CN111758559B - 一种蝴蝶兰与钻喙兰远缘杂交种子无菌播种及其育苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种蝴蝶兰与钻喙兰远缘杂交种子无菌播种及其育苗的方法，以蝴蝶兰为母本、钻喙兰为父本，通过人工授粉获得杂交果荚，果荚经预处理、种子无菌播种、种子萌发、原球茎增殖与分化、壮苗生根、炼苗移栽等步骤获得远缘杂种后代群体。本发明具有种子萌发率高，成苗数多，成苗时间短，种苗质量好等优点，解决了远缘杂交种子因亲和性不易成功且在自然条件下极难萌发、不易成苗的难题。因此，通过无菌播种人工繁殖的方法，能够在较短的时期内获得大量种苗，为蝴蝶兰远缘杂交优良品种的选育奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于组织培养快速繁殖技术领域，具体涉及一种蝴蝶兰与钻喙兰远缘杂交种子无菌播种及其育苗的方法。
背景技术
蝴蝶兰(Phalaenopsis)因其花形奇特、花色艳丽、色泽丰富、花序整齐、花期长，素有“洋兰皇后”的美称。蝴蝶兰是目前世界上销售量最大的兰花品种，在美国的兰花销售量中，蝴蝶兰占所有兰花的75％，同时居荷兰盆花、日本盆栽兰花及我国年宵花卉排行榜的首位，每年全球消费量已超过2.8亿株。近年来，蝴蝶兰的杂交育种取得了巨大的育种成就，在产业发展上作出了重大贡献，但蝴蝶兰的遗传基础仍然相对狭窄。因此，将属间野生种质资源的优良基因导入蝴蝶兰中，丰富蝴蝶兰的基因库，并提高蝴蝶兰的抗性具有重要的理论和实践意义。
钻喙兰(Rhynchostylis retusa)为兰科钻喙兰属多年生植物，是蝴蝶兰的近缘属，原产我国贵州和云南，广布于亚洲热带地区，从斯里兰卡、印度到热带喜马拉雅经老挝、越南、柬埔寨、马来西亚至印度尼西亚和菲律宾。植株具发达而肥厚的气根，根粗6-16毫米；茎直立或斜立，通常长3-10厘米，有时更长，不分枝，具少数至多数节，密被套叠的叶鞘；叶肉质，二列，彼此紧靠，外弯，宽带状。花序腋生，1-3个，长于或近等长于叶，不分枝，常下垂；花白色而密布紫色斑点，开展，纸质。生于海拔310-1400米的疏林中或林缘树干上，花期5-6月，植株抗性强，具有很高的观赏价值和利用价值。
蝴蝶兰远缘杂交存在亲和性障碍，属间杂种胚通常发育不良，且种子无胚乳，在自然条件下极难萌发，不易成苗。因此，通过无菌播种的方法，能够在较短的时间内萌发并获得大量种苗。当前，国内外并未见到有关蝴蝶兰与钻喙兰远缘杂交的无菌播种及其育苗的研究报道。因此，深入研究蝴蝶兰与钻喙兰远缘杂交种子的萌发与育苗特性，以期为蝴蝶兰与钻喙兰属间远缘杂交育种和新品种培育奠定基础。
发明内容
有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于提供了一种蝴蝶兰与钻喙兰远缘杂交种子无菌播种及其育苗的方法，通过蝴蝶兰与钻喙兰进行远缘杂交，能够在较短的时期内获得大量的种苗，为蝴蝶兰与钻喙兰远缘杂交优良品种的选育奠定基础，并培育出新型兰花品种，同时为蝴蝶兰与钻喙兰远缘杂交种苗生产提供了一条有效的途径。
本发明通过以下技术方案来解决上述技术问题：
一种蝴蝶兰与钻喙兰远缘杂交种子无菌播种及其育苗的方法,其特征在于该方法包括以下步骤：
(1)人工授粉:以蝴蝶兰为母本，钻喙兰为父本进行杂交，选择新鲜有活力的花朵，用消毒过的镊子去除母本唇瓣及合蕊柱上的花粉块，同时取父本新鲜的花粉块置于母本蕊腔内；授粉100-120d后，采收未开裂的成熟果荚进行无菌播种；
(2)果荚预处理及种子播种：果荚经流水冲洗后，在超净工作台上用75％酒精擦洗干净，再用0.1％HgCl2溶液灭菌10-12min，无菌水冲洗3～5次，无菌滤纸吸干残余水分后切开果荚，然后将种子播种于萌发培养基上培养；
(3)种子萌发：将种子播种于所述萌发培养基上培养，培养温度25～28℃，前期暗培养或有散射光即可，后期光照强度1000-1500lx，光照时间12h/d；
(4)原球茎增殖与分化：当种子萌发成嫩绿色原球茎后，转接到增殖与分化培养基上进行培养，培养温度25～28℃，光照强度1500～2000lx，光照时间12h/d；
(5)壮苗生根培养：将原球茎分化成的幼苗小心切下，转接到壮苗生根培养上培养，培养温度25～28℃，光照强度1500～2000lx，光照时间12h/d；
(6)炼苗移栽：当叶数2～4片，叶长3～5cm，叶宽1～2cm，根长2～5cm，根数2～4条时，即可放到具自然光散射的温室大棚进行炼苗驯化，炼苗大棚温度控制在22℃～28℃，炼苗20～30天便可出瓶移栽；种植温度保持22～28℃，湿度保持60～70％。
优选地，所述萌发培养基为Hyponex(花宝1号)3.0g/L+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)2.0mg/L+NAA(萘乙酸)1.0mg/L+10.0％椰子汁+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH值5.5-5.8。
优选地，所述增殖与分化培养基为Hyponex(花宝1号)3.0g/L+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)2.0mg/L+AD(腺嘌呤)2.0mg/L+10.0％椰子汁+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH值5.5-5.8。
优选地，所述壮苗生根培养基为Hyponex(花宝1号)3.0g/L+NAA(萘乙酸)0.5mg/L+10.0％椰子汁+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH值5.5-5.8。
优选地，所述壮苗生根培养基为Hyponex(花宝1号)3.0g/L+NAA(萘乙酸)0.5mg/L+活性炭2.0g/L+10.0％椰子汁+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH值5.5-5.8。
优选地，所述步骤6)中的移载具体为：出瓶时将瓶塞取下，用镊子将组培苗从瓶内夹出，放到清水中将附带的培养基清洗掉，再放到0.1％的高锰酸钾溶液中消毒2-3min中后捞出，放到报纸上凉干，然后用水苔直接种在透明塑料杯中。
相比于现有技术，本发明的蝴蝶兰与钻喙兰远缘杂交种子无菌播种及其育苗的方法的有益效果在于：
(1)利用同一配方培养基(花宝1号3.0g/L+6-BA2.0mg/L+AD2.0mg/L+10.0％椰子汁+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)实现了原球茎增殖与分化，减少了转瓶环节，缩短了成苗时间，降低了污染率，提高了成苗率。
(2)在整个培养过程均添加了适量的椰子汁，有利于种子萌发，促进原球茎增殖及壮苗生根。
(3)在移栽之前先在温室大棚中炼苗20-30d，有利于瓶苗适应温室大棚的环境，提高种苗移栽成活率。
总之，本发明中种子萌发率高，成苗数多，成苗时间短，种苗质量好，种苗移栽成活率达95.0％，解决了蝴蝶兰远缘杂交过程中种子因亲和性不易成功，且在自然条件下极难萌发、不易成苗的难题，为蝴蝶兰远缘杂交优良品种的选育奠定了基础。
本发明以蝴蝶兰‘聚宝红玫瑰’(Phalaenopsis Jiuhbao Red Rose)为母本，钻喙兰(Rhynchostylis retusa)为父本展开了属间远缘杂交育种，解决了远缘杂交种子无菌播种、种子萌发、原球茎增殖与分化、壮苗生根、炼苗移栽等繁殖与育苗的关键技术问题，获得了大量杂种后代植株，为远缘杂交优良品种的选育奠定了基础。
具体实施方式
有鉴于此，本发明具体实施方式中提供的一种蝴蝶兰与钻喙兰远缘杂交种子无菌播种及其育苗的方法，具体包括以下步骤：
(1)人工授粉:以蝴蝶兰为母本，钻喙兰为父本进行杂交，选择新鲜有活力的花朵，用消毒过的镊子去除母本唇瓣及合蕊柱上的花粉块，同时取父本新鲜的花粉块置于母本蕊腔内；授粉100-120d后，采收未开裂的成熟果荚进行无菌播种；
(2)果荚预处理及种子播种：果荚经流水冲洗后，在超净工作台上用75％酒精擦洗干净，再用0.1％HgCl2溶液灭菌10-12min，无菌水冲洗3～5次，无菌滤纸吸干残余水分后切开果荚，然后将种子播种于萌发培养基上培养；
(3)种子萌发：将种子播种于所述萌发培养基上培养，培养温度25～28℃，前期暗培养或有散射光即可，后期光照强度1000-1500lx，光照时间12h/d；
(4)原球茎增殖与分化：当种子萌发成嫩绿色原球茎后，转接到增殖与分化培养基上进行培养，培养温度25～28℃，光照强度1500～2000lx，光照时间12h/d；
(5)壮苗生根培养：将原球茎分化成的幼苗小心切下，转接到壮苗生根培养上培养，培养温度25～28℃，光照强度1500～2000lx，光照时间12h/d；
(6)炼苗移栽：当叶数2～4片，叶长3～5cm，叶宽1～2cm，根长2～5cm，根数2～4条时，即可放到具自然光散射的温室大棚进行炼苗驯化，炼苗大棚温度控制在22℃～28℃，炼苗20～30天便可出瓶移栽；种植温度保持22～28℃，湿度保持60～70％。
上述各个步骤中涉及到的处理方式、培养条件、培养时间和培养基的成分都会根据具体需要进行适当的调整。
其中，所述增殖与分化培养基为Hyponex(花宝1号)3.0g/L+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)2.0mg/L+AD(腺嘌呤)2.0mg/L+10.0％椰子汁+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH值5.5-5.8。
其中，所述壮苗生根培养基为Hyponex(花宝1号)3.0g/L+NAA(萘乙酸)0.5mg/L+10.0％椰子汁+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH值5.5-5.8。
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其中，所述步骤6)中的移载具体为：出瓶时将瓶塞取下，用镊子将组培苗从瓶内夹出，放到清水中将附带的培养基清洗掉，再放到0.1％的高锰酸钾溶液中消毒2-3min中后捞出，放到报纸上凉干，然后用水苔直接种在透明塑料杯中。
另外，由于培养过程受诸如温度、光照、湿度等多种因素的影响，因而，在本发明的各步骤中，处理方式、培养条件、培养时间都会根据具体需要进行适当的调整。
为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。
采用蝴蝶兰‘聚宝红玫瑰’(Phalaenopsis Jiuhbao Red Rose)为母本，钻喙兰(Rhynchostylis retusa)为父本进行属间远缘杂交，杂交种子无菌播种及种苗繁殖和育苗，具体步骤如下：
(1)人工授粉:以蝴蝶兰‘聚宝红玫瑰’为母本，钻喙兰为父本进行远缘杂交，5月双亲同时开花时，选择新鲜有活力的花朵，用消毒过的镊子去除母本唇瓣及合蕊柱上的花粉块，同时取父本新鲜的花粉块置于母本蕊腔内，授粉后在杂交的花朵挂上标签并注明杂交组合及授粉时间。授粉100-120d后，采收未开裂的成熟果荚进行无菌播种。
(2)果荚预处理及种子播种：采收授粉100-120d后未开裂的成熟果荚，经流水冲洗后，在超净工作台上用75％酒精擦洗干净，再用0.1％HgCl2溶液灭菌10～12min，无菌水冲洗3～5次，无菌滤纸吸干残余水分后，左手用镊子夹住果荚，右手持消毒过的手术刀将果荚纵向切开果皮，露出种子，再用另一把镊子直接夹取种子均匀撒播于萌发培养基上；所述萌发培养基为Hyponex(花宝1号)3.0g/L+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)2.0mg/L+NAA(萘乙酸)1.0mg/L+10.0％椰子汁+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH值5.5-5.8。
(3)种子播种：将种子播种于所述萌发培养基上培养，培养温度25～28℃，前期暗培养或有散射光即可，后期光照强度1000-1500lx，光照时间12h/d。培养30d后开始膨胀，约60d后膨大形成白色球形茎，继续培养30d种胚萌发成嫩绿色原球茎。
(4)原球茎增殖与分化：将萌发至3～5mm的原球茎转接到Hyponex(花宝1号)3.0g/L+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)2.0mg/L+AD(腺嘌呤)2.0mg/L+10.0％椰子汁+蔗糖30g/L+琼脂7g/L增殖与分化培养基上培养；培养温度25～28℃，光照强度1500～2000lx，光照时间12h/d；培养100d后增殖系数达3.1。
(5)壮苗生根培养：将原球茎分化形成2～4cm高、有新叶长出的幼苗小心切下，转接到Hyponex(花宝1号)3.0g/L+NAA(萘乙酸)0.5mg/L+10.0％椰子汁+蔗糖30g/L+琼脂7g/L壮苗生根培养上培养；培养温度25～28℃，光照强度1500～2000lx，光照时间12h/d；培养100d小苗生根率可达93.7％。
(6)炼苗移栽：当叶数2～4片，叶长3～5cm，叶宽1～2cm，根长2～5cm，根数2～4条时，即可放到具自然光散射的温室大棚进行炼苗驯化，炼苗大棚温度控制在22℃～28℃，炼苗20～30天便可出瓶。出瓶时将瓶塞取下，用镊子将组培苗从瓶内夹出，放到清水中将附带的培养基清洗掉，再放到0.1％的高锰酸钾溶液中消毒2-3min中后捞出，放到报纸上凉干，然后用水苔直接种在透明塑料杯中。种植温度保持22～28℃，湿度保持60～70％。定植2d后进行叶面喷水和喷洒0.1％多菌灵等杀菌剂，以后常规栽培管理，实生苗移栽60d后成活率达95.0％。
相比于现有技术本发明的方法具有以下优点：
(1)利用同一配方培养基(花宝1号3.0g/L+6-BA2.0mg/L+AD2.0mg/L+10.0％椰子汁+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)实现了原球茎增殖与分化，减少了转瓶环节，缩短了成苗时间，降低了污染率，提高了成苗率。
(2)在整个培养过程均添加了适量的椰子汁，有利于种子萌发，促进原球茎增殖及壮苗生根。
(3)在移栽之前先在温室大棚中炼苗20-30d，有利于瓶苗适应温室大棚的环境，提高种苗移栽成活率。
总之，本发明中种子萌发率高，成苗数多，成苗时间短，种苗质量好，种苗移栽成活率达95.0％，解决了蝴蝶兰远缘杂交过程中种子因亲和性不易成功，且在自然条件下极难萌发、不易成苗的难题，为蝴蝶兰远缘杂交优良品种的选育奠定了基础。
本发明以蝴蝶兰‘聚宝红玫瑰’(Phalaenopsis Jiuhbao Red Rose)为母本，钻喙兰(Rhynchostylis retusa)为父本展开了属间远缘杂交育种，解决了远缘杂交种子无菌播种、种子萌发、原球茎增殖与分化、壮苗生根、炼苗移栽等繁殖与育苗的关键技术问题，获得了大量杂种后代植株，为远缘杂交优良品种的选育奠定了基础。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (2)
1.一种蝴蝶兰与钻喙兰远缘杂交种子无菌播种及其育苗的方法, 其特征在于该方法包括以下步骤：
（1）人工授粉:以蝴蝶兰为母本，钻喙兰为父本进行杂交，选择新鲜有活力的花朵，用消毒过的镊子去除母本唇瓣及合蕊柱上的花粉块，同时取父本新鲜的花粉块置于母本蕊腔内；授粉100-120 d后，采收未开裂的成熟果荚进行无菌播种；
（2）果荚预处理及种子播种：果荚经流水冲洗后，在超净工作台上用75%酒精擦洗干净，再用0.1%HgCl2溶液灭菌10-12min，无菌水冲洗3～5次，无菌滤纸吸干残余水分后切开果荚，然后将种子播种于萌发培养基上培养；
（3）种子萌发：将种子播种于所述萌发培养基上培养，培养温度25～28℃，前期暗培养或有散射光即可，后期光照强度1000-1500lx，光照时间12h/d；所述萌发培养基为Hyponex(花宝1号)3.0g/L+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)2.0mg/L+NAA(萘乙酸)1.0 mg/L+10.0%椰子汁+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH值5.5-5.8；
（4）原球茎增殖与分化：当种子萌发成嫩绿色原球茎后，转接到增殖与分化培养基上进行培养，培养温度25～28℃，光照强度1500～2000lx，光照时间12h/d；所述增殖与分化培养基为Hyponex(花宝1号)3.0g/L+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)2.0mg/L+腺嘌呤2.0mg/L+10.0%椰子汁+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH值5.5-5.8；
（5）壮苗生根培养：将原球茎分化成的幼苗小心切下，转接到壮苗生根培养上培养，培养温度25～28℃，光照强度1500～2000lx，光照时间12h/d；所述壮苗生根培养基为Hyponex(花宝1号)3.0g/L+NAA(萘乙酸)0.5mg/L+10.0%椰子汁+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH值5.5-5.8；
（6）炼苗移栽：当叶数2～4片，叶长3～5cm，叶宽1～2cm，根长2～5cm，根数2～4条时，即可放到具自然光散射的温室大棚进行炼苗驯化，炼苗大棚温度控制在22℃～28℃，炼苗20～30天便可出瓶移栽；种植温度保持22～28℃，湿度保持60～70%。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤6）中的移栽具体为：出瓶时将瓶塞取下，用镊子将组培苗从瓶内夹出，放到清水中将附带的培养基清洗掉，再放到0.1%的高锰酸钾溶液中消毒2-3min中后捞出，放到报纸上凉干，然后用水苔直接种在透明塑料杯中。
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