CN106942053B - 一种针对兴安天门冬的组培快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种针对兴安天门冬的组培快繁方法，该技术方案包括取材与外植体消毒、腋芽诱导培养、根丛诱导培养、根丛增殖培养、生根预分化培养、生根培养以及组培苗移栽等过程。本发明采用根丛繁殖途径，有别于常规的单茎繁殖生根或愈伤途径；以根丛作为目标繁殖单位，以及后续诱导生根部位，促进生根，提高组培苗的繁殖系数与整齐度。同时，本发明采用蔗糖浓度由低到高的两段生根法促进生根，并重点添加适当浓度的嘧啶醇促进根的发育，有效解决了兴安天门冬生根困难问题，整个周期8～12月，生根率超过60％，在诱导率、生根率、根的质量、移栽成活率等方面达到植物组培快繁要求，为兴安天门冬保存与利用奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，进一步涉及植物的组织培养和快速繁殖技术，具体涉及一种针对兴安天门冬的组培快繁方法。
背景技术
兴安天门冬(Asparagus dauricus Fisch.ex Link)，属百合科天门冬属多年生草本植物。研究发现，它雌雄异株，矮生性，嫩茎抽生多，高抗芦笋茎枯病，具有很多芦笋栽培种所亟需的优异性状，是芦笋重要的近缘种质。由于兴安天门冬种子萌发性差，通过分蔸法繁殖效率低，为了更好开发兴安天门冬，利用其优异性状改良芦笋，很有必要建立兴安天门冬组织培养快繁体系。
目前国内外均未见兴安天门冬组织培养和快繁技术研究的报道。但在天门冬属内，芦笋(Asparagus officinalis L.)研究最为深入，现已建立了成熟的组培快繁体系。此外，羊齿天门冬、Asparagus racemosus等近缘种组织培养也先后取得成功。这些天门冬属种组织培养和快繁技术研究主要都是基于MS培养基中的不同细胞分裂素和细胞生长素等植物激素的浓度及配比。研究发现，天门冬属种质组培快繁最大障碍是生根困难，不同种激素浓度及配比差异很大，不同芦笋品种、雄株和雌株激素浓度及配比也有区别。实践中发现，兴安天门冬组培苗生根相当困难，易玻璃化和产生愈伤。
发明内容
本发明旨在针对现有技术缺陷，提供一种针对兴安天门冬的组培快繁方法，以解决现有技术中在组织培养条件下兴安天门冬生长情况较差的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是现有技术中组织培养条件下兴安天门冬生根困难。
本发明要解决的再一技术问题是现有技术中组织培养条件下兴安天门冬繁殖系数和移栽成活率较低。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种针对兴安天门冬的组培快繁方法，包括以下步骤：
1)取兴安天门冬嫩茎作为外植体，清洗消毒，切成每个带有1～2腋芽的茎段；
2)腋芽诱导培养；
3)根丛诱导培养：取步骤2)培养后的茎段，取其上长出的、超过5cm的茎，切去茎尖，平铺接种于根丛诱导培养S2上，无菌培养20～30天，而后切除此期间长出的新生茎的茎尖，重新平铺接种于新的根丛诱导培养S2上，继代培养1～2周期，直至每个叶腋处长出3～8个成簇的嫩茎，得到母体茎段，每个成簇的嫩茎群基部即为根丛；
4)根丛增殖培养：取步骤3)所得的母体茎段，分割出若干株高为2～3cm的根丛，接种到增殖培养基SA上，无菌培养20～30天，取出根丛，分割成2～4个小根丛，接种于新的增殖培养基SA上，继代培养1～2周期；
5)生根预分化培养：取步骤4)培养后的小根丛，修剪至株高2～3cm，接种至生根预分化培养基RM5-1中，无菌培养20～30天，而后继代培养1～2周期；
6)生根培养：取步骤5)预分化培养后的小根丛，分割成若干株高为2～3cm的、每个带3～5个茎的子根丛，接种于生根培养基RM5-2中，无菌培养20～30天，继代培养1～2周期，直至60％以上子根丛基部长出3～5条肉质根；
其中，所述根丛诱导培养S2是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，6-BA0.1mg/L，激动素0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇0.1mg/L，蔗糖3％，琼脂0.8％，PH5.8；
所述根丛增殖培养基SA是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，激动素0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇0.2mg/L，蔗糖3％，琼脂0.8％，PH5.8；
所述生根预分化培养基RM5-1是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇1mg/L，蔗糖3％，琼脂0.8％，PH5.8；
所述生根培养基RM5-2是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇1.3mg/L，蔗糖6％，琼脂0.8％，PH5.8。
作为优选，步骤1)具体包括以下操作：取长度为10～20cm的兴安天门冬嫩茎作为外植体，流动水冲洗10min后，在无菌条件下切成3～4段，置于60～90％(v/v)浓度的酒精溶液中浸泡20～40秒，然后在有效氯为0.1～0.3％的次氯酸钠溶液中浸泡6～10分钟，无菌水冲洗3～4次，无菌滤纸吸干。
作为优选，步骤2)具体包括以下操作：取步骤1)所得产物，切成若干茎段、使每茎段带有1～2个腋芽，并切去外植体变色部分，而后以生长极性朝上的状态接种至诱导培养基I3中，无菌培养20～30天；
其中所述芽诱导培养基I3是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，6-BA0.2mg/L，激动素0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇0.1mg/L，3％蔗糖，琼脂0.8％，PH5.8。
作为优选，步骤2)无菌培养20～30天后每个茎段叶腋处长出2～3个嫩茎。
作为优选，步骤5)继代培养后部分根丛基部分化诱导长出1～2条肉质根。
作为优选，步骤6)所得产物每株上具有4～6根嫩茎和3～4条肉质贮藏根，所述贮藏根的根长为3～4cm。
作为优选，还包括以下步骤7)：在春季4～5月份或秋季9～10月份择时将步骤6)培养得到的组培苗开瓶，炼苗5～7天，洗净根部，修剪茎顶，移栽至大棚内泥炭土基质中，用遮光率为50～75％的遮阳网覆盖大棚进行遮光保湿处理7～10天，而后常规育苗管理20～30天，获得移栽成活的兴安天门冬幼苗植株。
作为优选，所述兴安天门冬为雌株，步骤4)中所述继代培养的周期为2～4周期，步骤5)中所述继代培养的周期为2～4周期。
作为优选，所使用的培养基的pH均为5.8。
作为优选，所述无菌培养的条件均为：温度26～28℃，相对湿度70～80％，光照时间为12h/d，光照强度2500Lux。
在以上技术方案中，所述有效氯为0.1～0.3％的次氯酸钠溶液，是指氯元素总质量在占溶液总质量为0.1～0.3％的次氯酸钠水溶液。
在以上技术方案中，所述根丛又称为微根冠；所述小根丛、子根丛从技术层面均属于根丛，“小”、“子”等词汇仅用于将培养流程中不同阶段、作为不同处理对象的根丛加以区分，而“小”、“子”等词汇并不构成对根丛本身技术特征的限定。
本发明提供了一种针对兴安天门冬的组培快繁方法，该技术方案包括取材与外植体消毒、腋芽诱导培养、根丛诱导培养、根丛增殖培养、生根预分化培养、生根培养以及组培苗移栽等步骤。由于使用了根丛繁殖方法，因此有别于常规的单茎繁殖生根方式或愈伤途径。根丛是诱导着生根部位，以根丛为目标繁殖单位，促进提前生根，提高了组培苗的整齐度与繁殖系数。
在营养条件方面，在整个组培过程中，添加L-谷氨酰胺作为有机氮源和碳源，有效促进了外植体、腋芽、根丛生长分化。本发明重点添加使用嘧啶醇促进生根。嘧啶醇是植物体内赤霉素合成的阻遏物，添加适当浓度的嘧啶醇促进根的发育，使茎变得粗壮，并抑制愈伤的形成；诱导和繁殖阶段使用低浓度嘧啶醇，以利于组培苗适应生根培养阶段高浓度嘧啶醇。同时，本发明采用了蔗糖浓度由低到高的两段生根法促进生根，提高了生根率。兴安天门冬是多年生植物，内源激素积累一定程度才能响应外源激素生根诱导，采用两段生根法有利于内源激素积累和生根响应。此外，本发明在腋芽诱导培养阶段使用了低浓度的嘧啶醇，显著提高了嫩茎诱导率，嫩茎长得更粗壮，同时有利于适应生根阶段高浓度的嘧啶醇。
综上所述，本发明采用繁殖根丛，使用嘧啶醇促进生根以及两段生根法等策略，有效解决了兴安天门冬生根困难问题，整个周期8～12月，生根率超过60％，在诱导率、生根率、根的质量、移栽成活率等达到植物组培快繁要求，为兴安天门冬保存与利用奠定了基础。此方法也可为芦笋等其他天门冬属近缘种组培快繁提供借鉴。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
本发明包括取材与外植体消毒、腋芽诱导培养、根丛诱导培养、根丛增殖培养、生根预分化培养、生根培养以及组培苗移栽等七个步骤，每一步骤中采用不同的培养条件和措施，对兴安天门冬组培快繁都具有影响，为了解决关键的技术问题，具体实施以下实验，优化了培养条件和技术参数，若无特别说明均参照上述方法步骤。
1、腋芽诱导培养基优化。MS+0.2g/L L-谷氨酰胺+0.1mg/L嘧啶醇+3％蔗糖+0.8％琼脂的基本培养基中添加如下不同激素组合：I1：0.2mg/L KT；I2：0.2mg/L6-BA；I3:0.2mg/L 6-BA+0.2mg/L KT+0.2mg/L NAA。结果发现，在实验室常规的芦笋栽培品种腋芽诱导培养基I1上，诱导的嫩茎表现纤细，生长速度慢；在常规紫芦笋品种腋芽诱导培养基I2上，嫩茎粗壮，但易玻璃化；在改良设计的腋芽诱导培养基I3上，诱导率最高，达到平均2.8个芽/茎段，嫩茎粗壮，培养30天后最长嫩茎达到12.5厘米，故培养基I3为优选培养基。
2、生根培养基嘧啶醇浓度优化。MS+0.2g/LL-谷氨酰胺+0.2mg/L NAA+不同浓度的嘧啶醇+6％蔗糖+琼脂0.8％，PH5.8，嘧啶醇浓度RM1-2：0mg/L；RM2-2：0.5mg/L；RM3-2：0.7mg/L；RM4-2：1.0mg/L；RM5-2：1.3mg/L；RM6-2：2.0mg/L。结果发现，随着嘧啶醇浓度升高，生根反应逐渐增强，1.3mg/L生根率最高，根粗壮洁白，但嘧啶醇浓度超过2.0mg/L，引起植株生长不良，嫩茎呈透明或半透明水浸状，矮化，无拟叶。综合评价，1.3mg/L为生根培养基嘧啶醇最适添加浓度，RM5-2为优选生根培养基。
实施例1
雄株的组培快繁，具体步骤如下：
①取材与外植体消毒：从田间采取雄株新抽发长约10～20cm的健壮嫩茎作为外植体,置于流水下冲洗10min后,在无菌操作台上，切成3段，置于75％酒精中处理30秒，然后在有效氯为0.2％的次氯酸钠溶液中消毒8分钟，无菌水冲洗4次，无菌滤纸吸干，待用。
②腋芽诱导培养：将第一步消毒完毕的嫩茎切成每个带有1～2个腋芽的茎段，并切去外植体变色部分，生长极性朝上，接种至诱导培养基I3中，置于无菌培养室中培养20天，每个茎段叶腋处长出2～3个嫩茎。
③根丛诱导培养：将第二步每个茎段腋芽处诱导长出的超过5cm的嫩茎剪下，切去茎尖，平铺接种于根丛诱导培养基S2上，置于无菌培养室中培养30天，每个叶腋处长出1～3个嫩茎，切除嫩茎茎尖，重新平铺接种于新的根丛诱导培养基S2上，再置于无菌培养室中培养30天后，每个叶腋处长出3～8个成簇的嫩茎。
④根丛增殖培养：以根丛为单位，将第三步中的母体茎段切成一个个株高2～3cm的根丛，然后接种到增殖培养基SA上，置于无菌培养室中培养30天，取出根丛，分割成2～4个小根丛，接种于更新的增殖培养基SA上，培养30天，根丛扩大。
⑤生根预分化培养：将第四步增殖获得的根丛，修剪至株高2～3cm，接种至生根预分化培养基RM5-1中，置于无菌培养室中培养30天，15％根丛基部分化诱导长出1～2条肉质根。
⑥生根培养：将第五步提前生根的根丛取出，剪去根，分割成每个带3～5个茎的小根丛，株高2～3cm，接种入生根培养基RM5-2中，置于无菌培养室中培养30天，68.5％根丛基部长出3～5条粗壮的肉质根，达到移栽标准。
⑦组培苗移栽：在春季4月下旬5月初移栽，将达到移栽标准的组培苗开瓶，炼苗7天，自来水洗净根部，修剪茎顶，移栽至大棚内丹麦品氏1号基质泥炭土中，用10cm×8cm规格的营养钵，用遮光率为50～75％的遮阳网覆盖大棚进行遮光处理7天，接下来按常规育苗管理，30天后组培苗成活，成活率为78.0％。
所述芽诱导培养基I3是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，6-BA0.2mg/L，激动素0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇0.1mg/L，3％蔗糖，琼脂0.8％，PH5.8。
所述根丛诱导培养基S2是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，6-BA0.1mg/L，激动素0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇0.1mg/L，蔗糖3％，琼脂0.8，PH5.8。
所述根丛增殖培养基SA是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，激动素0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇0.2mg/L，蔗糖3％，琼脂0.8％，PH5.8。
所述生根预分化培养基RM5-1是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇1mg/L，蔗糖3％，琼脂0.8％，PH5.8。
所述生根预分化培养基RM5-1是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇1mg/L，蔗糖3％，琼脂0.8％，PH5.8。
所述第二至第六步培养条件均为温度27±1℃，相对湿度70～80％，控制光照时间为12小时/天，光照强度2500Lux。
实施例2
雌株的组培快繁，具体步骤如下：
①取材与外植体消毒：从田间采取雌株新抽发长约10～20cm的健壮嫩茎作为外植体,置于流水下冲洗10min后,在无菌操作台上，切成3段，置于75％酒精中处理30秒，然后在有效氯为0.2％的次氯酸钠溶液中消毒8分钟，无菌水冲洗4次，无菌滤纸吸干，待用。
②腋芽诱导培养：将第一步消毒完毕的嫩茎切成每个带有1～2个腋芽的茎段，并切去外植体变色部分，生长极性朝上，接种至诱导培养基I3中，置于无菌培养室中培养20天，每个茎段叶腋处长出2～3个嫩茎。
③根丛诱导培养：将第二步每个茎段腋芽处诱导长出的超过5cm的嫩茎剪下，切去茎尖，平铺接种于根丛诱导培养基S2上，置于无菌培养室中培养30天，每个叶腋处长出1～3个嫩茎，切除嫩茎茎尖，重新平铺接种于新的培养基S2上，再置于无菌培养室中培养30天后，每个叶腋处长出3～8个成簇的嫩茎。
④根丛增殖培养：以根丛为单位，将第三步中的母体茎段切成一个个株高2～3cm的根丛，然后接种到增殖培养基SA上，置于无菌培养室中培养30天，取出根丛，分割成2～4个小根丛，接种于更新的培养基SA上，再继代培养2个周期，根丛扩大，拟叶展开。
⑤生根预分化培养：将第四步增殖获得的根丛，修剪至株高2～3cm，接种至生根预分化培养基RM5-1中，置于无菌培养室中培养30天，再继代培养2个周期，根丛扩大，拟叶展开，10％根丛基部分化诱导长出1～2条肉质根。
⑥生根培养：将第五步提前生根的根丛取出，剪去根，分割成每个带3～5个茎的小根丛，株高2～3cm，接种入生根培养基RM5-2中，置于无菌培养室中培养30天，65.0％根丛基部长出3～5条粗壮的肉质根，达到移栽标准。
⑦组培苗移栽：在春季4月下旬阴雨天气移栽，将达到移栽标准的组培苗开瓶，炼苗7天，自来水洗净根部，修剪茎顶，移栽至大棚内丹麦品氏1号基质泥炭土中，用10cm×8cm规格的营养钵，用遮光率为50～75％的遮阳网覆盖大棚进行遮光处理7天，接下来按常规育苗管理，30天后组培苗成活，成活率达到82.5％。
所述诱导培养基与培养条件与实例一完全相同。
实施例3
一种芦笋近缘野生种兴安天门冬组培快繁方法，包括下列操作步骤：
1、取材与外植体消毒：从田间采取长约10～20cm的健壮嫩茎作为外植体,置于流水下冲洗10min后,在无菌操作台上，切成3～4段，置于75％酒精中处理30秒，然后在有效氯为0.2％的次氯酸钠溶液中消毒8分钟，无菌水冲洗3～4次，无菌滤纸吸干，待用。
2、腋芽诱导培养：将第一步消毒完毕的嫩茎切成每个带有1～2个腋芽的茎段，并切去外植体变色部分，生长极性朝上，接种至诱导培养基I3中，置于无菌培养室中培养20～30天，每个茎段叶腋处长出2～3个嫩茎。
3、根丛诱导培养：将第二步每个茎段腋芽处诱导长出的超过5cm的嫩茎剪下，切去茎尖，平铺接种于根丛诱导培养基S2上，置于无菌培养室中培养20～30天，每个叶腋处长出1～3个嫩茎，切除嫩茎茎尖，重新平铺接种于更新的培养基S2上，继代培养1～2周期，直至每个叶腋处长出3～8个成簇的嫩茎。
4、根丛增殖培养：以根丛为单位，将第三步中的母体茎段切成一个个株高2～3cm的根丛，然后接种到增殖培养基SA上，置于无菌培养室中培养20～30天，取出根丛，分割成2～4个小根丛，接种于更新的增殖培养基SA上，继代培养1～2周期。
5、生根预分化培养：将第四步增殖获得的根丛，修剪至株高2～3cm，接种至生根预分化培养基RM5-1中，置于无菌培养室中培养20～30天，继代培养1～2周期，部分根丛基部分化诱导长出1～2条肉质根。
6、生根培养：将第五步生根预分化培养的根丛取出，分割成每个带3～5个茎的小根丛，株高2～3cm，接种入生根培养基RM5-2中，置于无菌培养室中培养20～30天，继代培养1～2周期，60％以上根丛基部长出3～5条粗壮的肉质根，达到移栽标准(每株4～6根嫩茎和3～4条肉质贮藏根，根长3～4cm)。
7、组培苗移栽：在春季4～5月份或秋季9～10月份择时移栽，将达到移栽标准的组培苗开瓶，炼苗5～7天，自来水洗净根部，修剪茎顶，移栽至大棚内泥炭土基质中，用遮光率为50～75％的遮阳网覆盖大棚进行遮光保湿处理7～10天，接下来按常规育苗管理，20～30天后组培苗成活。
补充说明，以上组培快繁程序对兴安天门冬雄株和雌株都适用，但由于雌株对植物激素响应比雄株略迟钝，注意在第四步和第五步相应增加1～2继代周期，生根率可达到雄株相同水平。
所述芽诱导培养基I3是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，6-BA0.2mg/L，激动素0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇0.1mg/L，3％蔗糖，琼脂0.8％，PH5.8。
所述根丛诱导培养基S2是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，6-BA0.1mg/L，激动素0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇0.1mg/L，蔗糖3％，琼脂0.8，PH5.8。
所述根丛增殖培养基SA是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，激动素0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇0.2mg/L，蔗糖3％，琼脂0.8％，PH5.8。
所述生根预分化培养基RM5-1是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇1mg/L，蔗糖3％，琼脂0.8％，PH5.8。
所述生根预分化培养基RM5-1是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇1mg/L，蔗糖3％，琼脂0.8％，PH5.8。
所述第二至第六步培养条件均为温度27±1℃，相对湿度70～80％，控制光照时间为12小时/天，光照强度2500Lux。
在本实施例中，使用了根丛繁殖方法，以根丛为目标繁殖单位，促进提前生根，提高组培苗的整齐度与繁殖系数。使用适当浓度的嘧啶醇促进生根。使用了蔗糖浓度由低到高的两段生根法促进生根，提高了生根率和生根整齐度。
实施例4
一种针对兴安天门冬的组培快繁方法，包括以下步骤：
1)取兴安天门冬嫩茎作为外植体，清洗消毒后切成每个带有1个腋芽的茎段；
2)腋芽诱导培养；
3)根丛诱导培养：取步骤2)培养后的茎段，取其上长出的、超过5cm的茎，切去茎尖，平铺接种于根丛诱导培养基S2上，无菌培养20天，而后切除此期间长出的新生茎的茎尖，重新平铺接种于更新的培养基S2上，继代培养1周期，直至每个叶腋处长出3个成簇的嫩茎，得到母体茎段，每个成簇的嫩茎群基部即为根丛；
4)根丛增殖培养：取步骤3)所得的母体茎段，分割出若干株高为2cm的根丛，接种到增殖培养基SA上，无菌培养20天，取出根丛，分割成2个小根丛，接种于新的增殖培养基SA上，继代培养1周期；
5)生根预分化培养：取步骤4)培养后的小根丛，修剪至株高2cm，接种至生根预分化培养基RM5-1中，无菌培养20天，而后继代培养1周期；
6)生根培养：取步骤5)预分化培养后的小根丛，分割成若干株高为2cm的、每个带3个茎的子根丛，接种于生根培养基RM5-2中，无菌培养20天，继代培养1周期，直至60％以上子根丛基部长出3条肉质根；
其中，所述根丛诱导培养基S2是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，6-BA 0.1mg/L，激动素0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇0.1mg/L，蔗糖3％，琼脂0.8，PH5.8。
所述根丛增殖培养基SA是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，激动素0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇0.2mg/L，蔗糖3％，琼脂0.8％，PH5.8。
所述生根预分化培养基RM5-1是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇1mg/L，蔗糖3％，琼脂0.8％，PH5.8。
所述生根预分化培养基RM5-1是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇1mg/L，蔗糖3％，琼脂0.8％，PH5.8。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤1)具体包括以下操作：取长度为10cm的兴安天门冬嫩茎作为外植体，流动水冲洗10min后，在无菌条件下切成3段，置于60％(v/v)浓度的酒精溶液中浸泡20秒，然后在有效氯为0.1％的次氯酸钠溶液中浸泡6分钟，无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干。
步骤2)具体包括以下操作：取步骤1)所得产物，切成若干茎段、使每茎段带有1个腋芽，并切去外植体变色部分，而后以生长极性朝上的状态接种至诱导培养基I3中，无菌培养20天；
其中，所述芽诱导培养基I3是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，6-BA0.2mg/L，激动素0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇0.1mg/L，3％蔗糖，琼脂0.8％，PH5.8。
步骤2)无菌培养20天后每个茎段叶腋处长出2个嫩茎。
步骤5)继代培养后部分根丛基部分化诱导长出1条肉质根。
步骤6)所得产物每株上具有4根嫩茎和3条肉质贮藏根，所述贮藏根的根长为3cm。
还包括以下步骤7)：在春季4～5月份将步骤6)培养得到的组培苗开瓶，炼苗5天，洗净根部，修剪茎顶，移栽至大棚内泥炭土基质中，用遮光率为50％的遮阳网覆盖大棚进行遮光处理7天，而后常规育苗20天，得到兴安天门冬植株幼苗。
所述兴安天门冬为雌株，步骤4)中所述继代培养的周期为2周期，步骤5)中所述继代培养的周期为2周期。
以上方法中所使用的培养基的pH均为5.8。
以上方法中所述无菌培养的条件均为：温度26℃，相对湿度70％，光照时间为12h/d，光照强度2500Lux。
实施例5
一种针对兴安天门冬的组培快繁方法，包括以下步骤：
1)取兴安天门冬茎作为外植体，清洗消毒后切成每个带有2个腋芽的茎段；
2)腋芽诱导培养；
3)根丛诱导培养：取步骤2)培养后的茎段，取其上长出的、超过5cm的茎，切去茎尖，平铺接种于根丛诱导培养基S2上，无菌培养30天，而后切除此期间长出的新生茎的茎尖，重新平铺接种于更新培养基S2上，继代培养2周期，直至每个叶腋处长出8个成簇的嫩茎，得到母体茎段，每个成簇的嫩茎群基部即为根丛；
4)根丛增殖培养：取步骤3)所得的母体茎段，分割出若干株高为3cm的根丛，接种到增殖培养基SA上，无菌培养30天，取出根丛，分割成4个小根丛，接种于新的增殖培养基SA上，继代培养2周期；
5)生根预分化培养：取步骤4)培养后的小根丛，修剪至株高3cm，接种至生根预分化培养基RM5-1中，无菌培养30天，而后继代培养2周期；
6)生根培养：取步骤5)预分化培养后的小根丛，分割成若干株高为3cm的、每个带5个茎的子根丛，接种于生根培养基RM5-2中，无菌培养30天，继代培养2周期，直至60％以上子根丛基部长出5条肉质根；
其中，所述根丛诱导培养基S2是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，6-BA 0.1mg/L，激动素0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇0.1mg/L，蔗糖3％，琼脂0.8，PH5.8。
所述根丛增殖培养基SA是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，激动素0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇0.2mg/L，蔗糖3％，琼脂0.8％，PH5.8。
所述生根预分化培养基RM5-1是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇1mg/L，蔗糖3％，琼脂0.8％，PH5.8。
所述生根预分化培养基RM5-1是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇1mg/L，蔗糖3％，琼脂0.8％，PH5.8。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤1)具体包括以下操作：取长度为20cm的兴安天门冬嫩茎作为外植体，流动水冲洗10min后，在无菌条件下切成4段，置于90％(v/v)浓度的酒精溶液中浸泡40秒，然后在有效氯为0.3％的次氯酸钠溶液中浸泡10分钟，无菌水冲洗4次，无菌滤纸吸干。
步骤2)具体包括以下操作：取步骤1)所得产物，切成若干茎段、使每茎段带有2个腋芽，并切去外植体变色部分，而后以生长极性朝上的状态接种至诱导培养基I3中，无菌培养30天；
其中，所述芽诱导培养基I3是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，6-BA0.2mg/L，激动素0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇0.1mg/L，3％蔗糖，琼脂0.8％，PH5.8。
步骤2)无菌培养30天后每个茎段叶腋处长出3个嫩茎。
步骤5)继代培养后部分根丛基部分化诱导长出2条肉质根。
步骤6)所得产物每株上具有6根嫩茎和4条肉质贮藏根，所述贮藏根的根长为4cm。
还包括以下步骤7)：在秋季9～10月份择时将步骤6)培养得到的组培苗开瓶，炼苗7天，洗净根部，修剪茎顶，移栽至大棚内泥炭土基质中，用遮光率为75％的遮阳网覆盖大棚进行遮光处理10天，而后常规育苗30天，获得移栽成活的兴安天门冬幼苗植株。
以上方法中所述无菌培养的条件均为：温度28℃，相对湿度80％，光照时间为12h/d，光照强度2500Lux。
实施例6
一种针对兴安天门冬的组培快繁方法，包括以下步骤：
1)取兴安天门冬茎作为外植体，清洗消毒后切成若干带有腋芽的茎段；
2)腋芽诱导培养；
3)根丛诱导培养：取步骤2)培养后的茎段，取其上长出的、超过5cm的茎，切去茎尖，平铺接种于根丛诱导培养基S2上，无菌培养25天，而后切除此期间长出的新生茎的茎尖，重新平铺接种于更新的培养基S2上，继代培养1周期，直至每个叶腋处长出6个成簇的嫩茎，得到母体茎段，每个成簇的嫩茎群基部即为根丛；
4)根丛增殖培养：取步骤3)所得的母体茎段，分割出若干株高为2.5cm的根丛，接种到增殖培养基SA上，无菌培养25天，取出根丛，分割成3个小根丛，接种于新的增殖培养基SA上，继代培养2周期；
5)生根预分化培养：取步骤4)培养后的小根丛，修剪至株高2.5cm，接种至生根预分化培养基RM5-1中，无菌培养25天，而后继代培养2周期；
6)生根培养：取步骤5)预分化培养后的小根丛，分割成若干株高为2.5cm的、每个带4个茎的子根丛，接种于生根培养基RM5-2中，无菌培养25天，继代培养1周期，直至60％以上子根丛基部长出4条肉质根；
其中，所述根丛诱导培养基S2是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，6-BA 0.1mg/L，激动素0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇0.1mg/L，蔗糖3％，琼脂0.8，PH5.8。
所述根丛增殖培养基SA是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，激动素0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇0.2mg/L，蔗糖3％，琼脂0.8％，PH5.8。
所述生根预分化培养基RM5-1是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇1mg/L，蔗糖3％，琼脂0.8％，PH5.8。
所述生根预分化培养基RM5-1是包括以下成分的MS培养基：L-谷氨酰胺0.2g/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇1mg/L，蔗糖3％，琼脂0.8％，PH5.8。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种针对兴安天门冬的组培快繁方法，其特征在于包括以下步骤：
1)取兴安天门冬嫩茎作为外植体，清洗消毒，切成每个带有1～2个腋芽的茎段；
2)腋芽诱导培养；用于腋芽诱导培养的腋芽诱导培养基，其成分为：MS培养基，L-谷氨酰胺0.2g/L，6-BA0.2mg/L，激动素0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇0.1mg/L，3％蔗糖，琼脂0.8％；所述腋芽诱导培养基的pH为5.8；
3)根丛诱导培养：取步骤2)培养后的茎段，取其上长出的、超过5cm的茎，切去茎尖，平铺接种于根丛诱导培养基S2上，无菌培养20～30天，而后切除此期间长出的新生茎的茎尖，重新平铺接种于新的根丛诱导培养基S2上，继代培养1～2周期，直至每个叶腋处长出3～8个成簇的嫩茎，得到母体茎段，每个成簇的嫩茎群基部是后续诱导生根部位，即为根丛；
4)根丛增殖培养：取步骤3)所得的母体茎段，分割出若干株高为2～3cm的根丛，接种到根丛增殖培养基SA上，无菌培养20～30天，取出根丛，分割成2～4个小根丛，接种于新的根丛增殖培养基SA上，继代培养1～2周期；
5)生根预分化培养：取步骤4)培养后的小根丛，修剪至株高2～3cm，接种至生根预分化培养基RM5-1中，无菌培养20～30天，而后继代培养1～2周期；
6)生根培养：取步骤5)预分化培养后的小根丛，分割成若干株高为2～3cm的、每个带3～5个茎的子根丛，接种于生根培养基RM5-2中，无菌培养20～30天，继代培养1～2周期，直至60％以上子根丛基部长出3～5条肉质根；
其中，所述根丛诱导培养基S2的成分为：MS培养基，L-谷氨酰胺0.2g/L，6-BA 0.1mg/L，激动素0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇0.1mg/L，蔗糖3％，琼脂0.8％；所述根丛诱导培养基S2的pH为5.8；
所述根丛增殖培养基SA的成分为：MS培养基，L-谷氨酰胺0.2g/L，激动素0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇0.2mg/L，蔗糖3％，琼脂0.8％；所述根丛增殖培养基SA的pH为5.8；
所述生根预分化培养基RM5-1的成分为：MS培养基，L-谷氨酰胺0.2g/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇1mg/L，蔗糖3％，琼脂0.8％；所述生根预分化培养基RM5-1的pH为5.8；
所述生根培养基RM5-2的成分为：MS培养基，L-谷氨酰胺0.2g/L，萘乙酸0.2mg/L，嘧啶醇1.3mg/L，蔗糖6％，琼脂0.8％；所述生根培养基RM5-2的pH为5.8。
2.根据权利要求1所述的一种针对兴安天门冬的组培快繁方法，其特征在于步骤1)具体包括以下操作：取长度为10～20cm的兴安天门冬嫩茎作为外植体，流动水冲洗10min后，在无菌条件下切成3～4段，置于60～90％v/v浓度的酒精溶液中浸泡20～40秒，然后在有效氯为0.1～0.3％的次氯酸钠溶液中浸泡6～10分钟，无菌水冲洗3～4次，无菌滤纸吸干。
3.根据权利要求1所述的一种针对兴安天门冬的组培快繁方法，其特征在于步骤5)继代培养后部分根丛基部分化诱导长出1～2条肉质根。
4.根据权利要求1所述的一种针对兴安天门冬的组培快繁方法，其特征在于步骤6)所得产物每株上具有4～6根嫩茎和3～4条肉质贮藏根，所述贮藏根的根长为3～4cm。
5.根据权利要求4所述的一种针对兴安天门冬的组培快繁方法，其特征在于还包括以下步骤7)：在春季4～5月份或秋季9～10月份择时将步骤6)培养得到的组培苗开瓶，炼苗5～7天，洗净根部，修剪茎顶，移栽至大棚内泥炭土基质中，用遮光率为50～75％的遮阳网覆盖大棚进行遮光保湿处理7～10天，随后常规育苗管理20～30天，获得移栽成活的兴安天门冬幼苗植株。
6.根据权利要求1～4任一项所述的一种针对兴安天门冬的组培快繁方法，其特征在于所述无菌培养的条件均为：温度26～28℃，相对湿度70～80％，光照时间为12h/d，光照强度2500Lux。
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