CN112470926B - 一种凉粉草茎尖脱毒种苗的快速扩繁方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种凉粉草茎尖脱毒种苗的快速扩繁方法，首先通过茎尖培养建立离体培养体系，然后取3～5mm的丛生芽茎尖培育出初步脱毒的试管苗，可以脱去部分细菌、真菌等微生物；以约2mm的试管苗茎尖进行第二次茎尖脱毒，获得脱毒种苗丛生芽；再将脱毒种苗丛生芽为母苗切段进行快速扩繁，得到脱毒种苗扩繁种苗；脱毒种苗扩繁种苗经过生长、移栽和大田种植，得到凉粉草植株。本发明的方法中，丛生芽诱导增殖培养基和壮苗生根培养基交替使用，既可快速增殖，又能壮苗，避免继代培养造成种质退化；培育出的脱毒种苗种苗成活率高，根系好，长势强健，抗逆性强，病害少，产量高，品质优，经济效益显著提高；降低了操作技术难度；生产周期短。

Description

一种凉粉草茎尖脱毒种苗的快速扩繁方法

技术领域

本发明涉及凉粉草种苗繁育技术领域，特别涉及一种凉粉草茎尖脱毒种苗的快速扩繁方法。

背景技术

凉粉草(Mesona chinensis Benth.)是一种重要的药食两用植物资源，应用广泛，在我国广东、广西、福建、江西等地大面积栽培。凉粉草种质因长期无性繁殖，病害逐代积累，长势变差，种质退化严重。优良种苗十分匮乏，现有品种病害多且易倒伏等，产量和品质下降。目前大面积人工栽培的凉粉草枯萎病、青枯病、茎基腐病等病害严重，且多为土传病害，传染性强，防治困难。部分种植区的病害发病率高达60％以上，造成产量和质量严重下降，对农户收入及凉粉草产业发展造成极大障碍。因目前还无抗病品种，防治病害主要依靠农业防治和化学药剂防治，防治效果差且易造成药材和环境污染。因此，品种复壮和改良已迫在眉睫。鉴于凉粉草无性繁殖特性，培育脱毒种苗是降低其病害危害的关键手段，常规茎尖培养操作难点是使用更小体积的茎尖组织(小于0.2mm)进行诱导，理论上可以脱除病原体，但操作难度大，效率低，而且较低的丛生芽诱导率致使脱毒种苗产量低，难以产业化生产。解剖体积过大的茎尖组织(大于5mm)进行诱导，接种外植体可能仍然感染微量病原，从而降低了脱毒效率。凉粉草种植规模大，种植密度高，每亩3000株以上，用种量较大，高成本的脱毒种苗繁育无法满足农业生产实际需求。因此，开发一种快速高效、操作简单、成本低廉的凉粉草脱毒种苗组培扩繁方法尤为重要，以从源头上解决凉粉草病害严重、质量下降等问题。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种凉粉草茎尖脱毒种苗的快速扩繁方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种凉粉草茎尖脱毒种苗的快速扩繁方法，包括如下步骤：

(1)材料的准备：选择生长健壮的凉粉草作为种苗母株，冬天让其开花，霜冻前覆盖薄膜越冬，翌年春季越冬宿根苗长至10cm左右时采集顶芽，迅速放入密封袋中，保持湿润，4～5℃冷藏暂存备用；

(2)离体培养体系的建立：将步骤(1)中所述顶芽切掉大的叶片，消毒，切取5mm左右的茎尖，接种于丛生芽诱导培养基中，离体培养诱导丛生芽，至丛生芽长至3cm以上并具有两片以上叶片；

(3)茎尖培养获得试管苗：将步骤(2)中3cm以上并具有两片以上叶片的丛生芽切取3～5mm茎尖转至生根壮苗培养基培养，长至4～6cm小植株，即初步脱毒的试管苗；

(4)脱毒苗的培育：取步骤(3)中所述初步脱毒的试管苗约2mm茎尖，置于丛生芽诱导培养基上培养，获得脱毒种苗丛生芽；

(5)脱毒种苗组培快速扩繁：将步骤(4)中所述脱毒种苗丛生芽以茎尖、茎节为单位剪成小段，转入生根壮苗培养基中培养，得到脱毒种苗扩繁种苗；

(6)炼苗移栽：待脱毒种苗扩繁种苗生长至6～10cm高，打开培养瓶盖练苗2天，移栽至育苗基质中，塑料大棚中生长1个月，移植至土壤中繁育脱毒种苗。

步骤(1)中翌年春季越冬宿根萌发出丛生状凉粉草枝条时加强肥水管理，促进宿根苗快速生长。

步骤(2)中所述消毒是在超净台上用体积比为75％的乙醇溶液浸泡30s，无菌水冲洗两次，置于质量浓度为0.1％的氯化汞溶液中消毒6～8min，再用无菌水冲洗3～4次。

步骤(2)中所述离体培养诱导丛生芽是将茎尖在培养基中培养45d后诱导产生丛生芽，60d后丛生芽长至3cm以上并具有两片以上叶片。

步骤(4)中所述置于丛生芽诱导培养基上培养的时间为60d左右。

步骤(5)中所述培养的时间为30d左右。

步骤(2)-(5)中的培养条件为：温度为25±2℃、光照强度为2500lx，16小时光照/8小时黑暗的光照周期。

所述的光照强度和光照周期采用LED植物生长灯控制。

步骤(2)和(4)中所述丛生芽诱导培养基配方：6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.0～1.5mg/L、萘乙酸(NAA)0.5mg/L、0.5～1.0g/L Hyponex 4(花宝4号)、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的Ms培养基；pH值为5.9。

步骤(3)和(5)中所述生根壮苗培养基配方：吲哚丁酸钾1～1.5mg/L、1.0g/LHyponex 4(花宝4号)、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的Ms培养基；pH值为5.9。

所述生根壮苗培养基和所述丛生芽诱导培养基中的Ms培养基配方：

大量元素：KNO₃1.9g/L、NH₄NO₃ 1.65g/L、MgSO₄·7H₂O 0.37g/L、KH₂PO₄ 0.17g/L、CaCl₂·2H₂O 0.44g/L；

微量元素：MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L、ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L、H₃BO₃ 6.2mg/L、KI0.83mg/L、Na₂MoO₄·7H₂O 0.25mg/L、CuSO₄.5H₂O 0.025mg/L、CoCl₂.6H₂O 0.025mg/L；

铁盐：Na₂-EDTA 37.3mg/L、FeSO₄.4H₂O 27.8mg/L；

有机物：甘氨酸2.0mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫铵素0.1mg/L、烟酸0.5mg/L、肌酸100mg/L。

步骤(6)中所述脱毒种苗扩繁种苗移栽之前用自来水将根上的培养基琼脂清洗干净。

步骤(6)中所述育苗基质为草炭：珍珠岩体积比＝4：1的混合物。

步骤(6)中所述育苗基质经过消毒处理。

步骤(6)中所述移植的种植地200m范围内禁止种植带毒凉粉草、烟草、黄瓜、西红柿或蚕豆作物，避免病原体感染。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明在凉粉草离体培养的基础上，取3～5mm的凉粉草丛生芽茎尖培养进行第一次茎尖脱毒，可以脱去部分细菌、真菌等微生物。以试管苗茎尖分生组织(约2mm)进行第二次茎尖脱毒，可以成功培育出脱毒种苗；再利用脱毒种苗为母苗切段进行快速扩繁，可在一年内繁育出大量脱毒种苗。

2、本发明的方法在培养过程中，丛生芽诱导培养基和生根壮苗培养基交替使用，既可快速增殖，又能壮苗，避免继代培养造成种质退化。利用本发明的方法培育出的脱毒种苗成活率高，根系好，长势强健，抗逆性强，产量高，品质优，能够满足生产需求的凉粉草脱毒种苗供给，经济效益显著提高。

3、本发明的方法在脱毒种苗扩繁培养过程中，剥取茎尖不需要在双目显微镜下进行，降低了操作技术难度，降低了时间成本；而且只进行一次组培扩繁操作即可培养到种苗练苗移栽阶段，生产周期短，扩繁阶段不需更换培养基，简化了培养过程，节省了劳动成本，大大提高了组培扩繁效率。

4、本发明中针对凉粉草茎尖培养脱毒种苗培育和扩繁采用了特殊的培养基配方，所用的丛生芽诱导培养基具有促使分芽与茎部强健，本实施例表明其对凉粉草丛生芽诱导和生长有明显的促进作用；生根壮苗培养基稳定性强，完全水溶，具有强壮植物根、茎、叶与根群增多的作用。

附图说明

图1是不同丛生芽诱导培养基对凉粉草茎尖培养丛生芽诱导增殖的影响照片图；其中，1-11依次为实施例2不同丛生芽诱导培养基的诱导结果。

图2是不同生根壮苗培养基对凉粉草茎尖生长的影响照片图；其中，1A～7A为茎和叶，1B～7B为根。

图3是不同生根壮苗培养基对凉粉草茎段生长的影响照片图；其中，1-7依次为实施例2不同生根壮苗培养基的培养结果。

图4是凉粉草脱毒试管苗直接脱瓶移栽种植的照片图；其中，1-3是实施例2编号6的生根壮苗培养基培育出的试管苗移栽种植照片，4-6是实施例2编号7的生根壮苗培养基培育出的试管苗移栽种植照片。

图5是凉粉草脱毒种苗田间种植照片图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)材料的准备：选择一批生长健壮的凉粉草作为种苗母株，到冬天让其开花不再收割，霜冻前覆盖薄膜越冬，翌年春季气温升高时，越冬宿根萌发长出丛生状凉粉草枝条，根据萌发情况加强肥水管理，促进宿根苗快速生长，当宿根苗长至10cm左右时采集顶芽，用湿润纸巾包裹，迅速放入密封袋中，放置4～5度冰箱冷藏暂存备用。

(2)离体培养体系的建立：尽快将步骤(1)中选取的凉粉草顶芽切掉大的叶片，在超净台上用浓度为体积比75％的乙醇溶液浸泡30s，无菌水冲洗两次，然后置于质量浓度为0.1％的氯化汞溶液中消毒6min，再用无菌水冲洗3～4次；切取5mm左右的茎尖接种于丛生芽诱导培养基中，45d后诱导产生丛生芽，60d后丛生芽长至3cm以上并具有两片以上叶片。

(3)茎尖培养获得试管苗：切下步骤(2)中丛生芽长至3cm以上并具有两片以上叶片的的丛生芽茎尖(3～5mm)转至生根壮苗培养基长至4～6cm小植株，培育出初步脱毒的试管苗。

(4)脱毒苗的培育：以凉粉草试管苗茎尖为外植体，在超净台上剥取约2mm的茎尖分生组织，置于丛生芽诱导培养基上培养60d后，获得脱毒种苗丛生芽；本步骤用于获得原始脱毒种苗母本，以便开展下一步的种苗扩繁。

(5)脱毒种苗组培快速扩繁：将步骤(4)中脱毒苗种苗丛生芽以茎尖、茎节为单位剪成小段，转入生根壮苗培养基中培养30d，得到脱毒种苗扩繁试管苗；

(6)炼苗移栽：待凉粉草扩繁种苗生长至6～10cm高后，打开培养瓶盖练苗2天，然后用自来水将脱毒种苗根上的培养基琼脂清洗干净后，移栽至盛有消毒过的育苗基质的育苗盘中，在塑料大棚中生长1个月，随后，将脱毒扩繁种苗移植至进行过消毒处理的土壤中繁育脱毒种苗。

步骤(2)-(5)中的培养在培养室中进行，培养室条件为：温度为25±2℃、光照强度为2500lx的LED植物生长灯，16小时光照/8小时黑暗的光照周期。

步骤(6)中脱毒扩繁种苗种植地200m范围内禁止种植带毒凉粉草、烟草、黄瓜、西红柿或蚕豆作物，避免病原体感染。

步骤(6)中育苗基质为草炭：珍珠岩体积比＝4：1的混合物。

实施例中培养基的配方为：丛生芽诱导培养基含有6-BA 1.5mg/L、NAA 0.5mg/L、1.0g/L Hyponex 4、30g/L白砂糖和7.5g/L琼脂的Ms培养基；pH值为5.9；

生根壮苗培养基含有吲哚丁酸钾1.5mg/L、1.0g/L Hyponex 4、30g/L白砂糖和7.5g/L琼脂的Ms培养基；pH值为5.9。

所述丛生芽诱导培养基和生根壮苗培养基中的Ms培养基配方：

大量元素：KNO₃ 1.9g/L、NH₄NO₃ 1.65g/L、MgSO₄·7H₂O 0.37g/L、KH₂PO₄ 0.17g/L、CaCl₂·2H₂O 0.44g/L；

微量元素：MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L、ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L、H₃BO₃ 6.2mg/L、KI0.83mg/L、Na₂MoO₄·7H₂O 0.25mg/L、CuSO₄.5H₂O 0.025mg/L、CoCl₂.6H₂O 0.025mg/L；

铁盐：Na₂-EDTA 37.3mg/L、FeSO₄.4H₂O 27.8mg/L；

有机物：甘氨酸2.0mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫铵素0.1mg/L、烟酸0.5mg/L、肌酸100mg/L。

实施例2不同诱导增殖培养基和生根壮苗培养基的培养效果研究

根据草本植物培养经验，培养基是种苗增殖及快速繁育效果的关键因素，而凉粉草丛生芽诱导培养基和生根壮苗培养基又是凉粉草脱毒苗培育中最重的两种培养基，因此我们在前期培养基初步考察的基础上，调整培养基配方，分别设计了11种诱导增殖培养基和7种壮苗生根培养基进行了考察实验。不同的培养基组分对诱导、增殖效率及种苗长势影响很大，通过综合对比，最终确定丛生芽诱导培养基和生根壮苗培养基。具体实验过程如下所述：

(1)培养基的初步考察实验

以实施例1中的Ms培养基为基本培养基，添加表1中的植物激素、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂，pH值为5.9；先初步考察了6-BA、NAA、TDZ(噻苯隆)不同浓度及配比对凉粉草茎尖培养的影响，然后从中选出较为适宜的植物激素和浓度区间进行下一步试验。培养条件为温度为25±2℃、采用LED植物生长灯照射(光照强度为2500lx)，16小时光照/8小时黑暗的光照周期，培养时间为60d。

表1凉粉草茎尖培养培养基组分的初步筛选

(2)丛生芽诱导培养基的考察实验

由表1结果确定选用6-BA 0.5～2.5mg/L、NAA 0.5mg/L不同浓度配比进行丛生芽诱导培养基的筛选。设置以下11种培养基，分别如下：

编号1：30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的Ms培养基；pH值为5.9(对照组)；

编号2：6-BA 0.5mg/L、NAA 0.5mg/L、0.5g/L Hyponex 4、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的Ms培养基；pH值为5.9；

编号3：6-BA 1.0mg/L，NAA 0.5mg/L、0.5g/L Hyponex 4、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的Ms培养基；pH值为5.9；

编号4：6-BA 1.5mg/L、NAA 0.5mg/L、0.5g/L Hyponex 4、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的Ms培养基；pH值为5.9；

编号5：6-BA 2.0mg/L、NAA 0.5mg/L、0.5g/L Hyponex 4、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的Ms培养基；pH值为5.9；

编号6：6-BA 2.5mg/L、NAA 0.5mg/L、0.5g/L Hyponex 4、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的Ms培养基；pH值为5.9；

编号7：6-BA 0.5mg/L、NAA 0.5mg/L、1.0g/L Hyponex 4、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的Ms培养基；pH值为5.9；

编号8：6-BA 1.0mg/L、NAA 0.5mg/L、1.0g/L Hyponex 4、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的Ms培养基；pH值为5.9；

编号9：6-BA 1.5mg/L、NAA 0.5mg/L、1.0g/L Hyponex 4、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的Ms培养基；pH值为5.9；

编号10：6-BA 2.0mg/L；NAA 0.5mg/L；1.0g/L Hyponex 4；30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的Ms培养基；pH值为5.9；

编号11：6-BA 2.5mg/L、NAA 0.5mg/L、1.0g/L Hyponex 4、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的Ms培养基；pH值为5.9。

培养条件为温度为25±2℃、采用LED植物生长灯将光照强度控制在2500lx，光照周期为16小时光照/8小时黑暗，培养时间为60d。

表2不同培养基对凉粉草茎尖培养丛生芽诱导增殖的影响

结果见表2和图1。由上表2可见，6-BA和NAA浓度配比对丛生芽诱导增殖效果影响大，6-BA浓度越高，增殖率越高，但丛生芽数量太多长势会变差；添加适宜用量的花宝4号可促进丛生芽生长，叶片增大，茎增粗。综合考虑，11种丛生芽诱导培养基中编号为8、9的培养基培养效果好，不仅分化的丛生芽多、增殖效率高，而且叶片颜色绿、芽健壮、有根、无愈伤。

(3)生根壮苗培养基的考察实验

生根壮苗培养基主要用于丛生芽茎尖培育脱毒苗母本及最后一步脱毒试管苗的快速扩繁，培养基组分对茎尖、茎段生根壮苗的影响均较大，适宜的培养基配方可以缩短培养周期(30d即可出苗)，健壮种苗，保证种苗供应量，并提高移栽成活率。在前期试验的基础上，确定吲哚丁酸钾为壮苗生根培养基中使用的植物激素，相比NAA，吲哚丁酸钾可促进凉粉草茎尖、茎段快速生根，缩短15-30d培养周期，且可以健壮种苗。以下对吲哚丁酸钾的使用浓度再进行考察，最终筛选出适宜的培养基配方。

生根壮苗培养基配方：

编号1：30g/L白砂糖和7.5g/L琼脂的Ms培养基；pH值为5.9(对照组)；

编号2：吲哚丁酸钾0.5mg/L、0.5g/L Hyponex 4、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的Ms培养基；pH值为5.9；

编号3：吲哚丁酸钾1.0mg/L、0.0g/L Hyponex 4、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的Ms培养基；pH值为5.9；

编号4：吲哚丁酸钾1.5mg/L，0.5g/L Hyponex 4，30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的Ms培养基；pH值为5.9；

编号5：吲哚丁酸钾0.5mg/L，1.0g/L Hyponex 4，30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的Ms培养基；pH值为5.9；

编号6：吲哚丁酸钾1.0mg/L，1.0g/L Hyponex 4，30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的Ms培养基；pH值为5.9；

编号7：吲哚丁酸钾1.5mg/L，1.0g/L Hyponex 4，30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的Ms培养基；pH值为5.9。

培养条件为温度为25±2℃、采用LED植物生长灯将光照强度控制在2500lx，光照周期为16小时光照/8小时黑暗，培养时间为30d。

表3不同生根壮苗培养基对凉粉草茎尖生长的影响

表4不同生根壮苗培养基对凉粉草茎段生长的影响

由表3、4、图2、3可知，培养基中不同浓度配比的吲哚丁酸钾和花宝4号对茎尖和茎段直接生根壮苗培养影响较大，完全不添加的对照组培养基(编号1)上，凉粉草茎尖和茎段长势都差很多，平均生根数少，苗细弱，生长缓慢；7种生根壮苗培养基中编号为6、7的培养基培养效果最好，不仅对茎尖直接生根效果好，而且茎段壮苗效果也好，缩短了培养时间，短期内还能长出多个侧芽，培育出的试管苗丛生芽多，生长健康，茎粗，叶片大，颜色绿，根系好。直接出瓶移栽成活率高达100％，丛生芽多，长势快(见图4)。

实施例3凉粉草脱毒种苗大田种植效果及重复性研究

(1)取实施例1步骤(3)中培育的初步脱毒的凉粉草试管苗3000株，分成实验组1、实验组2和实验组3，每组1000株；

(2)取实施例1步骤(5)中培育的脱毒种苗扩繁试管苗3000株，分成实验组4、实验组5和实验组6，每组1000株；再取扦插繁殖的凉粉草幼苗3000株，分成对照组1、对照组2和对照组3，每组1000株；

(3)于2018年5月上旬，将实验组1和对照组1移栽至广东省梅州市平远县热柘镇的大田中，将实验组2和对照组2移栽至广东省梅州市平远县石正镇的大田中，将实验组3和对照组3移栽至广东省梅州市平远县八尺镇的大田中。每周观察一次病害发生情况，病株及时处理，采用同样的种植管理和肥料，2018年10月中旬采收，称重。

种植管理和肥料：种植前将田块土壤深耕细耙，每667m²施入充分腐熟有机肥鸡粪1000kg，再施入磷复合肥(N、P、K含量各15％)30kg，并与土壤充分混匀。将畦面盖好黑地膜(厚0.01mm)，四周盖土压实至垄沟盖满为宜。先将苗床灌起苗水，然后不伤根、不伤皮地带土将种苗挖起，然后用木棍(直径5～6cm)在黑地膜上打穴(或用小锄头挖穴)，穴深约10cm，口径约5cm，将苗木放置于挖好的穴中，盖上细土(不让根外露)，压实，浇足定根水。株行距一般为40cm×40cm。凉粉草种植45天后，当凉粉草生长到快要盖满地面时(即封垄时)，要及时把黑地膜去除。凉粉草整个营养生长期需水量较大，不耐持久干旱，干旱时应及时灌水。去除黑地膜15天及60d后补施复合肥(N、P、K含量各15％)各一次，每667m²施15kg。

表5凉粉草脱毒种苗大田种植效果

上表5中的病害严重度的划分方法如下：分为0，1，2，3，4共五级：0级：未发病；1级：轻微染病，发病面积低于病株总面积10％；2级：中度染病，发病面积占病株总面积10-30％；3级：严重染病，发病面积占病株总面积30-50％；4级：染病非常严重，发病面积占病株总面积50％以上。

上表5的结果显示，实验组染病率比对照组均明显降低，经过茎尖培养获得的试管苗均能脱除一些病原体，发病率和病害严重度明显降低；经过二次茎尖培养的脱毒种苗扩繁试管苗，发病率能控制在5％以下，且病害严重度级别3级以上的比率(％)均为0，说明二次茎尖脱毒培养效果好，染病数量少，症状轻，处于可控范围，可明显提高凉粉草的产量和质量。凉粉草脱毒种苗田间种植见图5。

上述实验结果证明，本发明所述凉粉草种苗培育方法效率高，重复性好，具有较好的推广价值。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种凉粉草茎尖脱毒种苗的快速扩繁方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）材料的准备：选择生长健壮的凉粉草作为种苗母株，冬天让其开花，霜冻前覆盖薄膜越冬，翌年春季越冬宿根苗长至10cm时采集顶芽，迅速放入密封袋中，保持湿润，4～5℃冷藏暂存备用；

（2）离体培养体系的建立：将步骤（1）中所述顶芽切掉大的叶片，消毒，切取5mm的茎尖，接种于丛生芽诱导培养基中，离体培养诱导丛生芽，至丛生芽长至3cm以上并具有两片以上叶片；

（3）茎尖培养获得试管苗：将步骤（2）中3cm以上并具有两片以上叶片的丛生芽切取3～5mm茎尖转至生根壮苗培养基培养，长至4～6cm小植株，即初步脱毒的试管苗；

（4）脱毒苗的培育：取步骤（3）中所述初步脱毒的试管苗2mm茎尖，置于丛生芽诱导培养基上培养，获得脱毒种苗丛生芽；

（5）脱毒种苗组培快速扩繁：将步骤（4）中所述脱毒种苗丛生芽以茎尖、茎节为单位剪成小段，转入生根壮苗培养基中培养，得到脱毒种苗扩繁种苗；

（6）炼苗移栽：待脱毒种苗扩繁种苗生长至6～10cm高，打开培养瓶盖练苗2天，移栽至育苗基质中，塑料大棚中生长1个月，移植至土壤中繁育脱毒种苗；

步骤（2）和（4）中所述丛生芽诱导培养基配方：6-苄氨基嘌呤1.0 mg/L、萘乙酸0.5mg/L、1.0g/L Hyponex 4、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的Ms培养基；pH值为5.9；

步骤（3）和（5）中所述生根壮苗培养基配方：吲哚丁酸钾1.5mg/L、1.0g/L Hyponex 4、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的Ms培养基；pH值为5.9；

所述生根壮苗培养基和所述丛生芽诱导培养基中的Ms培养基配方：

大量元素：KNO₃1.9g/L、NH₄NO₃ 1.65g/L、MgSO₄·7H₂O 0.37g/L、KH₂PO₄ 0.17g/L、CaCl₂·2H₂O 0.44g/L；

微量元素：MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L、ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L、H₃BO₃ 6.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na₂MoO₄·7H₂O 0.25mg/L、CuSO₄.5H₂O 0.025mg/L、CoCl₂.6H₂O 0.025mg/L；

铁盐：Na₂-EDTA 37.3mg/L、FeSO₄.4H₂O 27.8mg/L；

有机物：甘氨酸2.0mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫铵素0.1mg/L、烟酸0.5mg/L、肌酸100mg/L；

步骤（2）中所述消毒是在超净台上用体积比为75%的乙醇溶液浸泡30s，无菌水冲洗两次，置于质量浓度为0.1%的氯化汞溶液中消毒6～8min，再用无菌水冲洗3～4次。

2.根据权利要求1所述的凉粉草茎尖脱毒种苗的快速扩繁方法，其特征在于，

步骤（2）-（5）中的培养条件为：温度为25±2℃、光照强度为2500lx，16小时光照/8小时黑暗的光照周期。

3.根据权利要求1-2任一项所述的凉粉草茎尖脱毒种苗的快速扩繁方法，其特征在于，

步骤（2）中所述离体培养诱导丛生芽是将茎尖在培养基中培养45d后诱导产生丛生芽，60d后丛生芽长至3cm以上并具有两片以上叶片；

步骤（4）中所述置于丛生芽诱导培养基上培养的时间为60d；

步骤（5）中所述培养的时间为60d。

4.根据权利要求1所述的凉粉草茎尖脱毒种苗的快速扩繁方法，其特征在于，

步骤（6）中所述育苗基质为草炭：珍珠岩体积比=4：1的混合物；

步骤（6）中所述育苗基质经过消毒处理；

步骤（6）中所述移植的种植地200m范围内禁止种植带毒凉粉草、烟草、黄瓜、西红柿或蚕豆作物，避免病原体感染。

5.根据权利要求1所述的凉粉草茎尖脱毒种苗的快速扩繁方法，其特征在于，步骤（1）中翌年春季越冬宿根萌发出丛生状凉粉草枝条时加强肥水管理，促进宿根苗快速生长。

6.根据权利要求1所述的凉粉草茎尖脱毒种苗的快速扩繁方法，其特征在于，步骤（6）中所述脱毒种苗扩繁种苗移栽之前用自来水将根上的培养基琼脂清洗干净。

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