CN102138531A - 阜薯24脱毒苗快繁技术和培养基组成 - Google Patents
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Abstract
阜薯24的脱毒苗快繁技术和培养基组成，是从正在生长的植株中，选择生长健壮，无病虫，具有本品种特征特性的植株，利用解剖针剥离0.2mm茎尖，接种到诱导培养基中；通过病毒检测后，将脱毒无菌苗剪成带有一叶一芽的茎段转接到快繁培养基中。本发明采用棉花滤纸条培养茎尖，病毒检测采用直接试管苗嫁接法，采用高温培养和加入适当激素，调节培养基组成，极大的降低生产成本，缩短了生产周期。解决了用常规繁殖种性退化的难题；可人为的控制培养生长条件，不受自然条件的影响，取材量小，培养材料经济，生长周期短，繁殖系数大，管理方便，利于规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物的组织培养与脱毒快繁技术，确切的说是用甘薯的茎尖分生组织进行脱毒，茎段无性组织培养进行快速繁殖，以及组织培养所用的营养物质—培养基组成。
背景技术
甘薯是一种杂粮作物，既可当粮食又可当蔬菜食用。阜阳市甘薯常年种植面积300万亩以上，利用甘薯加工成的粉丝、薯片已经成为当地农民脱贫致富的有效途径。在当地栽培历史悠久，淮河两岸自古就有“红芋面，红芋馍，离开红芋不能活”的农谚。红芋就是甘薯。在阜阳市甘薯病毒病害发生特别严重，2000年我们在全市进行病毒普查，发现89%田块存在病毒感染症状，国际马铃薯中心（CIP）鉴定的6种病毒均有。连年种植区品种严重退化，产量减产严重。甘薯病毒造成的损失已导致甘薯产区经济损失近3亿元。只有采用茎尖脱病毒培养，才能生产出无毒种苗供应大田生产。
植物脱毒和快速繁育技术已经在多种作物上大量使用。植物不同其培养方式不同，甚至不同品种由于其基因型差异，培养方式和结果也迥异，因此对于不同的作物品种，在培养时，只有找到最佳的培养方式，方能够事半功倍，降低生产成本。甘薯脱毒在90年代陆续开展脱毒种苗繁育工作，已经取得了较好的成绩。但是随着生产的进步，市场急需高产、抗病、高淀粉的甘薯新品种进行更新换代。甘薯较易感染病毒，一般甘薯原种种植三代后必须更换，因此对于优良品种必须进行脱毒培养，方能保证市场获得优质种苗。阜薯24 是阜阳市农科院新近培育的高抗、高产、高淀粉的新品种，深受农民欢迎。但是市场上至今未有脱毒苗，限制了生产发展。因此迫切需要找到阜薯24的脱毒培养方法和最佳培养基组成。
发明内容
本发明的目的是提供一种甘薯的茎尖分生组织培养脱毒与快速繁育种苗的技术，以及用于甘薯脱毒繁育的最佳培养基物质，通过试管克隆繁殖可以不受季节和时间场地限制，可以快速，高效的繁殖。可以保证品种的纯度和基因型不变。
1甘薯阜薯24的脱毒繁育技术，其具体步骤是：
（1）甘薯的茎尖分生组织培养
从正在生长的植株中，选取生长健壮，无病虫，具有本品种特征特性的植株，剪取带有茎尖的茎蔓，去掉叶片，剪成5cm长一段。在流水中将茎段冲洗干净，放入一玻璃瓶中，加入水和洗衣粉少许，用手捂住上口进行震荡摇晃洗涤10-15秒。再用蒸馏水冲洗干净，放在准备好的高压灭过菌的容器内。在无菌室超净工作台上，用质量百分比为0.1%的升汞消毒10min，无菌水冲洗6遍，在解剖镜下，利用解剖针剥离茎尖，所剥茎尖为0.2mm，带1-2个叶原基，快速接种到诱导培养基中，诱导培养基采用MS为基本培养基，不加琼脂，做成液体培养基，在培养瓶中加入用脱脂棉花做成的滤纸条。茎尖接种在滤纸条上，每瓶接种4个茎尖。然后在25℃下，光照强度为2000Lx,光照时数为14h下培养，25天后转入成苗培养基中培养，待苗长到8cm高时进行病毒检测。
（2）试管苗直接嫁接法检测病毒
在防虫条件下盆栽巴西牵牛，采用15x15的塑料花盆播种牵牛，每盆3株。将成苗的试管苗分品系和编号直接嫁接在巴西牵牛上，每株牵牛嫁接一株试管苗。试管苗至1-2片真叶时嫁接。以待 测 样 品的茎蔓为接穗，巴西牵牛为砧木，在巴西牵牛的茎部(子叶以下)斜切。将待检样品茎蔓切成3-5段，每段带有至少一个腋芽，去叶后将底端削成楔型，插入砧木的切口内，用封口膜扎紧，置26-32℃防虫网室内遮荫保湿2-3天。嫁接好后采用上盖塑料小弓棚保湿，6-7天后成活，接去塑料膜，在25℃-27℃下常规管理。发现有症状的去除。直到20天后即可断定所获得试管苗是否脱除病毒。淘汰感染株，剩下无毒株进行试管快速繁育。每个样品重复3次。同时设阳性对照、阴性对照。嫁接10-15天后观察记载症状。根据指示植物症状，确定病毒有无及种类。在所有嫁接的指示植物中只要有一株表现典型症状，该样品即为阳性。采用此法可以脱除甘薯六种常见病毒,甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV) 、甘薯轻斑驳病毒(SPMMV)、甘薯潜隐病毒（SPLV）、甘薯脉花叶病毒（SPVMV）、C-6、C-8。
（3）试管苗快速繁殖
切段繁殖时的茎节以1节即可,即一叶一芽.上端要与芽平,下端留1-2cm长度,斜插或者平放于培养基表面即可,3-4天生根,5-7天根系发育完全,8-10天茎叶生长达到高峰,15天即可剪切下一代,16-18天苗龄的小苗可以出瓶交货.在繁殖中光照要求一般,1000-2000lx均可生长良好。培养温度以高温为好,温度可以提高到28-30℃以促进生根，后期可以降低培养温度到24-25℃ 。
（4）炼苗移栽
炼苗前要进行低温锻炼，从中温温室移到低温温室，锻炼一周，再洗苗栽苗，洗干净根部琼脂，栽入蛭石基质中，浇透水，上覆盖塑料薄膜保湿3-4天，在25℃下7天生根，然后撤去薄膜，常规管理，加强光照，一般15天即可移入温室生产核心原原种，如果4-6月炼苗可以在室内用育苗盘炼苗，保持通风和温度在20-30℃之间，经常叶面喷水，一周后即可成活移入温室，炼苗成活率在95%以上。炼苗驯化采用ABT3号生根粉20-30ppm灌根促使根系活化，生根快，炼苗成活率达到95%以上。
（5）种质资源保存
在10-14℃低温下保存试管苗，可有效延缓保存时间,一般保存半年,加入延缓剂CCC，B9等保存时间可以延长到8个月。只要有低温冰箱即可进行种质资源的保存，保存时待生根后即可将试管苗连同试管捆扎好放入冰箱中保存，每半年要繁殖恢复生长一次，以恢复活力和生长势。
2根据权利1所述的甘薯阜薯24的脱毒繁育技术，其脱毒繁育所用的培养基由基本培养基MS和激素食用糖、琼脂等物质组成，具体如下：
（1）茎尖分生组织培养培养基
MS+6-BA1.0mg/l+NAA0.05mg/l+GA0.1mg/l+琼脂6.5g+市售白糖30g
以上表达式所表示的意思是：在每升培养基中加入6-苄基腺嘌呤（6-BA）1.0mg、ａ-萘乙酸（NAA）0.05mg、赤霉素（GA3）0.1mg、琼脂6.5g、白糖30g。本发明所列表达式均按此解释。
（2）成苗培养基
1/2MS+琼脂6.5g+市售白糖30g，培养基用自来水配制。MS微量元素和有机物省略,同时无机盐离子适当变化,提高钾盐的浓度水平，降低钙镁离子的用量。在每升培养基中加入１２ｍｇ硫酸钾，将ＭＳ原氯化钙浓度由原来的４４０ｍｇ降到４００ｍｇ，硫酸镁由原来的３７０降到３４０ｍｇ。
（３）试管苗快速繁殖培养基
ＭＳ+ＩＢＡ０.０１ｍｇ/l+GA30.01mg/l，吲哚丁酸（IBA）
培养基用自来水配制。MS微量元素和有机物省略,同时无机盐离子适当变化,提高钾盐的浓度水平，降低钙镁离子的用量。在每升培养基中加入１5ｍｇ硫酸钾，将ＭＳ原氯化钙浓度由原来的４４０ｍｇ降到４００ｍｇ，硫酸镁由原来的３７０降到３2０ｍｇ。
（3）壮苗和种质资源保存培养基
MS+IBA0.01mg/l+CCC50PPM+琼脂6.5g+白糖30g(壮苗培养基，PPM为百万分之一，即1PPM=1mg/l);
MS+CCC60PPM+琼脂6.5g+白糖30g（保存培养基）
本发明的积极效果是：
1 利用阜薯24 的茎尖脱毒，茎段快繁，解决了病毒导致的种性退化问题。提高了产量和品质。增产30%以上，并且薯块较易贮藏，口感好。
2采用小试管棉花滤纸条培养，每管接种3-4个茎尖，节约培养空间。茎尖培养采用优化配方培养，速度快，愈伤组织少。配方中加入GA3 促进茎尖成苗，成苗率高达到98%。采用食用白糖代替蔗糖,自来水直接用于培养基制作.浅层培养,增加接种密度,提高单位面积的利用效率。 采取一叶一芽茎段切繁,繁殖系数提高到5倍,繁殖母株反复利用,增加剪切次数.提高培养温度到30℃,促使其快速生根,出苗前期培养温度在28-30℃，生根后4-5天转移到低温培养室控制生长,达到壮苗的目的。
3直接用试管苗嫁接在巴西牵牛上，检测病毒获得成功。嫁接成活率90%，省略炼苗阶段,省时,省力,省工。
4 CCC的加入使甘薯的苗子茎节缩短,长势好,苗壮,叶色深绿,茎秆增加1-2mm粗度。IBA主要是使根系发达,较不加任何激素时的根系发达粗壮,根多根长。采用甘薯脱毒苗三级育苗体系和无病毒甘薯种苗的繁殖更新，有效的防止了品种退化，确保了种苗纯度。
Claims (35)
1. 阜薯24脱毒苗快繁技术和培养基组成
从正在生长的植株中，选取生长健壮，无病虫，具有本品种特征特性的植株，剪取带有茎尖的茎蔓，去掉叶片，剪成5cm长一段。
2.在流水中将茎段冲洗干净，放入一玻璃瓶中，加入水和洗衣粉少许，用手捂住上口进行震荡摇晃洗涤5-10秒。
3.再用蒸馏水冲洗干净，放在准备好的灭过菌的容器内。
4.在无菌室超净工作台上，用质量百分比为0.1%的升汞消毒10min，无菌水冲洗6遍，在解剖镜下，利用解剖针剥离茎尖，所剥茎尖为0.2mm，带1-2个叶原基，快速接种到诱导培养基中，诱导培养基采用MS为基本培养基，不加琼脂，做成液体培养基，在培养瓶中加入用脱脂棉花做成的滤纸条。
5.茎尖接种在滤纸条上，每瓶接种4个茎尖。
6.然后在25℃下，光照强度为2000Lx,光照时数为14h下培养，25天后转入成苗培养基中培养，待苗长到8cm高时进行病毒检测。
7.在 防 虫 条件下盆栽巴西牵牛，采用15x15的塑料花盆播种牵牛，每盆3株。
8.将成苗的试管苗分品系和编号直接嫁接在巴西牵牛上，每株牵牛嫁接一株试管苗。
9.试管苗至1-2片真叶时嫁接。
10.以待 测 样 品的茎蔓为接穗，巴西牵牛为砧木，在巴西牵牛的茎部(子叶以下)斜切。
11.将待检样品茎蔓切成3-5段，每段带有至少一个腋芽，去叶后将底端削成楔型，插入砧木的切口内，用封口膜扎紧，置26-32℃防虫网室内遮荫保湿2-3天。
12.嫁接好后采用上盖塑料小拱棚保湿，6-7天后成活，接去塑料膜，在25℃-27℃下常规管理。
13.发现有症状的去除。
14.直到20天后即可断定所获得试管苗是否脱除病毒。
15.淘汰感染株，剩下无毒株进行试管快速繁育。
16.每个样品重复3-5次。
17.同时设阳性对照、阴性对照。
18.嫁接10-15天后观察记载症状。
19.根据指示植物症状，确定病毒有无及种类。
20.在所有嫁接的指示植物中只要有一株表现典型症状，该样品即为阳性。
21.采用此法可以脱除甘薯六种常见病毒,甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV) 、甘薯轻斑驳病毒(SPMMV)、甘薯潜隐病毒（SPLV）、甘薯脉花叶病毒（SPVMV）、C-6、C-8。
22.切段繁殖时的茎节以1节即可,即一叶一芽.上端要与芽平,下端留1-2cm长度,斜插或者平放于培养基表面即可,3-4天生根,5-7天根系发育完全,8-10天茎叶生长达到高峰,15天即可剪切下一代,16-18天苗龄的小苗可以出瓶交货.在繁殖中光照要求一般,1000-2000lx均可生长良好。
23.培养温度以高温为好,温度可以提高到28-30℃以促进生根，后期可以降低培养温度到24-25℃ 。
24. 炼苗前要进行低温锻炼，从中温温室移到低温温室，锻炼一周，再洗苗栽苗，洗干净根部琼脂，栽入蛭石基质中，浇透水，上覆盖塑料薄膜保湿3-4天，在25℃下7天生根，然后撤去薄膜，常规管理，加强光照，一般15天即可移入温室生产核心原原种，如果4-6月炼苗可以在室内用育苗盘炼苗，保持通风和温度在20-30℃之间，经常叶面喷水，一周后即可成活移入温室，炼苗成活率在95%以上。
25.炼苗驯化采用ABT3号生根粉20-30ppm灌根促使根系活化，生根快，炼苗成活率达到95%以上。
26.在10-14℃低温下保存试管苗，可有效延缓保存时间,一般保存半年,加入延缓剂CCC，B9等保存时间可以延长到8个月。
27.只要有低温冰箱即可进行种质资源的保存，保存时待生根后即可将试管苗连同试管捆扎好放入冰箱中保存，每半年要繁殖恢复生长一次，以恢复活力和生长势。
28.根据权利1所述的甘薯阜薯24的脱毒繁育技术，其脱毒繁育所用的培养基由基本培养基MS和激素食用糖、琼脂等物质组成，具体如下：
茎尖分生组织培养培养基
MS+6-BA1.0mg/l+NAA0.05mg/l+GA0.1mg/l+琼脂6.5g+市售白糖30g
以上表达式所表示的意思是：在每升培养基中加入6-苄基腺嘌呤（6-BA）1.0mg、ａ-萘乙酸（NAA）0.05mg、赤霉素（GA3）0.1mg、琼脂6.5g、白糖30g。
29.成苗培养基
1/2MS+琼脂6.5g+市售白糖30g，培养基用自来水配制。
30.MS微量元素省略,同时无机盐离子适当变化,提高钾盐的浓度水平，降低钙镁离子的用量。
31.在每升培养基中加入１２ｍｇ硫酸钾，将ＭＳ原氯化钙浓度由原来的４４０ｍｇ降到４００ｍｇ，硫酸镁由原来的３７０降到３４０ｍｇ。
32.（３）试管苗快速繁殖培养基
ＭＳ+ＩＢＡ０．０１ｍｇ/l+GA30.01mg/l，吲哚丁酸（IBA）
培养基用自来水配制。
33.MS微量元素省略,同时无机盐离子适当变化,提高钾盐的浓度水平，降低钙镁离子的用量。
34.在每升培养基中加入１5ｍｇ硫酸钾，将ＭＳ原氯化钙浓度由原来的４４０ｍｇ降到４００ｍｇ，硫酸镁由原来的３７０降到３2０ｍｇ。
35.壮苗和种质资源保存培养基
MS+IBA0.01mg/l+CCC50PPM+琼脂6.5g+白糖30g(壮苗培养基，PPM为百万分之一，即1PPM=1mg/l);
MS+CCC60PPM+琼脂6.5g+白糖30g（保存培养基）。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110803 |