CN107047320B - 一种大花胡麻草组织培养方法 - Google Patents
一种大花胡麻草组织培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种大花胡麻草组织培养方法,包括以下步骤:(1)外植体选择和预处理;(2)种子萌发培养;(3)实生苗分化增殖培养;(4)分割苗诱导生根培养;(5)炼苗与移栽。本发明通过对大花胡麻草组织培养过程中种子消毒方法、增殖培养方法、壮苗生根方法进行了改进,解决了种子易污染、繁殖系数低、易褐化等问题,通过本方法培养出的大花胡麻组培苗繁殖系数高、生长速度快、移栽成活率高;此外,本发明提供的方法简便易行、可操作性强、重现性好。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域,涉及一种培养方法,更具体的涉及一种大花胡麻草组织培养方法。
背景技术
大花胡麻草(Centranthera grandiflora Bench.),玄参科胡麻草属植物,别名化血丹、红根野蚕豆、野蚕豆根、小红药、灵芝草等,主要分布于我国云南、贵州、广西等地及印度、缅甸等地。大花胡麻草生物学特征为全株被刚毛,须根为锈红色,茎部刚硬,具分枝;叶片对生,无叶柄,长圆形或条形,全缘;花腋生,花萼为佛焰苞状,苞片为叶状,花冠为管状,棕黄色。为云南民间名贵的地方中药,药用根,经化学分析鉴定其根部含环烯醚萜苷如桃叶珊瑚苷、玉叶金花苷、8-表番土鳖酸、8-表番土鳖碱、玉叶金花酸、梓醇等化学成分及杜鹃红素、甘露醇等化合物,具有消肿散瘀、止血止痛等作用,可用于治疗女性痛经、闭经及风湿骨痛、跌打损伤,还对心脑血管疾病具有显著疗效,具有很高的开发价值。
由于大花胡麻草根经济价值高,其市场需求逐年增加,而目前野生资源已被大量开采。大花胡麻草对生态环境要求严格,其种子发芽率低,生长慢,远不能满足需求。应用组织培养技术进行快速繁殖并成功生根移栽,对于解决资源紧缺和实现产业化开发具有重要的意义。前人在大花胡麻草的组织培养关键技术环节已进行了相关研究,但其组织培养过程中诸如外植体污染严重、繁殖系数低等问题还没得到有效解决。
发明内容
针对上述现有技术中的不足,本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、可操作性强,且可以提高繁殖系数、移栽成活率高的大花胡麻草组织培养方法。
为实现上述目的提供一种大花胡麻草组织培养方法,本发明采用了以下技术方案:
一种大花胡麻草组织培养方法,该方法包括:(1)外植体选择和预处理;(2)种子萌发培养;(3)实生苗分化增殖培养;(4)分割苗诱导生根培养;(5)炼苗与移栽;
所述外植体选择和预处理步骤中,选择野外收集的大花胡麻草种子作为外植体,然后对种子进行预处理;
所述种子萌发培养步骤中,将经过处理的大花胡麻草种子接种于种子萌发培养基进行培养,培养2-3周后获得无菌实生苗;
所述实生苗分化增殖培养步骤中,选择1-2cm高的无菌实生苗在超净工作台上接种于增殖培养基进行继代培养,培养3-4周后获得组培丛芽;
所述分割苗诱导生根培养步骤中,将获得的4-6cm长苗的组培丛芽进行分割处理,将分割苗接种于生根培养基中进行诱导生根培养,获得组培苗;
所述炼苗与移栽步骤中,当根长达到2-5cm时,进行炼苗3-5天,后取出组培苗,进行移栽。
优选的,所述外植体选择和预处理步骤中:在收集的大花胡麻草种子中,挑选种荚未开裂的种子作为外植体,然后进行预处理;
所述预处理包括前处理与消毒灭菌处理步骤;
其中,所述前处理步骤为:先用75wt%酒精擦拭种荚表面,将种子破壳取出后置于灭菌的1.5mL的离心管中,加入1mL无菌水浸泡1-2h,待种子吸足水分后,在1000rpm的条件下离心3-5min,倒掉上清液,准备下一步消毒;
所述消毒灭菌处理步骤为:将前处理后的种子置于超净工作台中,用75%的酒精消毒30-60秒,再用体积浓度为0.1%的升汞浸泡8-10min,后使用无菌水冲洗6-8次。
优选的,所述种子萌发培养步骤中,所述种子萌发培养基为在MS培养基中添加蔗糖20-30g/L、琼脂粉6-7g/L,并调节PH至5.5-6.0所得的培养基;所述培养基置于透明玻璃培养瓶中并给予光照10-12h/天,其中,光照强度为1500-2000LX,温度为25℃±2℃,在此条件下培养2-3周诱导种子萌发出苗。
进一步的,所述的种子萌发培养基的pH调节至5.8。
优选的,所述实生苗分化增殖培养步骤中,所述增殖培养基为在WPM培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.4-0.6mg/L、萘乙酸(NAA)0.04-0.06mg/L、蔗糖20-30g/L以及琼脂粉6-7g/L,并调节PH至5.5-6.0所得的培养基;所述培养基置于透明玻璃培养瓶中并给予光照12-14h/天,其中,光照强度为1500-2000LX,温度为25℃±2℃。
优选的,所述分割苗诱导生根培养步骤中,所述生根培养基为在WPM培养基中添加萘乙酸(NAA)0.1-0.3mg/L,蔗糖20-30g/L以及琼脂粉6-7g/L,并调节PH至5.5-6.0所得的培养基;所述培养基置于透明玻璃培养瓶中并给予光照12-14h/天,光照强度为1500-2000LX,温度为25℃±2℃。
进一步的,所述的WPM培养基以一升为量计算由如下成分组成:NH4NO3 400mg·L-1,Ca(NO3)2·4H2O 556mg·L-1,K2SO4 990mg·L-1,CaCl2·2H2O 96mg·L-1,KH2PO4 170mg·L-1,Na2MoO4·2H2O 0.25mg·L-1,MgSO4·7H2O 370mg·L-1,MnSO4·H2O 22.4mg·L-1,ZnSO4·7H2O 8.6mg·L-1,CuSO4·5H2O 0.25mg·L-1,FeSO4·7H2O 27.8mg·L-1,Na2-EDTA37.3mg·L-1;肌醇100mg·L-1,维生素B1 1.0mg·L-1,烟酸0.5mg·L-1,维生素B6 0.5mg·L-1,甘氨酸2.0mg·L-1,蔗糖20g·L-1,琼脂6g·L-1;pH调节至5.8。
进一步的,所述的增殖培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/L、萘乙酸0.05mg/L;所述生根培养基中含有萘乙酸0.2mg/L。
进一步的,所述的种子萌发培养基、增殖培养基、生根培养基中分别含有活性炭0.5-0.8g/L。
优选的,在步骤(4)生根培养结束后,取出的组培苗,先洗净根上的培养基,然后将苗移植到基质中,并用透气盖遮盖,保持空气湿度在85%-90%,至新根长出(约20天),正常养护,移栽成活率可达80%。
本发明的有益效果在于:
1、本发明改进了外植体消毒程序、分化增殖培养基本培养基及添加激素,提高繁殖效率,具体通过对大花胡麻草组织培养过程中种子消毒方法、增殖培养方法、诱导生根方法进行改进,解决了种子易污染、繁殖系数低、易褐化问题,通过本方法培养出的大花胡麻组培苗繁殖系数高、生长速度快、移栽成活率高;此外,本发明提供的方法简便易行、可操作性强、重现性好。
2、本发明采用一套系统科学的组织培养方法,简化了传统的种子消毒步骤,种子处理更简便,种子成活率更高。
3、本发明根据大花胡麻草的生长习性采取WPM培养基再生苗长势好,繁殖系数高、生长速度快、再生无玻璃化现象。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本技术领域的普通技术人员应该理解的是,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
实施例1
一种大花胡麻草组织培养方法,其首先采用离体组织培养获得组培苗,然后炼苗、移栽即得大花胡麻草种苗,其中离体组织培养包括如下步骤:
(1)、外植体选择和预处理步骤:挑选种荚未开裂的大花胡麻草种子为起始材料,用75%酒精擦拭表面,将种子破壳取出后用作组织培养繁殖的外植体。将该外植体置于灭菌的1.5ml离心管中,加入1ml无菌水浸泡1-2h,待种子吸足水分后,1000rpm离心3-5min,倒掉上清液,在75%的酒精溶液中进行30-60s消毒处理,然后在重量体积比浓度为0.1%的升汞溶液中进行8-10min的杀菌处理,再用无菌水冲洗6-8次,完成对所述大花胡麻草种子的消毒灭菌处理。
(2)、种子萌发培养步骤:在超净工作台上将种子接种于种子萌发培养基进行培养,培养在每天光照10-12h,光照强度为1500-2000LX以及温度为25℃±2℃的条件下进行,培养2-3周,获得无菌实生苗,其中种子培养基为在MS基本培养基中添加有蔗糖25g/L、活性炭0.6g/L、琼脂粉6.5g/L,并调节pH为5.8所得的培养基。
(3)实生苗分化增殖培养步骤:将萌发后1-2cm高的大花胡麻草无菌实生苗接种于增殖培养基,培养3-4周,获得组培丛芽,其中,增殖培养基为在WPM培养基中添加有6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.5mg/L、萘乙酸(NAA)0.05mg/L、活性炭0.6g/L、蔗糖25g/L以及琼脂粉6.5g/L,并调节PH至5.8所得的培养基。
(4)、分割苗诱导生根培养步骤:将获得的组培丛芽中4-6cm长苗分割后接种于生根培养基中进行生根培养,其中所述生根培养基为在WPM培养基中添加萘乙酸(NAA)0.2mg/L,蔗糖25g/L以及活性炭0.6g/L、琼脂粉6.5g/L,并调节PH至5.8所得的培养基。
实施例2
一种大花胡麻草组织培养方法,其首先采用离体组织培养获得组培苗,然后炼苗、移栽即得大花胡麻草种苗,其中离体组织培养包括如下步骤:
(1)、外植体选择和预处理步骤:挑选种荚未开裂的大花胡麻草种子为起始材料,用75%酒精擦拭表面,将种子破壳取出后用作组织培养繁殖的外植体。将该外植体置于灭菌的1.5ml离心管中,加入1ml无菌水浸泡1-2h,待种子吸足水分后,1000rpm离心3-5min,倒掉上清液,在75%的酒精溶液中进行30-60s消毒处理,然后在重量体积比浓度为0.1%的升汞溶液中进行8-10min的杀菌处理,再用无菌水冲洗6-8次,完成对所述大花胡麻草种子的消毒灭菌处理。
(2)、种子萌发培养步骤:在超净工作台上将种子接种于种子萌发培养基进行培养,培养在每天光照10-12h,光照强度为1500-2000LX以及温度为25℃±2℃的条件下进行,培养2-3周,获得无菌实生苗,其中种子培养基为在MS基本培养基中添加有蔗糖30g/L、活性炭0.8g/L、琼脂粉7g/L,并调节pH为6所得的培养基。
(3)实生苗分化增殖培养步骤:将萌发后1-2cm高的大花胡麻草无菌实生苗接种于增殖培养基,培养3-4周,获得组培丛芽,其中,增殖培养基为在WPM培养基中添加有6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.6mg/L、萘乙酸(NAA)0.06mg/L、活性炭0.8g/L、蔗糖30g/L以及琼脂粉7g/L,并调节PH至6所得的培养基。
(4)、分割苗诱导生根培养步骤:将获得的组培丛芽中4-6cm长苗分割后接种于生根培养基中进行生根培养,其中所述生根培养基为在WPM培养基中添加萘乙酸(NAA)0.3mg/L,蔗糖30g/L以及活性炭0.8g/L、琼脂粉7g/L,并调节PH至5.8所得的培养基。
实施例3
一种大花胡麻草组织培养方法,其首先采用离体组织培养获得组培苗,然后炼苗、移栽即得大花胡麻草种苗,其中离体组织培养包括如下步骤:
(1)、外植体选择和预处理步骤:挑选种荚未开裂的大花胡麻草种子为起始材料,用75%酒精擦拭表面,将种子破壳取出后用作组织培养繁殖的外植体。将该外植体置于灭菌的1.5ml离心管中,加入1ml无菌水浸泡1-2h,待种子吸足水分后,1000rpm离心3-5min,倒掉上清液,在75%的酒精溶液中进行30-60s消毒处理,然后在重量体积比浓度为0.1%的升汞溶液中进行8-10min的杀菌处理,再用无菌水冲洗6-8次,完成对所述大花胡麻草种子的消毒灭菌处理。
(2)、种子萌发培养步骤:在超净工作台上将种子接种于种子萌发培养基进行培养,培养在每天光照10-12h,光照强度为1500-2000LX以及温度为25℃±2℃的条件下进行,培养2-3周,获得无菌实生苗,其中种子培养基为在MS基本培养基中添加有蔗糖20g/L、活性炭0.5g/L、琼脂粉6g/L,并调节pH为5.5所得的培养基。
(3)实生苗分化增殖培养步骤:将萌发后1-2cm高的大花胡麻草无菌实生苗接种于增殖培养基,培养3-4周,获得组培丛芽,其中,增殖培养基为在WPM培养基中添加有6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.4mg/L、萘乙酸(NAA)0.04mg/L、活性炭0.5g/L、蔗糖20g/L以及琼脂粉6g/L,并调节PH至5.5所得的培养基。
(4)、分割苗诱导生根培养步骤:将获得的组培丛芽中4-6cm长苗分割后接种于生根培养基中进行生根培养,其中所述生根培养基为在WPM培养基中添加萘乙酸(NAA)0.1mg/L,蔗糖20g/L以及活性炭0.5g/L、琼脂粉6g/L,并调节PH至5.5所得的培养基。
实施例4
本实施例的一种大花胡麻草组织培养方法,其离体组织培养基本步骤同实施例1,不同的是,步骤(3)中,采用的分化增殖培养基的成分为WPM培养基中添加有6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.8mg/L、萘乙酸(NAA)0.08mg/L、活性炭0.8g/L、蔗糖30g/l以及琼脂粉6.5g/l,并调节PH至5.8所得的培养基。
对比例1
本实施例的一种大花胡麻草组织培养方法,其离体组织培养基本步骤同实施例1,不同的是,所有培养基中均没有添加活性炭。
对比上述实施例1~4及对比例1的培养结果如下:
实施例1至3中,种子消毒后组织培养,无菌率均控制在95%~100%;增殖培养系数为1:4;外植体长势最好,没有玻璃化现象。
实施例4中,种子消毒后组织培养,无菌率控制在95%~100%;增殖培养系数为1:6,在实施例4中发现有的外植体有玻璃化现象。
对比例1中,种子消毒后组织培养,无菌率控制在95%~100%;褐化死亡率明显高于实施例1-4,说明培养基中添加的活性炭对外植体有较好的抗褐化效果,且对离体培养的生长发育几乎无影响。
此外,实施例1~4的移栽成活率可达86%,对比例1的移栽成活率可达80%。
对比例2
本实施例的一种大花胡麻草组织培养方法,其离体组织培养基本步骤同实施例1,不同的是,增殖培养基和生根培养基为MS培养基。
对比上述实施例1~4及对比例2的培养结果如下:
种子消毒后组织培养,无菌率均控制在95%~100%。
实施例1~4中,增殖培养和生根培养基本培养基为WPM培养基,所获得再生苗植株健壮,叶片为健康的绿色,增殖系数大于1:4,移栽成活率均大于80%。
对比例2中,在MS基本培养基上增殖培养效果差,增殖系数小于1:4,叶片发黄,移栽成活率低。
综上可见,本发明通过对大花胡麻草组织培养过程中外植体灭菌方法、分化增殖培养方法、生根培养方法及培养基的选择进行改进,有效解决了大花胡麻草外植体消毒易污染、易褐化等难题,为其快速繁殖提供了有效的技术支持,解决了目前大花胡麻草野生资源少、难繁殖的问题,为满足当前市场需求提供新的途径。
上述仅为本发明的部分优选实施例,本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说,在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改,所作的任何变化和更改,均在本发明保护范围之内。
Claims (8)
1.一种大花胡麻草组织培养方法,该方法包括:(1)外植体选择和预处理;(2)种子萌发培养;(3)实生苗分化增殖培养;(4)分割苗诱导生根培养;(5)炼苗与移栽;其特征在于:
所述外植体选择和预处理步骤中,选择野外收集的大花胡麻草种子作为外植体,然后对种子进行预处理;
所述种子萌发培养步骤中,将经过处理的大花胡麻草种子接种于种子萌发培养基进行培养,培养2-3周后获得无菌实生苗;
所述实生苗分化增殖培养步骤中,选择1-2cm高的无菌实生苗在超净工作台上接种于增殖培养基进行继代培养,培养3-4周后获得组培丛芽;
所述分割苗诱导生根培养步骤中,将获得的4-6cm长苗的组培丛芽进行分割处理,将分割苗接种于生根培养基中进行诱导生根培养,获得组培苗;
所述炼苗与移栽步骤中,当根长达到2-5cm时,进行炼苗3-5天,后取出组培苗,进行移栽;
所述实生苗分化增殖培养步骤中,所述增殖培养基为在WPM培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤0.4-0.6mg/L、萘乙酸0.04-0.06mg/L、蔗糖20-30g/L以及琼脂粉6-7g/L,并调节PH至5.5-6.0所得的培养基;所述培养基置于透明玻璃培养瓶中并给予光照12-14h/天,其中,光照强度为1500-2000LX,温度为25℃±2℃;
所述的种子萌发培养基、增殖培养基、生根培养基中分别含有活性炭0.5-0.8g/L。
2.根据权利要求1所述的一种大花胡麻草组织培养方法,其特征在于,所述外植体选择和预处理步骤中:在收集的大花胡麻草种子中,挑选种荚未开裂的种子作为外植体,然后进行预处理;
所述预处理包括前处理与消毒灭菌处理步骤;
其中,所述前处理步骤为:先用75wt%酒精擦拭种荚表面,将种子破壳取出后置于灭菌的1.5mL的离心管中,加入1mL无菌水浸泡1-2h,待种子吸足水分后,在1000rpm的条件下离心3-5min,倒掉上清液,准备下一步消毒;
所述消毒灭菌处理步骤为:将前处理后的种子置于超净工作台中,用75%的酒精消毒30-60秒,再用体积浓度为0.1%的升汞浸泡8-10min,后使用无菌水冲洗6-8次。
3.根据权利要求1所述的一种大花胡麻草组织培养方法,其特征在于,所述种子萌发培养步骤中,所述种子萌发培养基为在MS培养基中添加蔗糖20-30g/L、琼脂粉6-7g/L,并调节PH至5.5-6.0所得的培养基;所述培养基置于透明玻璃培养瓶中并给予光照10-12h/天,其中,光照强度为1500-2000LX,温度为25℃±2℃,在此条件下培养2-3周诱导种子萌发出苗。
4.根据权利要求3所述的一种大花胡麻草组织培养方法,其特征在于:所述的种子萌发培养基的pH调节至5.8。
5.根据权利要求1所述的一种大花胡麻草组织培养方法,其特征在于,所述分割苗诱导生根培养步骤中,所述生根培养基为在WPM培养基中添加萘乙酸0.1-0.3mg/L,蔗糖20-30g/L以及琼脂粉6-7g/L,并调节PH至5.5-6.0所得的培养基;所述培养基置于透明玻璃培养瓶中并给予光照12-14h/天,光照强度为1500-2000LX,温度为25℃±2℃。
6.根据权利要求1或5所述的一种大花胡麻草组织培养方法,其特征在于,所述的WPM培养基以一升为量计算由如下成分组成:NH4NO3 400mg·L-1,Ca(NO3)2·4H2O 556mg·L-1,K2SO4 990mg·L-1,CaCl2·2H2O 96mg·L-1,KH2PO4 170mg·L-1,Na2MoO4·2H2O 0.25mg·L-1,MgSO4·7H2O 370mg·L-1,MnSO4·H2O 22.4mg·L-1,ZnSO4·7H2O 8.6mg·L-1,CuSO4·5H2O0.25mg·L-1,FeSO4·7H2O 27.8mg·L-1,Na2-EDTA 37.3mg·L-1, 肌醇100mg·L-1,维生素B11.0mg·L-1,烟酸0.5mg·L-1,维生素B6 0.5mg·L-1,甘氨酸2.0mg·L-1,蔗糖20g·L-1,琼脂6g·L-1;pH调节至5.8。
7.根据权利要求6所述的一种大花胡麻草组织培养方法,其特征在于:所述的增殖培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/L、萘乙酸0.05mg/L;所述生根培养基中含有萘乙酸0.2mg/L。
8.根据权利要求1所述的一种大花胡麻草组织培养方法,其特征在于:在步骤(4)生根培养结束后,取出的组培苗,先洗净根上的培养基,然后将苗移植到基质中,并用透气盖遮盖,保持空气湿度在85%-90%,至新根长出,正常养护。
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