱毒组培快繁种苗技术，其具体方法步骤是：

（1）茎尖分生组织培养

选取健壮、无病虫的球茎洗干净表面，在28℃下催芽，待芽长3cm时，掰掉芽子，用0.1%的升汞消毒10min，无菌水冲洗6遍，利用解剖针剥离茎尖，所剥茎尖为0.2mm，带1-2个叶原基，接种到诱导培养基中。

2.茎尖接种在滤纸条上，每瓶接种4个茎尖。

3.然后在温度25℃、光照强度为2000Lx、光照时间14h/d下培养，25天后转入成苗培养基中培养。

4.（2）试管苗丛生芽快速繁殖

将无菌丛生芽切掉顶端，纵切成大小为0．5 cm的组织接种到增殖培养基上。

5.芽长3-4 cm，有2-3个侧芽。

6.然后再进行第2次继代增殖。

7.（3）壮苗培养及生根

当丛芽长至4-5cm，芽叶展开时，将芽苗转接到生根培养基上。

8.在生根培养基中加入PP₃₃₃20mg/L壮苗培养。

9.（4）炼苗移栽 

在20℃下锻炼7天，洗干净根部琼脂，栽入蛭石基质中，浇透水，上覆盖塑料薄膜保湿3-4天，在25℃下7天生根。

10.待幼苗成活后除去遮盖物。

11.保持通风和温度在20-30℃之间，经常叶面喷水，7天后即可成活移入温室，炼苗成活率在95%以上。

12.本发明的培养基组成:

由基本培养基、生长调节剂附加食用白糖和琼脂组成分化诱导培养基、增殖培养基和生根培养基。

13.基本培养基为MS，基本培养基MS的配制方法为公知技术，生长调节剂分别由6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、ａ-萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)、赤霉素(GA₃)和多效唑（PP₃₃₃）组合而成。

14.（1）茎尖分生组织培养基

MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.05mg/L+ GA₃0.1mg/L+白糖35g

（2）试管苗快速繁殖培养基

MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.05mg/L+ GA₃0.1mg/L+琼脂6.5g+白糖35g

（3）生根培养基

MS+IBA 0.01mg/L +GA₃0.01mg/L+白糖35g

（4）壮苗培养基

MS+IBA 0.01mg/L+PP₃₃₃20mg/L +琼脂6.5g+白糖35g。