CN105010143B - 一种楸树的体外培养方法 - Google Patents
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Abstract
一种楸树的体外培养方法包括1)愈伤组织的诱导:将其置于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织;愈伤组织诱导培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了6‑苄基腺嘌呤(6‑BA)和2,4‑二氯苯氧乙酸(2,4‑D);2)愈伤组织的增殖:将愈伤组织置于增殖培养基上增殖;增殖培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了6‑苄基腺嘌呤(6‑BA)和α‑萘乙酸(NAA);3)胚性愈伤组织的诱导和体细胞胚胎的分化:将增殖后的愈伤组织置于诱导分化培养基上;诱导分化培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了6‑苄基腺嘌呤(6‑BA)和α‑萘乙酸(NAA);4)植株再生:将分化出的体细胞胚胎置于再生培养基上诱导体胚萌发,得到楸树再生植株。本发明是为了扩大楸树的繁殖系数,为种质保存、遗传转化提供条件。
Description
技术领域
本发明涉及植物的体外培养方法,特别是一种楸树的体外培养方法。
背景技术
楸树(Catalpa bungei C. A. Mey)属紫葳科(Bignoniaceae)梓属(Catalpa)的高大乔木,是起源我国的乡土树种, 分布范围东起海滨,西至甘肃,南始云南,北到长城的广大区域内。该树种适应性强,分布广,素有“木王”之称(王文采等 1990)。树姿俊秀,高大挺拔,花多盖冠,其花形若钟,红斑点缀白色花冠,每至花期,繁花满枝,是我国历史上著名园林观赏树种,自古以来就种植于皇家庭院、古刹寺庙和风景名胜等地,同时楸树还是优良的药用和用材树种,具有很高的生态效益和经济效益。此外,楸树的环保性能较强,可消声,滞尘,有效吸收二氧化硫、氯气等有毒气体。因此提高楸树的种植面积和利用效益意义极其重大。
由于楸树木材具有诸多其它树种不可替代的优良特性,加剧了人们对它的开发利用,自然分布面积不断缩小,数量的急剧减少。又因为楸树花而不实,不同无性系经昆虫传粉,即使能结实,结实量也很少(郭从俭 1988)。实生繁殖困难,自古以来人们一直延用“取傍生者植之”的方法繁衍楸树,代代相传形成了楸树的单一无性系,使楸树的发展受到很大限制。目前楸树资源日趋减少,已濒于“临危植物”的边缘,亟待拯救。楸树资源的大量毁灭,给人们带来严重的不良后果。当前已造成材种比例结构失调,直接影响到国民经济建设和人民的生产生活。因此,迅速恢复楸树生产,大力发展楸树已成为林业生产的当务之急。
楸树传统繁殖方法主要采用播种、埋根、嫁接、扦插等方法。而采用这些方法存在实生苗生长周期长,果实收集困难, 种子发芽率低, 出苗率不稳定等缺陷, 无法满足生产和市场的需求(韩创举等 2006)。因此,探索快速繁殖楸树的有效途径成为亟待解决的问题。组织培养具有需要材料量少、繁殖快、不受季节影响等特点,是快速繁殖木本植物一个重要方法。近年来,对于楸树的组织培养研究主要侧重于用幼嫩的茎尖、带芽点的嫩茎做外植体诱导腋芽(孟永红等 2004;傅玉兰等 2009;聂琳 2011)和不定芽(王军辉等 2011)。主要研究了培养基的种类、植物生长调节剂的组合和配比、碳源、蔗糖浓度和琼脂浓度对腋芽和不定芽的诱导影响。杨燕(杨燕 2008),Lin juan (Lin et al. 2010)等探究了不同的激素浓度和不同的外植体对楸树愈伤组织的影响。于永明(于永明等 2012)等报道基因型也是楸树腋芽诱导、增殖和生根的主要影响因素。但楸树体细胞胚胎发生的研究还未见报道,因此建立稳定高频率发生楸树体细胞胚胎再生体系,为楸树的生物技术育种、种质资源保存、快速繁殖、遗传转化、人为控制楸树的生长发育研究提供良好的实验体,具有十分重要的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用楸树体细胞胚胎进行体外培养的方法,其方法的培育周期在175天左右、再生植株成活率达到85%以上。
为解决上述技术问题,本发明采取以下技术方案:楸树的体外培养方法,包括以下步骤:
1)愈伤组织的诱导:以经灭菌的楸树为外植体,将其置于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织;所述愈伤组织诱导培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤(6-BA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D);
2)愈伤组织的增殖:将愈伤组织置于增殖培养基上增殖;所述增殖培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了浓度为0-2.0 mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)和浓度为0-0.1mg/L的α-萘乙酸(NAA);
3)胚性愈伤组织的诱导及体细胞胚的分化:将增殖后的愈伤组织置于分化诱导培养基上诱导胚性愈伤组织,在诱导培养基上继代培养诱导体细胞胚胎;所述的诱导培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了浓度为0-1.0 mg/L 的6-苄基嘌呤(6-BA)和浓度为0-0.1 mg/L 的α-萘乙酸(NAA);
4)植株再生:将分化出的体细胞胚胎置于再生培养基上诱导体胚萌发,得到楸树再生苗;所述植株再生培养基为1/2MS培养基。
进一步讲,所述步骤1)中的外植体为未成熟的子叶胚。
进一步讲,所述方法步骤1)中愈伤组织诱导培养基中6-苄基嘌呤(6-BA)的浓度为0-2.0 mg/L,2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的浓度为0-2.0 mg/L。
进一步讲,所述步骤1)中愈伤组织诱导培养基中6-苄基嘌呤(6-BA)的浓度为0.1mg/L,2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的浓度为1.0 mg/L。
进一步讲,所述方法步骤2)增殖培养基中6-苄基嘌呤(6-BA)的浓度为1.0mg/L,α-萘乙酸(NAA)的浓度为 0.01mg/L;
所述方法步骤3)分化诱导培养基中6-苄基嘌呤(6-BA)的浓度为0.2mg/L,α-萘乙酸(NAA)的浓度为0.05mg /L。
进一步讲,未成熟子叶胚进行灭菌的方法为:取楸树未成熟细长蒴果,用75%酒精棉球擦拭消毒,套剥去果皮,然后用2% 的NaClO对种子进行表面消毒4min,无菌水清洗,4℃环境下保存10小时以上;再用2% 的NaClO浸泡3min,无菌水清洗,剥去种皮,取出子叶胚作为外植体。
进一步讲,所述步骤1)的培养条件为:温度25±2℃,光照时间12-16h/天,光照强度2000-2500lux;
步骤2)的培养条件为:温度25±2℃,光照时间12-16h/天,光照强度2000-2500lux;
步骤3)的培养条件为:温度25±2℃,光照时间12-16h/天,光照强度2000-2500lux。
进一步讲,所述步骤1)中愈伤组织的诱导时间为10-17天, 外植体成为长满浅绿色的愈伤组织;
步骤2)中的增殖时间为30-60天, 浅绿色愈伤组织逐渐转变为黑色颗粒状愈伤组织;
步骤3)中的诱导分化时间为60-90天, 黑色颗粒状愈伤组织分化生成浅黄色的胚性愈伤组织;
步骤4)中的再生培养时间为30天, 体细胞胚萌发生成再生苗。
进一步讲,对步骤4)中经再生培养后得到的完整植株进行炼苗,方法为:待再生苗长出3-5片真叶时,逐步打开组培瓶盖,使再生植苗与空气接触,在20-25℃下炼苗7-10天。
进一步讲,所述楸树的体外培养方法还包括移植,待再生苗生长至5cm左右时,将再生苗从培养瓶中移至缓冲间培养,再将再生苗移至培养室外常温培养,再取出再生苗,在流水下彻底清洗根部的培养基,最后将再生苗移至已灭菌培养基质中培养。
本发明提供了楸树的一种体外培养方法。该方法是利用未成熟子叶胚及其它类似材料作为外植体,通过胚性愈伤组织诱导途径得到再生植株。以子叶胚为外植体进行离体再生的优势在于取材方便、可提供的材料充足。用该方法可高频率地诱导出大量的楸树体细胞胚胎,再生植株成活率高,可达85%,而且具有再生植株变异小和遗传稳定性较高的优点。本发明为扩大楸树的繁殖系数、该物种的种质保存及其遗传转化奠定了良好的基础,应用前景广阔。
附图说明
图1为未成熟子叶胚诱导的愈伤组织。
图2为增殖后的黑色颗粒状愈伤组织。
图3为胚性愈伤组织。
图4为显微镜下观察到的球形胚。
图5为显微镜下观察到的心形胚。
图6为显微镜下观察到的鱼雷胚。
图7为显微镜下观察到的子叶胚。
图8为胚状体。
图9为体细胞胚萌发的小植株。
图10为炼苗成活的再生植株。
图11为本发明方法步骤。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
1/2MS基本培养基:可参照文献(Murashige T, Skoog F. A revised medium forrapid grouth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant,1962, 15: 473-497)配制,仅将大量元素减为原来的一半。
如图11中,楸树的体外培养方法主要内容如下,灭菌——愈伤组织的诱导——愈伤组织的增殖——胚性愈伤组织的诱导及体细胞胚的分化——植株再生——移植,并以未成熟的子叶胚为外植体具体实施如下:
1)子叶胚的灭菌
取楸树未成熟细长蒴果,用75%酒精棉球擦拭消毒2-3遍,进入无菌操作台用75%的酒精棉球再擦拭消毒2-3遍,戴上无菌手套剥去果皮,然后用2% 的NaClO对种子进行表面消毒4min,无菌水清洗5次,4℃ 过夜(时间不少于10小时);再用2% 的NaClO浸泡3min,无菌水清洗5次。戴上无菌手套剥去种皮,取出子叶胚作为外植体。
2)愈伤组织的诱导及含有不同浓度6-苄基腺嘌呤(6-BA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)组合的愈伤组织诱导培养基的诱导效果比较。
愈伤组织诱导培养基:在1/2MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤(6-BA)0-2.0mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D) 0-2.0mg/L。
以步骤1)获得的经灭菌的未成熟子叶胚为外植体,将其置于上述含有不同浓度6-苄基腺嘌呤(6-BA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)组合的愈伤组织诱导培养基(每个培养瓶中接种20粒,每个组合接种5瓶,重复3次)上,在温度25±2℃,光照时间12-16h/天,光照强度2000-2500lux下诱导愈伤组织,并对含有不同浓度6-苄基腺嘌呤(6-BA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)组合的愈伤组织诱导培养基的诱导效果进行比较。
结果在含不同浓度6-苄基腺嘌呤(6-BA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)组合的MS培养基上的子叶胚外植体均能产生愈伤,接种后第5天,未成熟子叶胚中部膨胀,子叶胚中部膨胀,表面开始变得模糊,有少量浅绿色的愈伤组织出现,接种8天后, 外植体长满浅绿色愈伤组织,整体变大[图1]。培养15 d后各组合培养基上愈伤组织的诱导率均较高,其中在2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D) 1.0mg/L, 6-苄基腺嘌呤(6-BA) 0.1mg/L培养基上,诱导率最高达到90%;在只含6-苄基腺嘌呤(6-BA) (0-2.0mg/L)的培养基上诱导率最低,接近于0,在只含有2,4-二氯苯氧乙酸(0-2.0mg/L)的培养基上诱导率也偏低,最高只达到 78%,表明在楸树的愈伤组织诱导过程中2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和6-苄基腺嘌呤(6-BA)是必须的,只有在2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和6-苄基腺嘌呤(6-BA)达到一定的比例时能提高愈伤组织的诱导率。因此将愈伤组织诱导培养基定为:在1/2MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤(6-BA) 0-2.0mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D) 0-2.0mg/L。
3)愈伤组织的增殖及含有不同浓度的6-苄基腺嘌呤(6-BA)和α-萘乙酸(NAA),6-苄基腺嘌呤(6-BA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)组合的培养基对愈伤组织增殖的效果比较。
将在不同浓度的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和6-苄基腺嘌呤(6-BA)的组合培养基上诱导的部分愈伤组织转置添加6-苄基腺嘌呤(6-BA)(0-1.0mg/L)和α-萘乙酸(NAA)(0-0.1mg/L)的培养基上进行增殖。部分愈伤组织会大量增殖,形态没有发生明显变化,但颜色会逐渐加深呈棕色,另外部分的愈伤组织生长较慢,颜色逐渐褐化。45天之后,只有在6-苄基腺嘌呤(6-BA)和α-萘乙酸(NAA)的组合培养基上有黑色颗粒状的愈伤出现(图2),在6-苄基腺嘌呤(6-BA)1.0mg/L和α-萘乙酸(NAA)0.01mg/L的培养基中黑色颗粒状愈伤(褐化愈伤组织生成黑色颗粒状愈伤)最多, 在6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.9mg/L和α-萘乙酸(NAA)0.07mg/L的培养基中黑色颗粒状愈伤(褐化愈伤组织生成黑色颗粒状愈伤)次之,在只有2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的培养基无黑色颗粒状愈伤产生。
4)体细胞胚的分化及含有不同浓度6-苄基腺嘌呤(6-BA)和α-萘乙酸(NAA)组合的分化培养基的诱导分化效果比较
分化培养基:在1/2MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤(6-BA) 0-1.0mg/L和α-萘乙酸(NAA)0-0.1mg/L。
将步骤3)获得的愈伤组织转置不同浓度6-苄基腺嘌呤(6-BA)和α-萘乙酸(NAA)组合的培养基,在温度25±2℃,光照时间12-16h/天,光照强度2000-2500lux下诱导分化,并对含有不同浓度6-苄基腺嘌呤(6-BA)和α-萘乙酸(NAA)组合的分化培养基的诱导分化效果进行比较。
结果45天之后只有黑色的颗粒状愈伤组织在上述含有不同浓度6-苄基腺嘌呤(6-BA)和α-萘乙酸(NAA)组合的培养基上有浅黄色的胚性愈伤组织的产生(图3),说明在愈伤组织的增殖阶段合适的培养基为6-苄基腺嘌呤(6-BA) 1.0mg/L,α-萘乙酸(NAA) 0.01mg/L,愈伤长期在含有2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的培养基上培养对胚性愈伤组织的诱导有阻碍作用。其中,颗粒状的黑色愈伤组织在含6-苄基腺嘌呤(6-BA) 0.2mg/L和α-萘乙酸(NAA)0.05mg/L的1/2MS培养基上,诱导率最高,在含6-苄基腺嘌呤(6-BA) 0.23mg/L和α-萘乙酸(NAA) 0.06mg/L的1/2MS培养基上,诱导率次之,继代30天后,浅黄色胚性愈伤组织的体积是转接时的100倍以上,随后,进一步发育成球形胚(图4)、心形胚(图5)、鱼雷胚(图6)和子叶胚(图7),据统计,每0.5g的胚性愈伤组织中含有1000个以上的胚状体(图8),继续培养,产生大量体细胞胚。
5)植株再生
再生培养基:1/2 MS培养基(大量元素为MS基本培养基全量的1/2)
将步骤3)获得的已经长出两片子叶的子叶期胚转接到1/2 MS培养基上在温度25±2℃,光照时间12-16h/天,光照强度2000-2500lux下诱导萌发,茎端和根端同时发育,最后发育成完整植株(图9)。
6)炼苗和移栽
先将步骤5)中经生根培养后得到的再生植株进行炼苗,移植。炼苗方法为:待再生苗长出3-5片真叶时,将再生苗从培养瓶中移至缓冲间培养,逐步打开组培瓶盖,使再生植苗与空气接触,在20-25℃下炼苗7天;再将再生苗从缓冲间中移至培养室外常温下炼苗培养7天左右。
再取出再生苗,在流水下彻底清洗根部的培养基,最后将幼苗移至装有已灭菌培养基质(腐殖土:珍珠岩=1:1)的花盆中,浇透水置于温棚中培养(图10)。
Claims (6)
1.一种楸树的体外培养方法,其特征在于:所述方法包括以下步骤:
1)愈伤组织的诱导:以经灭菌的楸树为外植体,外植体为未成熟的子叶胚,将其置于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织;所述愈伤组织诱导培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了浓度为0.1mg/L6-苄基腺嘌呤(6-BA)和浓度为1.0 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D);
2)愈伤组织的增殖:将愈伤组织置于增殖培养基上增殖;所述增殖培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了浓度为1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)和浓度为0.01mg/L的α-萘乙酸(NAA);
3)胚性愈伤组织的诱导及体细胞胚的分化:将增殖后的愈伤组织置于分化诱导培养基上诱导胚性愈伤组织,在诱导培养基上继代培养诱导体细胞胚胎;所述的诱导培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了浓度为0.2mg/L 的6-苄基嘌呤(6-BA)和浓度为0.05mg/L的α-萘乙酸(NAA);
4)植株再生:将分化出的体细胞胚胎置于再生培养基上诱导体胚萌发,得到楸树再生苗;所述植株再生培养基为1/2MS培养基。
2.根据权利要求1所述的一种楸树的体外培养方法,其特征在于:子叶胚进行灭菌的方法为:取楸树未成熟细长蒴果,用75%酒精棉球擦拭消毒,套剥去果皮,然后用2% 的NaClO对种子进行表面消毒4min,无菌水清洗,4℃ 环境下保存10小时以上;再用2% 的NaClO浸泡3min,无菌水清洗,剥去种皮,取出子叶胚作为外植体。
3.根据权利要求1所述的一种楸树的体外培养方法,其特征在于:
所述步骤1)的培养条件为:温度25±2℃,光照时间12-16h/天,光照强度2000-2500lux;
步骤2)的培养条件为:温度25±2℃,光照时间12-16h/天,光照强度2000-2500lux;
步骤3)的培养条件为:温度25±2℃,光照时间12-16h/天,光照强度2000-2500lux。
4.根据权利要求1所述的一种楸树的体外培养方法,其特征在于:
所述步骤1)中愈伤组织的诱导时间为10-17天, 外植体成为长满浅绿色的愈伤组织;
步骤2)中的增殖时间为30-60天, 浅绿色愈伤组织转变为黑色颗粒状愈伤组织;
步骤3)中的诱导分化时间为60-90天, 黑色颗粒状愈伤组织分化产生浅黄色的胚性愈伤组织;
步骤4)中的植株再生培养时间为30天, 体细胞胚萌发生成再生苗。
5.根据权利要求1所述的一种楸树的体外培养方法,其特征在于:对步骤4)中经再生培养后得到的完整植株进行炼苗,方法为:待再生苗长出3-5片真叶时,打开组培瓶盖,使再生植苗与空气接触,在20-25℃下炼苗7-10天。
6.根据权利要求1所述的一种楸树的体外培养方法,其特征在于:所述楸树的体外培养方法还包括移植,待再生苗生长至5cm左右时,将再生苗从培养瓶中移至缓冲间培养,再将再生苗移至培养室外常温培养,再取出再生苗,在流水下彻底清洗根部的培养基,最后将再生苗移至已灭菌培养基质中培养。
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Legal Events
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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