CN109156345B - 六出花生殖芽顶端组织的微繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种六出花生殖芽顶端组织的微繁方法，包括步骤：(1)在4月份采集六出花的根茎芽或生殖芽，或在7月份采集营养芽，并取芽顶端分生组织作为外植体，且将外植体修成2‑4cm长待用。(2)将外植体清洗、消毒。(3)置于初代培养基上进行初代培养，得到发芽的外植体。(4)在继代培养基上继代培养4代，得到生根后的组织苗。(5)炼苗，得到六出花苗木。本发明采用组培方法，可以避免种子繁殖出现变异的现象，可以对六出花优良品种进行大量繁殖，使六出花组培繁殖更为丰富，能够满足市场需要。
Description
技术领域
本发明涉及农林技术领域，尤其涉及六出花苗木的组织培养方法。
背景技术
六出花(Alstroemeria aurantiaca D.Don)也叫智利百合、秘鲁百合等，是石蒜科、六出花属多年生草本，国外有的国家归在百合科下。其花色丰富、花朵艳丽、品种繁多，是盆栽、切花、花坛栽培的上佳品种。繁殖常用种子、分株繁殖，但对优良品种的繁殖则常用分株繁殖。
分株繁殖虽然是常用方法，但对六出花优良品种的繁殖来说，是除组培外唯一的一种方法了(种子繁殖由于后代易发生变异，一般情况下用于新品种选育，良种扩繁时不适用)，并且运用组培方法进行繁殖在国内外均不成熟。而分株法对六出花的扩繁来说相当缓慢，满足不了市场需求。六出花在荷兰有很多品种，但购入必须要交一大笔品种权费用，所以无法大面积繁殖。
在组织培养技术中，采用生殖芽培养进行大规模繁殖供给市场是可能的，但相对于其它很多科属植物来说，石蒜科植物的繁殖是很困难的，国内在生产上组培也没有先例。
在组织培养中，采用六出花根茎上长出的茎顶组织进行培养，遭受杂菌污染比较严重，把根茎挖出后，从根上的切痕带来的病菌污染、母株的生长势低下所带来的生育障碍等等原因，使得采用根茎以外的组织进行大量繁殖成为可能。
有学者采用生殖芽顶端组织对六出花的组织培养繁殖进行研究，其它组培方式基本没有。
发明内容
发明目的：本发明提供了一种六出花生殖芽顶端组织的微繁方法，该方法解决了现有的六出花常用种子、分株繁殖方法无法大面积繁殖的问题；同时，满足了市场需求。
技术方案：本发明的六出花生殖芽顶端组织的微繁方法，包括以下步骤：
(1)在4月份采集六出花的根茎芽或生殖芽，或在7月份采集营养芽，并取芽顶端分生组织作为外植体，且将外植体修成2-4cm长待用，优选3cm。
(2)将外植体清洗、消毒。
(3)在无菌条件下，将带有1-2个叶原基的顶端分生组织置于初代培养基上，在22-27℃、每天16h 3000lux光照条件下进行初代培养，6周后外植体基部发芽，得到发芽的外植体，温度优选25℃。
(4)对发芽的外植体进行切割修成2-4cm，优选3cm置于继代培养基上，继代培养4代，得到生根后的组织苗。
(5)将生根后的组培苗洗净、杀菌，栽植于泥炭土中，之后6周内保湿、遮光，得到六出花苗木。
其中，步骤(2)中，所述清洗采用洗衣粉溶液；所述消毒采用0.5％次氯酸钠浸泡。
步骤(3)中，所述初代培养基采用MS，并添加蔗糖0.3％。
所述初代培养基还添加激素6-BA和NAA，浓度在0-10mg/L。
步骤(4)中，所述继代培养基采用MS，且MS培养基中的N素浓度为 25-100％，添加蔗糖3-12％，并添加激素6-BA和NAA，浓度在0-10mg/L。
步骤(5)中，所述洗净采用水下12h洗净；所述杀菌采用多菌灵2000倍杀菌，并每2周喷1次。
具体步骤如下：
(1)材料采集
在连续4个晴天以上，根据各种芽的生长季节和部分，分别在4月份采集根茎芽和生殖芽，7月份采集营养芽。取各茎先端的分生组织作为外植体，每个外植体修成3cm左右，待用。
(2)清洗、消毒
先用洗衣粉将外植体洗净，再用次氯酸钠(0.5％)浸泡10min杀菌。
(3)初代培养
在无菌条件下，带有1-2个叶原基的顶端分生组织，置于初代培养基上，基本培养基采用MS，蔗糖0.3％，激素添加6-BA和NAA浓度在0-10mg/L。培养基注入试管型培养瓶，每瓶10ml。培养条件为25℃、每天16h 3000lux光照。6 周后外植体基部发芽，得到发芽的外植体，并调查愈伤组织发芽状况。
(4)继代培养
对发芽的外植体进行切割，进行第2次培养。分切的材料修成3cm，置继代培养基上。培养基采用MS，但MS培养基中的N素含量在25％、50％、100％3 种浓度梯度，蔗糖在3％、6％、9％、12％4种比例，激素添加仍然以6-BA和NAA 组合，浓度在0～10mg/L。继代培养3代，各在6周后调查，在第4代后测定生物质重量和发根状况，得到生根后的组织苗。
(5)炼苗
将生根后的组培苗从瓶中取出，置于水下12h洗净，用多菌灵2000倍杀菌，每2周喷1次，栽于泥炭土中，之后6周内保湿、遮光。
有益效果：1、本发明采用组培方法，可以避免种子繁殖出现变异的现象；2、可以对六出花优良品种进行大量繁殖；3、避免出现污染很重的现象发生；4、完善六出花的扩繁体系；5、使六出花组培繁殖更为丰富；6、能够满足市场需要。
附图说明
图1是本发明的实施例中不同激素浓度对生殖芽愈伤组织发生率的影响示意图；
图2是本发明的实施例中继代培养第3代总平均根茎数示意图；
图3是本发明的实施例中继代培养第4代总平均根茎数示意图。
具体实施方式
实施例
本实施例包括对比实施例。
在连续4个晴天以上，根据各种芽的生长季节和部分，分别在4月份采集根茎芽和生殖芽，7月份采集营养芽。取各茎先端的分生组织作为外植体，每个外植体修成3cm左右，先用洗衣粉将外植体洗净，再用次氯酸钠(0.5％)浸泡10min 杀菌。
(1)不同激素组合对生殖芽组织培养的影响
在无菌条件下，带有1-2个叶原基的顶端分生组织，置于初代培养基上。基本培养基采用MS，蔗糖0.3％，激素添加6-BA和NAA浓度均设定的0、0.01、 0.1、1、10mg/L5个处理，每处理3个重复，每重复30瓶。
在组织培养中，芽的伸长生长在组织培养一定时间后是会发生的，但只生长出一个枝条，不会出现大量的多芽丛生的状况。
愈伤组织的膨大：在形成发芽的个体中，基部能形成肥大的根茎状的组织，这种现象在6-BA0及0.01 mg/L 的NAA为10 mg/L 的区域较突出些。
从图1中可以看出，对生殖芽进行组织培养，随着2种激素浓度的增加，愈伤组织形成的百分率逐渐升高，6-BA浓度一般在0.1～10 mg/L 之间升高更快， NAA在0.1 mg/L 时愈伤组织发生率达到87％，因此芽体的膨大不认为和NAA浓度的变化有关。
(2)取芽的位置对愈伤组织形成的影响
对六出花根茎芽、生殖芽和营养芽3种芽态作为外植体进行组织培养。培养基仍然采用MS，6-BA浓度采用试验1中效果最好的10 mg/L ，而NAA的浓度则采用2种梯度分别是0.1 mg/L 和1 mg/L ，设3个重复，每重复20瓶。每次继代6 周后调查发芽和根系生长情况，共调查3次，如表1所示。
在组培过程中，营养芽发生的芽的数量大多为1个，而生殖芽和根茎芽发生的芽的数量相对较多，主要集中在NAA1 mg/L 浓度区，特别是根茎芽。随着继代培养的进行，丛生芽的伸长受到抑制，肥大的根茎状组织逐渐形成。
表1不同采集部位的外植体在3次继代培养中的反应
根据表1中所示，对于NAA的添加，愈伤的发生较差的是营养芽，而生殖芽和根茎芽的效果要好很多，尤其是根茎芽的根茎形成率最高。在各代培养中，发现根茎形成率越来越高。
六出花根茎顶端的芽是唯一形成假二叉分枝从而进行营养生长的组织，保持有分化新的根茎的能力。试验中的根茎芽是在花芽分化前过渡到生殖生长的、伸长了的地上茎，这些地上茎的叶腋不分化出成长点，不进行营养生长，不具有根茎分化能力。在试验中的根茎芽因为是和地上茎的分生组织无关的、分化出的新的根茎，和地下茎的先端的芽具有类似生理状态的部分。
试验中的生殖芽是花芽分化后的地下茎，表示具有形成根茎的能力，特别是在添加NAA1.0ml/L的情况下表示出和根茎芽相同的形成根茎能力，据此地下茎形成根茎，内生生长素是参与其中的。另外从实验1中可以认为高浓度的细胞分裂素也参与其中。今后有必要对地下茎生长调节剂的含量进行检讨。
伸长达50～100cm的营养芽的顶端分生组织，即使在继代2代中根茎形成率也显著较低，认为是不适宜大量繁殖的材料。本试验中使用的营养芽是地上茎的顶端分生组织，在外观上不认为已经进行了花芽分化，期待高的根茎形成能力。由于极低的根茎形成率，认为花芽分化的有无和根茎的形成是否有关系。
表1中从营养芽、生殖芽到根茎芽的次序，根茎形成率逐渐升高。
(3)继代培养基中N素和糖的浓度对根茎的增殖及炼 苗的影响
对蔗糖采用4种浓度(3％、6％、9％、12％)、培养基中N素采用3种处理 (1/1、1/2、1/4)，研究不同蔗糖浓度和N素含量对各代根茎总数的影响。
对生殖芽的顶端分生组织进行继代培养后长出的根茎，分切成单个芽体置于培养基中，继续进行培养6个星期。上一个生殖芽组培实验中，培养个体的总平均根茎芽数初代培养是0.05个，而在继1代中是平均0.3个，至继2代结束时是平均0.45个，对相同的培养基MS、蔗糖3％、6-BA10 mg/L 、NAA1 mg/L 在继3 代中，总根茎芽数升高到平均4.3个，而到继4代则高达7.8个。
培养组织通过反复的继代培养，获得了细嫩的根茎，增殖率也得到了很大的提高。如图2所示，在继3代培养过程中，1/2N-MS、6％的蔗糖培养里进行培养结束，总根茎数为最多达最多6.5个，而在1/2N-MS、12％的蔗糖培养里进行培养结束时仅有3.5个。将根茎以单个分切培养6个星期后，如图3所示，到继 4代时，每个培养个体获得总根茎芽数达到平均7.7个，最多的是在1/2N-MS、 12％的蔗糖培养基上达14.7个，蔗糖浓度比6％高的而总根茎芽较低的12％蔗糖平均总根茎芽数为5个。
(4)不同培养基蔗糖含量及N素对炼苗的影响
对蔗糖采用4种浓度(3％、6％、9％、12％)、培养基中N素采用3种处理 (1/1、1/2、1/4)，研究不同蔗糖浓度和N素含量对炼苗期间芽体重量的影响。
在继代培养第4代结束，炼苗刚开始时，芽体重量在糖浓度6％以上，随N 素降低重量下降，在炼苗6周后，3％和12％的重量变小，6％、9％的重量变大。相对于9％比6％在炼苗前芽伸长降低了，重量也变小，炼苗期间芽伸长加快，发根旺盛生长。炼苗6周后，3％和12％的发根较少，9％变多了。
从上述试验结果来看，对营养芽进行组织培养，在初代培养的培养基 MS+6-BA10mg/L +NAA 0.1 mg/L 中根茎发芽率达最高为87％。在继代培养中虽然根茎芽在某些指标上高于生殖芽，但对于根茎的分化能力弱于生殖芽，所以以生殖芽在继代培养中以MS+6-BA10 mg/L +NAA1 mg/L 有利于六出花的大量繁殖。继 4代培养中糖的含量以9％、N素以1/2的培养基最好。
Claims (3)
1.一种六出花生殖芽顶端组织的微繁方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在4月份采集六出花的生殖芽，并取芽顶端分生组织作为外植体，且将外植体修成2-4cm长待用；
(2)将外植体清洗、消毒；
(3)在无菌条件下，将带有1-2个叶原基的顶端分生组织置于初代培养基上，在22-27℃、每天16h 3000lux光照条件下进行初代培养，6周后外植体基部发芽，得到发芽的外植体；所述初代培养基由MS基本培养基、10mg/L 6-BA、1mg/L NAA及0.3%蔗糖组成；
(4)对发芽的外植体进行切割修成2-4cm，置于继代培养基上，继代培养4代，得到生根后的组织苗；所述继代培养基由N素浓度为原培养基1/2的MS基本培养基、10mg/L 6-BA、1mg/L NAA及6%蔗糖组成；
(5)将生根后的组培苗洗净、杀菌，栽植于泥炭土中，之后6周内保湿、遮光，得到六出花苗木。
2.根据权利要求1所述的六出花生殖芽顶端组织的微繁方法，其特征在于：步骤(2)中，所述清洗采用洗衣粉溶液；所述消毒采用0.5％次氯酸钠浸泡。
3.根据权利要求1所述的六出花生殖芽顶端组织的微繁方法，其特征在于：步骤(5)中，所述洗净采用水下12h洗净；所述杀菌采用多菌灵2000倍杀菌，并每2周喷1次。
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