CN112586354A - 海南钻喙兰菌根化育苗方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物培育技术领域，具体公开了一种海南钻喙兰菌根化育苗方法，包括以下步骤：S1、培育海南钻喙兰组培瓶苗；S2、制备固体菌剂；通过优势菌株的菌丝获得活化菌饼；优势菌株的序列为SEQ ID NO:1；S4、制备液体菌剂：将S2得到的活化菌饼制成液体菌剂；S3、获得无污染共生瓶苗：将S2的活化菌饼放入S1培育的海南钻喙兰组培瓶苗中，获得无污染共生瓶苗；S4、制备液体菌剂；S5、采用S4制备的液体菌剂制备栽培基质；S6、组培瓶苗移栽。本发明提供的育苗方法可实现海南钻喙兰种苗的产业化育苗，育苗成本低，育苗方法简单。
Description
技术领域
本发明属于植物培育技术领域，尤其涉及一种海南钻喙兰菌根化育苗方法。
背景技术
海南钻喙兰(Rhynchostylis gigantea(Lindl.)Ridl)是兰科(Orchidaceae)海南钻喙兰属(Rynchostylis)一种附生型兰花，在中国仅分布于海南省，为国家二级保护珍稀野生种。海南钻喙兰的花期为1-2月，正值中国及一部分亚洲国家的新春佳节，花朵有浓香味，花期长，颇受广大消费者喜爱。海南钻喙兰具有花朵数多、花朵厚、肉质感佳、耐热性强、易杂交和亲和力好等优良性状，观赏性、经济和研究价值均非常高。
近年来，由于大量挖采等原因，海南钻喙兰的数量大大减少，所以以保护为目的的育苗方法越来越多，但是现有的培育方法复杂，培育成本较高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种培育方法简单，培育成本低的海南钻喙兰菌根化育苗方法。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
海南钻喙兰菌根化育苗方法，包括以下步骤：
S1、培育海南钻喙兰组培瓶苗；
S2、制备固体菌剂；通过优势菌株的菌丝获得活化菌饼；优势菌株的序列为SEQ IDNO:1；
S3、获得无污染共生瓶苗：将S2的活化菌饼放入S1培育的海南钻喙兰组培瓶苗中，获得无污染共生瓶苗；
S4、制备液体菌剂：将S2得到的活化菌饼制成液体菌剂；
S5、采用S4制备的液体菌剂制备栽培基质；
S6、组培瓶苗移栽：将S1得到的组培瓶苗和S3得到的无污染共生瓶苗的瓶盖打开，移至常温下炼苗2-4周，将瓶苗取出，洗去附着在根部的培养基，栽种于S5制备的栽培基质中，获得菌根化驯化苗。
本技术方案的原理和有益效果在于：
(1)本技术方案在获得海南钻喙兰无污染共生瓶苗和组培瓶苗移栽前，分别加入海南钻喙兰优势菌根制得的固体菌剂和液体菌剂使海南钻喙兰组培瓶苗的根系菌根化，为海南钻喙兰种植提供优质的驯化苗。
本技术方案中的固体菌剂和液体菌剂是优势菌株繁殖和保存的载体，优势菌株依靠液体菌剂和固体菌剂的营养快速扩繁，固体菌剂较液体菌剂的保存时间长，液体菌剂较固体菌剂的使用面积广，所以采用固体菌剂建立优势菌株-海南钻喙兰共生体系无污染共生瓶苗，采用液体菌剂制作栽培基质。
菌根化组培瓶苗移栽后的成活率可达95％以上，并且生长量大，生长势旺。
(2)本技术方案育苗方法简单，育苗成本低，操作性强，材料简单易得，效果显著，可实现海南钻喙兰种苗的产业化育苗。
(3)本技术方案所培育的海南钻喙兰是钻喙兰属的一个种，但本技术方案同样也适用于培育钻喙兰。
优选地，S1是采用海南钻喙兰成熟荚果的种子进行培养，种子萌发培养基为花宝1号3-6g/L、水解乳蛋白0.5-3g/L和活性炭0.5-2g/L；继代培养基为萌发培养基的基础上施加1-4mg/L 6-BA和0.05-0.20mg/L NAA；增殖方法为茎段诱导丛生芽增殖。
花宝1号中的N:P:K质量配比＝7:6:19，为种子萌发和组培瓶苗生长提供必备的N、P和K营养物质。活性炭能够吸附酚类物质，防止外植体褐化。水解乳蛋白是多种氨基酸的混合物，对胚状体、不定芽的分化均具有良好的促进作用。花宝1号、活性炭和水解乳蛋白三者协同共同提高种子萌发率。
优选地，S3是将菌丝在PDA培养基中进行培养，PDA培养基的制备方法如下：首先对去皮马铃薯180-220g切块得到去皮马铃薯块，然后采用去离子水对去皮马铃薯块煮18-22min后，过滤，往含马铃薯汁的滤液中加入葡萄糖18-22g和琼脂粉18-22g，再次加热到琼脂粉溶解，最后在120℃下灭菌备用。
本技术方案采用PDA培养基是马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称，即PotatoDextrose Agar(Medium)，是常用的固体培养基，宜培养酵母菌、霉菌、蘑菇等真菌。
优选地，S4是在无菌条件下，用灭菌牙签转至PD培养基后，再通过摇床培养，PD培养基的制备方法如下：首先对去皮马铃薯180-220g切块得到去皮马铃薯块，然后采用去离子水对去皮马铃薯块煮18-22min后，过滤，往含马铃薯汁的滤液中加入葡萄糖18-22g，再次加热到葡萄糖溶解，最后灭菌备用。
本技术方案PD培养基为不加琼脂粉的PDA培养基，也就是液体培养基，适合制作悬浮培养液。
优选地，S5中无污染共生瓶苗的培养条件是：置于温度24-28℃、光照周期12/12h、紫外灯光照强度1400-1800lx的人工培养箱培养，共生培养70-100d。
共生体系的培养条件设计原理在于：海南钻喙兰组培瓶苗和优势菌株的最适宜生长温度均为24-28℃，紫外灯光照强度1400-1800lx，温度高于28℃或者温度低于24℃，以及紫外灯光照强度高于1800lx或紫外灯光照强度低于1400lx，海南钻喙兰组培瓶苗和优势菌株都无法正常生长，无法获得无污染共生瓶苗。
本技术方案的光照周期12/12h是指白天12小时，晚上12小时。
优选地，S5的栽培基质包括水苔、珍珠岩、多菌灵和液体菌剂。
本技术方案中的水苔较轻，保肥性和保水性好，不积水；珍珠岩富含矿物质，可以为组培苗提供生长必须的矿物质，并且通风，透气，可以满足海南钻喙兰生长需求；多菌灵可以杀除杂菌。水苔和珍珠岩的质量比＝3:1；多菌灵为700-800倍液，喷匀水苔和珍珠岩，晾晒4-5小时，即可种植海南钻喙兰。三者混合，既保水，透气，提供必要矿物质，又能杀除杂菌，为海南钻喙兰提供良好的生长环境。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例所用到的花宝1号为莱钡特生物货号为TB18332634393的花宝1号；水解乳蛋白为北京梦怡美生物科技有限公司生产的货号为259962的水解乳蛋白；活性炭为江苏中远活性炭有限公司生产的4-8目活性炭；6-BA是6-苄氨基腺嘌呤，购买于郑州中科化工；NAA为萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid)，是上海翊圣生物科技有限公司型号为41016ES25的NAA。
实施例1
本实施例提供一种海南钻喙兰菌根化育苗方法，具体包括以下步骤：
S1、培育海南钻喙兰组培瓶苗
①种子萌发：选取海南钻喙兰成熟荚果，用自来水冲洗干净，在无菌条件下用0.1％HgCl2消毒5min，无菌水冲洗数次后，取出种子，将种子转移到种子萌发培养基上均匀分布，在温度(25±2)℃，紫外灯光照强度1200～1500lx，光照10h/d条件下培育30d后萌发，得到无菌苗茎段。
具体地，种子萌发培养基制备时，将花宝1号3g/L、水解乳蛋白0.5g/L和活性炭0.5g/L充分混合即可。
②继代增殖培养：将长势良好、芽饱满的无菌苗茎段加入继代培养基中进行培养得到继代苗。
继代培养基的筛选步骤如下表1所示：将长势良好、芽饱满的无菌苗茎段分别加入继代培养基中A1-A3、B和C中，隔20d记录茎叶生长情况和生根情况。
根据茎叶生长情况和生根情况，本实施例优选采用1-4mg/L 6-BA+0.05-0.20mg/LNAA作为继代培养基，更为优选地，本实施例采用2mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA作为继代培养基。
③生根培养基：选取长势良好1-2株的继代苗，接入不同浓度IBA(吲哚丁酸，购买于北京百奥莱博科技有限公司)的MS培养基中，诱导生根，20天后统计不同培养基生根数，具体实验数据如下表2所示。
| 生根培养基 | 接种数(株) | 生根株数(株) | 生根率(％) |
| A组-生根培养基：MS+IBA 0mg/L+活性炭1g/L | 30 | 25 | 83 |
| B组-生根培养基：MS+IBA 0.5mg/L+活性炭1g/L | 30 | 30 | 100 |
| C组-生根培养基：MS+IBA 1.0mg/L+活性炭1g/L | 30 | 28 | 93 |
基于表2，本实施例的生根培养基选取MS+IBA 0.5mg/L+活性炭1g/L作为生根培养基，采用生根培养基培养30天后，炼苗2-3周后用水苔作为基质进行壮苗移栽。
S2、制备固体菌剂
①用灭菌的牙签挑过优势菌株(序列为SEQ ID NO:1)的菌丝于PDA培养基培养，28℃恒温培养光照12-14h，灭菌备用1600lux，待菌丝长满平板后，获得活化菌饼。接种时从菌落边缘打取直径为0.5cm的菌饼，放入S1培育的海南钻喙兰组培瓶苗中，获得无污染共生瓶苗。
PDA培养基制备：首先对去皮马铃薯180-220g切块得到去皮马铃薯块，然后采用去离子水对去皮马铃薯块煮18-22min后，过滤，往含马铃薯汁的滤液中加入葡萄糖18-22g和琼脂粉18-22g，再次加热到琼脂粉溶解，最后在120℃下灭菌18-25min备用。进一步优选的PDA培养基的组成是：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉20g和水1L。在120℃下灭菌20min备用。
S3、获得无污染共生瓶苗
利用打孔器打取S3得到的活化菌饼1片，转接至S1培育的海南钻喙兰组培瓶苗中，然后重分离经鉴定(再次分离是验证是否接种成功)，获得原接种菌株，获得无污染共生瓶苗。
具体地，优势菌株-海南钻喙兰共生体系无污染共生瓶苗的培养条件如下：置于温度24-28℃、光照周期12/12h、紫外灯光照强度为1400-1800lx的人工培养箱培养，共生培养70-100d。进一步优选地，在温度25℃、紫外灯光照强度1600lx的条件下的长势最佳。
S4、制备液体菌剂
将固体菌剂制备过程中的活化菌板，于无菌条件下，用灭菌牙签转至液体培养基(PD培养基)中，在三角瓶内进行摇床培养(200r/min，28℃)，制成液体菌剂，放置28℃备用。
PD培养基制备：首先对去皮马铃薯180-220g切块得到去皮马铃薯块，然后采用去离子水对去皮马铃薯块煮熟，过滤，加入葡萄糖18-22g，加热，溶解，最后在120℃下灭菌18-22min备用。进一步优选的PD培养基的组成是：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g和水1L。在120℃下灭菌20min备用。
S5、采用S4制备的液体菌剂制备栽培基质；
①将水苔、珍珠岩和多菌灵拌匀，得到基础栽培基质；多菌灵CAS号为10605-21-7，购买于上海吉至生化科技有限公司。
栽培基质的筛选方法如下表3所示，20天后统计成活株数和成活率。
基于表3的成活株数和成活率，本实施例优选采用B2组的栽培基质。
②将2L S4制备的液体菌剂倒入基础栽培基质中，将液体菌剂的菌丝充分研磨拌匀，薄膜密封发酵2周，得到栽培基质。
S6、组培瓶苗移栽：将S1得到的组培瓶苗和S3得到的无污染共生瓶苗的瓶盖打开，移至常温下炼苗2-4周，将瓶苗取出，洗去附着在根部的培养基，栽种于S5制备的栽培基质中，在遮光度50％～60％、湿度达80％以上的温室中，2个月后获得菌根化驯化苗。
实施例2-5
实施例2-5与实施例1的主要区别在于：种子萌发培养基用量、继代培养基用量等不同，实施例1-5的具体区别如下表4所示：
空白对照
设置不接优势菌株的空白对照(S6中，是将S1得到的组培瓶苗和S3得到的无污染共生瓶苗移栽在基础栽培基质)，设置3组重复，每个重复10株，置于人工培养箱培养(温度25℃、光照周期12/12h、灭菌备用1600lx)。
实验一
培养90天后，统计空白对照和实施例1-5的组培瓶苗叶片生长情况、根生长状况和真菌生长状况等数据，鲜重增长率＝(处理后鲜重-处理前鲜重)/处理前鲜重×100。差异显著性分析采用SSPS16.8统计软件处理分析，利用Duncan法进行多重比较，具体实验数据如表5所示。
结论：
(1)将实施例1-5进行菌根化育苗发现：实施例3植株的组培瓶苗生长状况、叶片生长情况、根生长状况和真菌生长状况等最佳。
(2)与将S1得到的组培瓶苗和S3得到的无污染共生瓶苗移栽在基础栽培基质(空白对照)，实施例1-5的组培瓶苗生长状况、叶片生长情况、根生长状况和真菌生长状况较佳。实施例1-5的菌根化驯化苗存活率较空白对照至少高出13.09％，(实施例1-5)菌根化驯化苗存活率达95％以上。
实验二
为了获得优势菌株，本实施例对6种内生真菌菌株的rDNA-ITS PCR扩增产物测序后提交至GenBank进行Blast同源比对，所得结果下表6，海南钻喙兰菌根真菌涉及4个属分别为毛壳菌属(Chaetomium sp.)、镰刀菌属(Chaetomium globosum)、拟隐孢壳属(Cryptosporiopsis sp.)、链格孢属(Alternaria alternata)，其中毛壳菌属(Chaetomiumsp.)占比例最大为33％，最终确定为优势菌种(序列为SEQ ID NO:1)。
基于表6的实验结果，最终确定优势菌株的形态特征为：边缘总体呈现花边型，边缘不整齐，中间凹陷，短戎状菌丝，背面呈暗灰色，中心向四周辐射开散。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (8)
1.海南钻喙兰菌根化育苗方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、培育海南钻喙兰组培瓶苗；
S2、制备固体菌剂；通过优势菌株的菌丝获得活化菌饼；优势菌株的序列为SEQ ID NO:1；
S3、获得无污染共生瓶苗：将S2的活化菌饼放入S1培育的海南钻喙兰组培瓶苗中；
S4、制备液体菌剂：将S2得到的活化菌饼制成液体菌剂；
S5、采用S4制备的液体菌剂制备栽培基质；
S6、组培瓶苗移栽：将S1得到的组培瓶苗和S3得到的无污染共生瓶苗的瓶盖打开，移至常温下炼苗2-4周，将瓶苗取出，洗去附着在根部的培养基，栽种于S5制备的栽培基质中，获得菌根化驯化苗。
2.根据权利要求1所述的海南钻喙兰菌根化育苗方法，其特征在于，S1是采用海南钻喙兰成熟荚果的种子进行培养，种子萌发培养基为花宝1号3-6g/L、水解乳蛋白0.5-3g/L和活性炭0.5-2g/L；继代培养基为萌发培养基的基础上施加1-4mg/L 6-BA和0.05-0.20mg/LNAA；增殖方法为茎段诱导丛生芽增殖。
3.根据权利要求1或2所述的海南钻喙兰菌根化育苗方法，其特征在于，S3是将菌丝在PDA培养基中进行培养，PDA培养基的制备方法如下：首先对去皮马铃薯180-220g切块得到去皮马铃薯块，然后采用去离子水对去皮马铃薯块煮18-22min后，过滤，往含马铃薯汁的滤液中加入葡萄糖18-22g和琼脂粉18-22g，再次加热到琼脂粉溶解，最后在120℃下灭菌备用。
4.根据权利要求1或2所述的海南钻喙兰菌根化育苗方法，其特征在于，S4是在无菌条件下，用灭菌牙签转至PD培养基后，再通过摇床培养，PD培养基的制备方法如下：首先对去皮马铃薯180-220g切块得到去皮马铃薯块，然后采用去离子水对去皮马铃薯块煮18-22min后，过滤，往含马铃薯汁的滤液中加入葡萄糖18-22g，再次加热到葡萄糖溶解，最后灭菌备用。
5.根据权利要求3所述的海南钻喙兰菌根化育苗方法，其特征在于，S4是在无菌条件下，用灭菌牙签转至PD培养基后，再通过摇床培养，PD培养基的制备方法如下：首先对去皮马铃薯180-220g切块得到去皮马铃薯块，然后采用去离子水对去皮马铃薯块煮18-22min后，过滤，往含马铃薯汁的滤液中加入葡萄糖18-22g，再次加热到葡萄糖溶解，最后灭菌备用。
6.根据权利要求1、2或5所述的海南钻喙兰菌根化育苗方法，其特征在于，S5中无污染共生瓶苗的培养条件是：置于温度24-28℃、光照周期12/12h、紫外灯光照强度1400-1800lx的人工培养箱培养，共生培养70-100d。
7.根据权利要求3所述的海南钻喙兰菌根化育苗方法，其特征在于，S5中无污染共生瓶苗的培养条件是：置于温度24-28℃、光照周期12/12h、紫外灯光照强度1400-1800lx的人工培养箱培养，共生培养70-100d。
8.根据权利要求1、2、5或7所述的海南钻喙兰菌根化育苗方法，其特征在于，S5的栽培基质包括水苔、珍珠岩、多菌灵和液体菌剂。
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