ES2349102A1 - Procedimiento para la propagacion in vitro del esparrago. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la propagación in vitro del espárrago. Procedimiento de propagación de espárrago (del género Asparagus) mediante técnicas de cultivo de tejidos vegetales. Se describe un procedimiento de propagación in vitro del espárrago enfocado hacia el acortamiento del proceso de micropropagación conforme y hacia la obtención de un método eficaz y consistente, que nos permita obtener unos altos porcentajes de éxito en la clonación para una mayoría de genotipos, y reducir el tiempo necesario para la obtención de copias clónales de genotipos agronómicamente interesantes. El procedimiento de propagación in vitro del espárrago objeto de la presente invención consiste en el cultivo y desarrollo de estructuras gemantes ya preexistentes en el rizoma, cultivándose yemas axilares que ofrecen por ello una mejor garantía de estabilidad somacional, asimismo las raíces se forman a partir de un tejido de parénquima que se conserva en la parte basal de la zona gemante del rizoma que se utiliza como explanto. El procedimiento objeto de la presente invención, probado en genotipos muy diferentes incluyendo incluso una especie silvestre de espárrago A. maritimus, una variedad población ("Morado de Huétor") y varios cultivares de Asparagus officinalis ("UC-157", "Baitoru", y "Atlas") funciona bien en todos los genotipos evaluados y alcanza además unos rendimientos de enraizado bastante altos en todos los genotipos ensayados y en un periodo de tiempo bastante corto, obteniéndose plántulas de 3-4 semanas y en 6-8 semanas plantas de calidad y características idóneas para su trasplante y aclimatación, con un elevado rendimiento en la recuperación de plántulas de calidad al final del proceso de micropropagación.
Description
Procedimiento para la propagación in
vitro del espárrago.
Agricultura.
Sector viverista: Procedimiento de propagación
de espárrago (del género Asparagus) mediante técnicas de
cultivo de tejidos vegetales.
El espárrago cultivado (Asparagus
officinalis L.) es una especie monocotiledónea perteneciente a
la familia de las Liliaceas, originaria del próximo oriente y
desde hace al menos dos mil años cultivada como alimento y como
planta medicinal. La especie es diploide (n=10), perenne y dioica, y
por tanto de fecundación alógama.
A nivel mundial, el cultivo del espárrago es de
gran importancia económica siendo su superficie cultivada similar al
de otras hortalizas como ajo, pimiento, zanahoria o berenjena. La
producción mundial de espárrago es de 6.657.000 tm siendo China el
mayor productor con 5.906.000 tm seguido de Perú con 206.000 tm.
España es el sexto mayor productor de espárrago con 47.000 tm de las
que 16.500 tm se dedican a la exportación (FAO, 2005).
El espárrago es uno de los cultivos hortícolas
de regadío de mayor interés económico en España, tanto por su
consumo a nivel nacional, como por sus posibilidades de exportación
en fresco a otros países de la UE, en fechas en las que
prácticamente no hay producción en otras áreas de Europa, y tiene
gran importancia social debido al elevado número de jornales que
requiere su recolección y manipulación posterior, en épocas del año
con altos niveles de desempleo en el sector agrícola. En España,
como en otros países mediterráneos, también se consumen especies
silvestres de espárrago Asparagus albus L., Asparagus
acutifolius L. o Asparagus aphylus L., que crecen
espontáneamente en Cataluña, Aragón y Andalucía.
El espárrago (género Asparagus) es una
especie que normalmente se multiplica mediante semillas y en
ocasiones por división vegetativa de su rizoma. La tradicional
propagación por semillas puede producir plantaciones con una gran
variabilidad genética y por lo tanto plantaciones con una
productividad limitada y heterogénea al no presentar todos los
individuos una calidad uniforme. La opción de una división
vegetativa para la multiplicación del espárrago, tiene habitualmente
un rendimiento muy bajo, requiere una gran cantidad de mano de obra
para su realización y puede favorecer la transmisión de
enfermedades, lo que hace este método muy poco rentable para las
empresas viveristas productoras de plantones de espárrago.
Para solucionar estos problemas y tener un
sistema fiable para la propagación clonal masiva de genotipos de
calidad en espárrago, se han aplicado dos técnicas alternativas de
cultivo de tejidos vegetales in vitro, que son el desarrollo
de embriones somáticos y la micropropagación clonal conforme. Ambos
métodos tienen sus ventajas e inconve-
nientes.
nientes.
El desarrollo de embriones somáticos consiste en
la inducción in vitro mediante reguladores de crecimiento
(auxinas) de unas estructuras adventicias de tipo bipolar, es decir
con un meristemo caulinar y otro meristemo opuesto radicular y por
lo tanto muy parecidas a un embrión zigótico, pero originadas a
partir de células somáticas. Este método presenta problemas de
conversión en planta, debidos a problemas en la maduración de los
embriones somáticos y generación de procesos de embriogénesis
secundaria cíclica y por derivación de los cultivos a la formación
de tejidos de callo; también presenta problemas de inducción de
variabilidad genética no deseada que se produce debido a la
agresividad de los métodos utilizados en la inducción de la
embriogénesis somática y que resulta en la proliferación de
estructuras embriogénicas anormales y fuera de tipo no utilizables a
efectos de propagación, además, para la producción en masa de
embriones somáticos es necesario un equipamiento técnico
complejo
(bioreactores).
(bioreactores).
La micropropagación clonal del espárrago para
obtener copias conformes de genotipos específicos, se realiza
mediante técnicas como el cultivo de meristemos y el cultivo de
secciones nodales con yemas axilares. Este método tiene la
desventaja de ser un método lento e ineficiente y no válido para
todos los genotipos.
El cultivo de meristemos de esta especie fue
puesto a punto por Murashige et al. (1972) y Hasegawa et
al. (1973), obteniendo protocolos de buen rendimiento, aunque la
dificultad técnica y la gran cantidad de tiempo necesario para el
aislamiento de los meristemos, desaconsejan la aplicación de dichos
métodos para su utilización a gran escala por inviables.
Posteriormente Yang y Cloré (1.973) desarrollaron técnicas de
micropropagación para el espárrago a partir de secciones nodales,
consistentes en la inducción de ramificación axilar. Estos trabajos
fueron seguidos por otros para mejorar y refinar los diversos
aspectos del proceso de micropropagación, así Yang y Cloré (1974a),
Chin (1982), Desjardins (1984), Khunachack et al. (1987) y
Doré (1988) incluyeron diversos suplementos (sacarosa) y retardantes
de crecimiento (Desjardins et al., 1987) en los medios de
cultivo con objeto de mejorar las tasas de enraizado y obtener un
mayor número de plántulas de buena calidad adecuadas para su
aclimatación y transplante. La conjunción de estas técnicas de
cultivo de secciones nodales paulatinamente refinadas y mejoradas
por estos autores finalmente concluyó en el desarrollo y la
publicación de un procedimiento de micropropagación (Desjardins,
1992) que desde entonces es el método utilizado de forma general
para la micropropagación clonal del espárrago. Este procedimiento de
micropropagación (Desjardins, 1992) presenta varios problemas: no es
aplicable a todas las variedades y especies de espárrago y en muchos
casos cuando el procedimiento funciona lo hace con un rendimiento
muy bajo en lo que se refiere a la capacidad de inducción di novo de
zonas gemantes análogas a las garras (crowns) que se producen de
forma natural en el rizoma, y a la capacidad de enraizado de estas
zonas gemantes. Además este proceso de formación de zonas gemantes
di novo y el enraizado precisa de mucho tiempo para su
desarrollo y la obtención de plántulas (de 4 a 14 meses dependiendo
del genotipo) y en muchos casos también se encuentran problemas en
la aclimatación de dichas plántulas micropropagadas, posiblemente
por falta de calidad de las plantas recuperadas tras el largo
proceso de micropropagación, que requiere la utilización de al menos
dos medios diferentes para su realización. Es decir que el método de
micropropagación de Desjardins (1992) es utilizable pero es un
método lento, dependiente del genotipo, de bajo rendimiento y con
unos resultados muy erráticos ya que depende de la inducción y
formación di novo de una estructura gemante adventicia y de
un enraizado posterior lo que se suele producir de forma
impredecible y errática, lo que complica enormemente la programación
de un trabajo de micropropagación, y de hecho limita su aplicación a
unos pocos genotipos con excelente comportamiento morfogenético
in vitro.
La patente de Yukimasa et al. (1990)
propone la utilización de crowns o explantos de zoca (nudos
gemantes), previamente inducidos in vitro a partir de un
explanto de sección nodal de turión, brote aéreo joven sin
ramificación axilar, recién brotado desde el rizoma, para realizar
la micropropagación en masa de espárrago.
El procedimiento objeto de la presente invención
trata exactamente de evitar la fase de inducción de zonas gemantes
in vitro, puesto que este es el cuello de botella tanto de
este método (Yukimasa et al., 1990) como del método de
Desjardins (1992) y métodos anteriores. Todos estos métodos implican
la inducción adventicia de estructuras gemantes y por lo tanto
pueden ocasionar variaciones somaclonales que modifiquen el genotipo
original, es decir que podrían comprometer la micropropagación
clonal. Y además es necesario, en muchos casos, inducir de forma
adventicia el enraizado del material y en muchas ocasiones y
dependiendo del genotipo, los porcentajes de enraizado son bajos e
incluso nulos y requieren de un largo periodo de cultivo in
vitro en muchos casos superior a 6 meses. En el método de
Yukimasa et al. (1990) el tiempo mínimo que los autores
proponen para obtener una plántula susceptible de ser transplantada
y aclimatada es de 8 semanas sin incluir ningún tiempo de
endurecimiento, además todos los trabajos de micropropagación se
realizan con el cultivar Hokkai 100, excepto en el Ejemplo 1 en el
que se utiliza el cultivar Mary Washington 500, para estudiar la
formación de una zona gemante ("crown") y donde no se indican
otros resultados de propagación, recuperación de plantas ni de
aclimatación para este cultivar. Puesto que la micropropagación
in vitro del espárrago es muy dependiente del genotipo, este
método de micropropagación de Yukimasa et al. (1990), podría
fácilmente no ser utilizable para otros cultivares de Asparagus
officinalis u otras especies de Asparagus (como A.
maritimus, A. verticillatus, A. robustus, A.
cooperi).
Por todo ello la micropropagación conforme del
espárrago plantea varios problemas importantes:
- 1)
- Los métodos existentes (Murashige et al., 1972; Yukimasa et al., 1990; Desjardins, 1992) no pueden aplicarse a un número amplio de genotipos de espárrago, es decir no se pueden utilizar para propagar vegetativamente todas la variedades y líneas genéticas de la especie Asparagus officinalis o sus híbridos y tampoco son aplicables a otras especies del género Asparagus (A. maritimus, A. verticillatus, A. robustus, A. cooperi), o al menos su uso no se ha descrito para dichas especies.
- 2)
- Los métodos existentes (Murashige et al., 1972; Yukimasa et al., 1990; Desjardins, 1992) no son ni eficientes ni fiables, a menudo la tasa de éxito es muy baja y los métodos funcionan de manera errática, estando los resultados estrechamente ligados al genotipo.
- 3)
- Las épocas disponibles para el inicio de los cultivos in vitro están fuertemente limitadas por la componente estacional del desarrollo del espárrago, al iniciarse los cultivos sólo en la época en la que las plantas emiten turiones.
- 4)
- Los métodos de micropropagación existentes (Murashige et al., 1972; Yukimasa et al., 1990; Desjardins, 1992) son extremadamente lentos y aproximadamente requieren entre 5 y 14 meses para su completo desarrollo.
- 5)
- Los métodos existentes de micropropagación (Murashige et al., 1972; Yukimasa et al., 1990; Desjardins, 1992) no son utilizables a nivel de propagación comercial, por su dificultad técnica, escaso rendimiento y/o coste final.
Por todo lo expuesto, hasta el momento no se ha
resuelto la necesidad de desarrollar procedimientos de propagación
in vitro del espárrago que sean eficientes y fiables,
aplicables a un amplio número de genotipos, no limitados por un
componente estacional, que permitan acortar el tiempo total para la
producción de plantas por debajo de los 5 meses y utilizables a
nivel comercial. Este ha sido el objeto de la presente invención y
su novedad radica en que permite desarrollar un procedimiento para
la propagación in vitro del espárrago que es aplicable a
múltiples genotipos y especies de espárrago, es eficiente y fiable,
poco dependiente del genotipo y los explantos pueden ser obtenidos
durante casi todo el año, ampliándose la ventana de tiempo que
permite obtener el material para el inicio. Además, el procedimiento
de propagación in vitro del espárrago objeto de la presente
invención acorta sustancialmente el tiempo total de producción de
plantas a unos 3 meses, no es técnicamente complejo en su
realización, los rendimientos de conversión en plantas son adecuados
y permiten su utilización a nivel comercial y facilita y permite la
conservación de germoplasma de espárrago mediante
crioconservación.
El objeto de la presente invención se refiere a
un procedimiento de propagación in vitro del espárrago
enfocado hacia el acortamiento del proceso de micropropagación
conforme y hacia la obtención de un método eficaz y consistente, que
nos permita obtener unos altos porcentajes de éxito en la clonación
para una mayoría de genotipos, y reducir el tiempo necesario para la
obtención de copias clónales de genotipos agronómicamente
interesantes.
El procedimiento de propagación in vitro
del espárrago objeto de la presente invención consiste en el cultivo
y desarrollo de estructuras gemantes ya preexistentes en el rizoma,
cultivándose yemas axilares que ofrecen por ello una mejor garantía
de estabilidad somaclonal, asimismo las raíces se forman a partir de
un tejido de parénquima que se conserva en la parte basal de la zona
gemante del rizoma que se utiliza como explanto. El procedimiento
objeto de la presente invención, probado en genotipos muy diferentes
incluyendo incluso una especie silvestre de espárrago A.
maritimus, una variedad población ("Morado de Huétor") y
varios cultivares de Asparagus officinalis
("UC-157", "Baitoru", y "Atlas")
funciona bien en todos los genotipos evaluados y alcanza además unos
rendimientos de enraizado bastante altos en todos los genotipos
ensayados y en un periodo de tiempo bastante corto, obteniéndose
plantas completas en 3-4 semanas y en
6-8 semanas plantas de calidad y características
idóneas para su transplante y aclimatación, con un elevado
rendimiento en la recuperación de plántulas de calidad al final del
proceso de micropropa-
gación.
gación.
El procedimiento de propagación in vitro
de plantas de espárrago objeto de la presente invención se basa en
la puesta en cultivo y micropropagación a partir de yemas
subterráneas de espárrago obtenidas de la zoca (garra) de la planta.
Estas yemas subterráneas deben ser de un tamaño de entre
0.4-1.0 cm, deben estar sanas y bien hidratadas, y
para su uso deben ser individualizadas de las otras yemas que estén
a su alrededor en el rizoma y separadas de los fragmentos de raíz de
la zoca, las yemas deben estar en dormancia. Este sistema reduce
sustancialmente el tiempo necesario para completar el proceso de
micropropagación, al evitar uno de los pasos mas lentos e
imprevisibles de los procedimientos preexistentes: el desarrollo de
una estructura gemante (garra=crown) a partir del brote axilar
crecido in vitro.
Además, el método objeto de la presente
invención permite simplificar y abaratar el proceso de
micropropagación, si se aplica un óptimo procedimiento de
descontaminación de los explantos primarios que permitan el
establecimiento in vitro en condiciones asépticas del
material.
En un aspecto la presente invención se refiere a
un procedimiento de propagación in vitro del espárrago
caracterizado porque comprende una preparación del explanto y
desinfección (i), seguido de la aplicación de un pretratamiento
(ii), a continuación se realiza el establecimiento del explanto para
su incubación y multiplicación (iii) y finalmente se transplantan y
aclimatan las plántulas micropropagadas (vi).
La aplicación del procedimiento de propagación
in vitro de espárrago para la propagación de cualquier
especie cultivada o silvestre del género Asparagus, o de
cualquier variedad o genotipo de espárrago constituye un aspecto
particular de la presente invención.
En otro aspecto particular la presente invención
se refiere a cualquier especie cultivada o silvestre del género
Asparagus o cualquier variedad o genotipo de espárrago
propagado in vitro mediante el procedimiento objeto de la
presente invención.
Se detallan los pasos sucesivos para la
realización del procedimiento de micropropagación. A:
Obtención del material vegetal (zoca de
espárrago), B: Limpieza y preparación de los explantos C: Yemas de
rizoma, D: Disección y obtención de los explantos, E: Desinfección
de los explantos, pretratamiento, establecimiento y desarrollo in
vitro, F: Cultivo, G: Multiplicación, H: Obtención de las
plántulas, I: Transplante de plantas micropropagadas, J:
Aclimatación en invernadero.
Aspecto de un cepellón de espárrago obtenido al
extraer mecánicamente una parte de la zoca de la planta de
espárrago, desgajándola del cepellón principal, en un proceso
denominado "casqueado" en la zona esparraguera de
Huétor-Tájar.
Aspecto de las garras (compuesta por brotes
secos, raíces y rizoma (con zonas con racimos de yemas) tras la
eliminación de la tierra del cepellón y un primer lavado.
Aspecto de los racimos de yemas del rizoma,
limpios y preparados para la primera desinfección.
Aspecto de un racimo de yemas del rizoma después
de la primera desinfección y antes de su disgregación y disección
para obtener el explanto primario del procedimiento objeto de la
presente invención.
Aspecto de los explantos de yema de rizoma tras
la disección y la desinfección, preparados para su establecimiento
in vitro.
Aspecto de las plántulas desarrolladas a partir
de yemas de la zoca A al inicio del proceso de incubación, y B al
final del periodo de incubación en el medio de multiplicación.
Plántulas obtenidas in vitro después de 4
semanas en un túnel de aclimatación en invernadero.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de propagación in vitro del espárrago enfocado
hacia el acortamiento del proceso de micropropagación conforme y
hacia la obtención de un método eficaz y consistente, que nos
permita obtener unos altos porcentajes de éxito en la clonación para
una mayoría de genotipos, y reducir el tiempo necesario para la
obtención de copias clónales de genotipos agronómicamente
interesantes.
El problema técnico de la mayoría de los
procedimientos de micropropagación de espárrago desarrollados hasta
el momento es que para su propagación in vitro el espárrago
necesita varios requisitos, entre los que destaca que para el
desarrollo de plantas completas y de transplante viable requiere la
formación de una zona gemante en cualquier parte del explanto de la
que se desarrollen raíces de dos tipos nutricias y de reserva. En
caso contrario, las plantitas obtenidas por cultivo in vitro
mueren en la fase de aclimatación y el proceso no es viable.
La inducción de esa zona gemante
(aerial-crown o crown en inglés, zoca o garra en
español) en el explanto de sección nodal que se establece in
vitro, o en cualquier parte de un brote que se cultive in
vitro, es el principal cuello de botella y el principal problema
a resolver en la micropropagación de cualquier tipo de espárrago.
Esta inducción y la subsecuente formación de raíces no ocurre en
muchos casos, es muy dependiente del genotipo y consume una gran
cantidad de tiempo y esfuerzo mecánico. Incluso con una serie de
mejoras desarrolladas por nuestro equipo en los procedimientos
existentes, el sistema mas utilizado (Desjardins, 1992) es lento y
muy poco eficiente, excepto para unos poco genotipos.
Como alternativa al cultivo de secciones
nodales, se propone un procedimiento consistente en la puesta en
cultivo y micropropagación a partir de yemas subterráneas de
espárrago obtenidas de la zoca (garra) de la planta. Este sistema
reduce sustancialmente el tiempo necesario para completar el proceso
de micropropagación, al evitar uno de los pasos mas lentos e
imprevisibles del procedimiento preexistente: el desarrollo de una
estructura gemante (garra=crown) a partir del brote axilar crecido
in vitro. El procedimiento aplica un óptimo método de
descontaminación de explantos primarios que permite el
establecimiento in vitro en condiciones asépticas del
material lo que simplifica y abarata el proceso de
micropropagación.
El procedimiento de propagación in vitro
del espárrago objeto de la presente invención permite un
acortamiento y simplificación del proceso de micropropagación del
espárrago cultivado, a 2 meses in vitro mas 1 mes de
aclimatación, y la utilización de un único medio de cultivo para
todo el proceso, mediante el desarrollo y optimización de un
procedimiento innovador y muy eficiente para la micropropagación
clonal de genotipos de espárrago, a partir de yemas subterráneas
obtenidas del rizoma (zoca o garra) de la planta. Además permite
solucionar la mayor parte de los problemas técnicos planteados por
las tecnologías desarrolladas hasta el momento dado que es aplicable
a múltiples genotipos y especies de espárrago, es un procedimiento
eficiente y fiable, poco dependiente del genotipo, los explantos
pueden ser obtenidos durante casi todo el año, ampliándose la
ventana de tiempo para el inicio del material in vitro, sus
rendimientos de conversión en plantas son adecuados y permiten ser
utilizados a nivel comercial (una vez efectuados los ajustes
necesarios para cada caso). Además, este procedimiento facilita y
permite la conservación de germoplasma de espárrago
(crioconservación).
El procedimiento de propagación in vitro
del espárrago objeto de la presente invención consta de las
siguientes etapas:
- 1.
- Preparación del explanto y desinfección: Se extrae de una planta de espárrago un trozo del rizoma completo (raíz, tallo subterráneo y tallo aéreo) (Fig. 2). De este material se eliminan tallos aéreos y raíces así como el material deteriorado o necrótico del rizoma. Este material se lava, a continuación se separa en grupos de yemas más pequeños, se vuelve a lavar y una vez limpio, se divide nuevamente en secciones más pequeñas (Fig. 3). A continuación, debe ser tratado con una solución fungicida, tras la que se aplica una solución desinfectante (Fig. 1).
- Tras esta desinfección se procede a la extracción y disección de las yemas utilizando una lupa, con un escalpelo se van eliminando capas de brácteas hasta que su tamaño sea de 1-3 mm. El explanto así preparado debe incluir la yema con varias brácteas y su correspondiente meristemo apical y un trozo de tejido parenquimático en la base de dicha yema siendo en esta zona parenquimática basal donde se formarán los meristemos de raíz y primordios radiculares. (Fig. 4). Estas yemas son tratadas con una solución antioxidante, tras el cual se tratan de nuevo con una solución fungicida y a continuación se desinfectan, para ser finalmente lavadas en condiciones asépticas (Fig. 5).
- 2.
- Pretratamiento: Una vez preparados y desinfectados los explantos son sometidos a un pretratamiento-pulso con una solución compuesta por una formulación mineral MS suplementada con sacarosa y ácido naftalenacético (ANA), ajustada al pH adecuado, durante un corto periodo de tiempo (desde unos minutos a unas horas).
- 3.
- Establecimiento del explanto e incubación para la multiplicación: Una vez preparados los explantos, desinfectados y pretratados se introducen en medio de cultivo hasta la mitad y en posición vertical, con el extremo de la yema hacia arriba y se incuban a una temperatura entre 24-26ºC, con la intensidad luminosa y fotoperiodo adecuado durante un periodo de en torno a 6 semanas. El medio utilizado para esta incubación tiene como base una formulación mineral de Murashique y Skoog (1962) (MS), suplementado con vitaminas según Nitsch y Nitsch (1969) y con citoquininas, auxinas, retardantes de crecimiento, sacarosa y agar (Fig. 6). Durante esta fase los explantos que muestren cualquier tipo de contaminación serán eliminados. Durante la incubación en el medio de establecimiento-multiplicación por un periodo de 4 a 6 semanas se produce la multiplicación de los explantos y su desarrollo a plántulas completas, al final de este periodo las plantitas deben alcanzar un tamaño mínimo de 10-15 cm. Las plántulas de este tamaño pueden ser extraídas de los contenedores de cultivo para su transplante y aclimatación (Fig. 7).
- La tasa de multiplicación es de 1-2 plantas por yema cultivada, esta tasa se puede aumentar incrementando los tiempos de incubación y mediante subdivisión de la zona gemante y posterior subcultivo. Lo que supone repetir el proceso de micropropagación descrito en la tercera etapa (establecimiento del explanto e incubación para la multiplicación).
- 4.
- Aclimatación: Las plantas desarrolladas in vitro de 6 a 10 semanas, con brotes de un tamaño aproximado de 10 cm de longitud y 6 cm de raíces se transplantan a macetas con un sustrato a base de turba y perlita, con adición de un fertilizante de liberación lenta y se aclimatan en túneles de aclimatación provistos de un sistema de niebla artificial sobre bancadas provistas de calefacción. Para la aclimatación las plantas se someten a periodos sucesivos de disminución de la humedad relativa mediante apertura temporal de la cubierta plástica del túnel. Aumentando los tiempos de apertura paulatinamente conforme avanza el proceso de aclimatación. El objetivo es activar el metabolismo de la planta mediante la inducción de un estrés hídrico controlado. Este proceso se realiza durante un periodo entre 3 y 5 semanas (Fig. 8).
- Finalizado el proceso las plantas de espárrago propagadas in vitro obtenidas mediante el procedimiento descrito están listas para su transplante al campo de cultivo.
Mediante el procedimiento de propagación in
vitro del espárrago objeto de la presente invención se consigue
un acortamiento del proceso de micropropagación conforme, el método
es eficaz y consistente, permite obtener unos altos porcentajes de
éxito en la clonación para una mayoría de genotipos, reduciendo el
tiempo necesario para la obtención de copias clónales de genotipos
agronómicamente interesantes.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y
no deben ser considerados en sentido limitativo de la misma.
Ejemplo Nº
1
Como material de partida se utilizaron plantas
de espárrago de la variedad población "Morado de Huétor".
Se extrajo de una planta de espárrago de la
variedad "Morado de Huétor" un trozo del rizoma completo (raíz,
tallo subterráneo y tallo aéreo). De este material se eliminaron
tallos aéreos y raíces así como el material deteriorado o necrótico
del rizoma (este rizoma o tallo subterráneo es de color marrón
claro, de forma aplanada y desde el punto de crecimiento inicial de
la plántula germinada de la semilla, se desarrolla de forma
centrípeta en una serie de extensiones redondeadas y aplanadas ricas
en tejido parenquimático, desde las que se desarrollan raíces y
grupos en roseta de yemas subterráneas de forma periforme cubiertas
de brácteas). Tras esta primera separación, el material vegetal
resultante se lavó con abundante agua corriente, hasta eliminar toda
la tierra y detritos que llevaba adheridos, para ello se disgregó el
material con las manos en pequeños trozos "naturales" y
finalmente se separaron en grupos de yemas más pequeños con ayuda de
unas tijeras o un escalpelo. El material así preparado se lavó
inmediatamente con abundante agua jabonosa varias veces hasta que el
agua resultante del lavado quedó limpia tras el aclarado. A
continuación el material se volvió a dividir en porciones mas
pequeñas y se introdujo en una solución con fungicida (Benomilo al
0.1%) y aclarado durante 20-30 minutos en agitación.
Luego se aclaró una vez en agua corriente. Después se desinfectó en
una solución de hipoclorito sódico al 2% en vacío.
Tras la desinfección se procedió a la extracción
y disección de las yemas, de las que con ayuda de un escalpelo y
bajo una lupa se fueron eliminando capas de brácteas hasta que su
tamaño quedó entre 1-3 mm. Los explantos preparados
incluían la yema con varias brácteas, con su correspondiente
meristemo apical y un trozo de tejido parenquimático en la base de
la misma, quedando morfológicamente con una forma parecida a un
bulbo. A continuación, mientras se desarrollaba el proceso de
disección las yemas preparadas se introdujeron en una solución
antioxidante compuesta por 150 mg/l de ácido cítrico y 100 mg/l de
ácido ascórbico. A continuación la yemas se envolvieron en una gasa
estéril y se trataron de nuevo con fungicida (Benomilo al 0.05%) en
agitación y durante 15 minutos. Posteriormente las yemas se
aclararon con agua corriente y se desinfectaron de nuevo con una
solución de hipoclorito sódico al 2% en vacío. Luego, y ya en el
interior de una cabina de flujo laminar y en condiciones asépticas,
las yemas se lavaron tres veces durante 5 minutos con agua destilada
estéril y quedaron preparadas para su establecimiento in
vitro. El porcentaje de desinfección obtenida fue del 95% (Tabla
1).
Los explantos se sometieron a un
pretratamiento-pulso en una solución compuesta por
una formulación mineral basal MS suplementada con 30 g/l de sacarosa
y 10 mg/l de ANA durante 1 hora, la solución se ajustó previamente a
un pH 5.7, tras lo que se esterilizó en frío mediante un sistema
Millipore.
Una vez establecidos los explantos in
vitro en condiciones asépticas se incubaron durante
6-10 semanas en una cámara de cultivo a 25\pm1ºC y
una intensidad luminosa de de 42 \muE m^{2} s^{-1}, con un
fotoperíodo de 16/8. Cuando las plántulas obtenidas in vitro
alcanzaron un tamaño mínimo de unos 10-15 cm el
material se extrajo de los contenedores de cultivo para su
transplante y aclimatación. En la Tabla 3 se recogen los porcentajes
de enraizado obtenidos.
Se utilizó un único medio de cultivo cuya base
es una formulación mineral de Murashigue y Skoog (1962) suplementada
con la vitaminas de Nitsch y Nitsch (1969) y con una combinación de
auxinas y citoquininas: ANA (ácido naftalenacético) mas Kinetina,
ANA mas 2iP (2-isopentenil adenina), ANA mas
Kinetina mas 2iP e incluso ANA o AIA (ácido indolacético) sin
citoquininas, y con i-inositol 100 mg/l, Thiamina
100 mg/l, ancymidol (entre 0.5 y 3 mg/l), sacarosa (60 g/L),
gelificado con agar (7-8 g/l). Los explantos de
espárrago se introdujeron en el medio de cultivo hasta la mitad y en
posición vertical, con el extremo distal de la yema hacia arriba y
se incubaron a 25\pm1ºC y con una intensidad luminosa de 2000lux y
un fotoperiodo de 16 horas de luz 18 de oscuridad durante
6 semanas.
6 semanas.
Los rangos de aplicación del AIA están entre
0,05 y 1 mg/l.
Los rangos de aplicación del 2iP están entre 0.1
y 1 mg/l.
Los rangos de aplicación del ANA están entre
0.05 y 1 mg/l.
Los rangos de aplicación de la Kinetina están
entre 0.05 y 1 mg/l.
Los rangos de aplicación del ancymidol están
entre 0.5 y 3 mg/l.
Los rangos de aplicación de la sacarosa están
entre 30 y 60 g/l.
Se utilizaron distintas proporciones entre ANA y
Kinetina (1:1, 3:5, 3:7, 5:7, 5:10, 6:10).
La combinación que dio los mejores resultados en
el mayor porcentaje de genotipos ensayados de esta variedad
población, fue 0.5 mg/l de ANA mas Kinetina 0.7 mg/l, mas 2 mg/l de
ancymidol, con 60 g/l de sacarosa (medio MGE) (Tabla 2).
Este medio puede ser modificado para adaptarlo a
genotipos que no se desarrollen bien en esta combinación de
reguladores mediante la sustitución del ANA por AIA o adición de
AIA.
La tasa de multiplicación fue de
1-2 plantas por yema cultivada, esta tasa se pudo
aumentar incrementando los tiempos de incubación y mediante
subdivisión de la zona gemante y su posterior subcultivo,
reiniciando el proceso desde el punto 2.
Las plantas desarrolladas in vitro de 6 a
10 semanas, con brotes de un tamaño aproximado de 10 cm de longitud
y raíces de 6 cm se extrajeron de los recipientes de cultivo, se
lavaron bajo el grifo con abundante agua, cuidando de eliminar todos
los restos del medio de cultivo y se pasaron a macetas con un
sustrato preparado mezclando turba y perlita en una proporción de
7:3, añadiéndose unos 10 gránulos por maceta de fertilizante de
liberación lenta (tipo Ficote). Las macetas se introdujeron en
túneles de aclimatación provistos de un sistema de niebla artificial
sobre bancadas provistas de calefacción.
El proceso de aclimatación se desarrolló de la
siguiente manera: Las plántulas se sometieron a periodos de
disminución de la humedad relativa mediante apertura temporal de la
cubierta plástica del túnel. Los tiempos de apertura se fueron
incrementando paulatinamente conforme avanzaba el proceso de
aclimatación. De este modo se activó el metabolismo de la planta
mediante la inducción de estrés hídrico controlado. Una vez por
semana se realizó un tratamiento fitosanitario de tipo preventivo
con un fungicida sistémico (Benomilo 50% p/p). El riego de las
plantas con agua corriente también se realizó una vez por semana. La
tasa de recuperación de planta fue del 95%
(Tabla 4).
(Tabla 4).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo Nº
2
Como material de partida se utilizaron plantas
de espárrago de la variedad UC-157.
Las etapas 1: Preparación del explanto y
desinfección se realizó tal y como se ha descrito para el ejemplo Nº
1, la Tabla 1 recoge los porcentajes de éxito obtenidos en la
desinfección de explantos. Las variaciones se produjeron en la etapa
2: Pretratamiento: En este caso se utilizó una solución compuesta
por una formulación mineral basal MS suplementada con 60 g/l de
sacarosa y 10 mg/l de ANA durante 1 hora, dicha solución fue
ajustada a un pH 5.7, tras lo que se esterilizó en frío mediante un
sistema Millipore, como en el ejemplo Nº 1.
En la etapa 3: Establecimiento del explanto e
incubación para la multiplicación se procedió tal y como se ha
descrito en el Ejemplo Nº 1, la Tabla 3 recoge el porcentaje de
enraizado obtenido. La combinación que dio los mejores resultados en
este genotipo UC-157, fue 0.3 mg/l de ANA mas
Kinetina 0.5 mg/l, mas 1.3 mg/l de ancymidol, con 40 g/l de sacarosa
(Tabla 2). La tasa de multiplicación fue de 1-2
plantas por yema cultivada, por lo tanto se alcanzaron valores
similares a los obtenidos en el Ejemplo Nº 1 para la variedad
"Morado de Huétor".
En la etapa 4: Aclimatación se procedió tal y
como se ha descrito en el Ejemplo Nº 1, La tasa de recuperación de
planta fue del 80% (Tabla 4).
\newpage
Ejemplo Nº
3
Como material de partida se utilizaron plantas
de espárrago de una especie silvestre el Asparagus
maritimus.
Las etapas, 1: Preparación del explanto y
desinfección se realizó tal y como se han descrito para el Ejemplo
Nº 1, la tabla 1 recoge los porcentajes de éxito obtenidos en la
desinfección de explantos. Las variaciones se produjeron en la etapa
2: Pretratamiento en este caso se utilizó una solución compuesta por
una formulación mineral basal MS suplementada por una combinación de
60 g/l de sacarosa y 5 mg/l de ANA durante 1 hora y la solución se
ajustó previamente a un pH 5.7, tras lo que se esterilizó en frío
mediante un sistema Millipore, como en el ejemplo Nº 1.
En la etapa 3: Establecimiento del explanto e
incubación para la multiplicación se procedió tal y como se ha
descrito en el Ejemplo Nº 1. La combinación que dio los mejores
resultados en este genotipo silvestre A. maritimus, fue 0.6
mg/l de ANA mas Kinetina 0.8 mg/l, mas 1 mg/l de ancymidol, con 40
g/l de sacarosa (Tabla 2). La tasa de multiplicación fue de
1-2 plantas por yema cultivada, por lo tanto se
alcanzaron valores similares a los obtenidos en el Ejemplo Nº 1
y
Ejemplo Nº 2 para las variedades "Morado de
Huétor" y "UC159". La Tabla 3 recoge el porcentaje de
enraizado obtenido.
En las etapa 4: Aclimatación se procedió tal y
como se ha descrito en el Ejemplo Nº 1, La tasa de recuperación de
planta fue del 80% (Tabla 4).
El procedimiento de propagación in vitro
del espárrago objeto de la presente invención también se ha probado
con éxito en los cultivares de Asparagus officinalis
"Baitoru" y "Atlas".
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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Patente: Method of multiplying plant belonging
to the genus asparagus.
Nº de Patente: EP0375218.
Solicitante: Mitsui Petrochemical Ind. (JP).
Nº de solicitud: EP19890312806 19891208.
Claims (29)
-
\global\parskip0.950000\baselineskip
1. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago caracterizado porque comprende las siguientes etapas:- (i)
- Preparación del explanto y desinfección.
- (ii)
- Pretratamiento.
- (iii)
- Establecimiento del explanto e incubación para la multiplicación.
- (iv)
- Aclimatación.
\vskip1.000000\baselineskip
- 2. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 1 caracterizado porque dicha preparación de explantos y desinfección (i) comprende las siguientes etapas:
- (i.i).
- Disgregado manual de los rizomas y eliminación de brotes y raíces.
- (i.ii).
- Lavado con abundante agua corriente y detergente.
- (i.iii).
- Desinfección con un fungicida.
- (i.iv).
- Lavado con agua corriente.
- (i.v).
- Desinfección con una solución desinfectante.
- (i.vi).
- Extracción y disección de las yemas del rizoma.
- (i.vii).
- Separación de las yemas y colocación en una gasa estéril.
- (i.viii).
- Tratamiento con solución antioxidante.
- (i.ix).
- Desinfección con un fungicida.
- (i.x).
- Lavado con agua corriente.
- (i.xi).
- Desinfección con solución desinfectante.
- (i.xii).
- Lavados finales.
\vskip1.000000\baselineskip
- 3. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 2 caracterizado porque dicha desinfección con fungicida (i.iii) se realiza con un fungicida cuya materia activa puede ser Benomilo u otros de similares características a una concentración entre el 0.05 y el 1%, durante un tiempo entre 10 y 40 minutos en agitación.
- 4. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 2 caracterizado porque dicha desinfección con fungicida (i.iii) se realiza con un fungicida a base de Benomilo a una concentración del 0.1%, durante un tiempo entre 20-30 min. en agitación.
- 5. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 2 caracterizado porque dicha desinfección con solución desinfectante (i.v) se realiza con una solución de hipoclorito sódico a una concentración entre el 0.5 y el 3%, durante un tiempo entre 10 y 25 minutos en vacío.
- 6. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 2 caracterizado porque dicha desinfección con solución desinfectante (i.v) se realiza con una solución de hipoclorito sódico a una concentración del 2%, durante un tiempo de15 minutos en vacío.
- 7. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 2 caracterizado porque dicha extracción y disección de las yemas del rizoma (i.vi) se realiza eliminando capas de brácteas hasta que su tamaño queda entre 1 y 3 mm.
- 8. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación anterior caracterizado porque dicha separación de las yemas (i.vi) se realiza dejando una yema con varias brácteas, con su correspondiente meristemo apical y un trozo de tejido parenquimático en la base de la misma.
- 9. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 2 caracterizado porque dicho tratamiento antioxidante (i.viii) se realiza colocando las yemas en una solución antioxidante mientras paulatinamente se procede a su disección.
\global\parskip1.000000\baselineskip
- 10. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación anterior caracterizado porque dicha solución antioxidante (i.viii) está compuesta por ácido ascórbico y ácido cítrico.
- 11. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación anterior caracterizado porque dicha solución antioxidante (i.viii) contiene entre 100 y 250 mg/l de ácido cítrico y entre 50 y 200 mg/l de ácido ascórbico.
- 12. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 2 caracterizado porque dicho tratamiento con fungicida (i.ix) se realiza con un fungicida cuya materia activa puede ser Benomilo u otros de similares características a una concentración entre el 0.01 y el 1%, durante un tiempo entre 5 y 30 minutos en agitación.
- 13. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 2 caracterizado porque dicho tratamiento con fungicida (i.ix) se realiza con un fungicida a base de Benomilo a una concentración del 0.05%, durante un tiempo entre 10 y 15 minutos, en agitación.
- 14. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 2 caracterizado porque dicha desinfección con solución desinfectante (i.xi) se realiza con una solución de hipoclorito sódico a una concentración entre el 0.5 y el 3%, durante un tiempo entre 10 y 25 minutos en vacío.
- 15. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 2 caracterizado porque dicha desinfección con solución desinfectante (i.xi) se realiza con una solución de hipoclorito sódico a una concentración del 2%, durante 15 minutos en vacío.
- 16. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 2 caracterizado porque dichos lavados finales (i.xii) se realizan mediante 3 lavados de 5 minutos con agua estéril y en condiciones asépticas en la cabina de flujo laminar.
- 17. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 1 caracterizado porque dicho pretratamiento (ii) se realiza utilizando una solución compuesta por una formulación mineral MS suplementada con sacarosa y ácido naftalénico (ANA) ajustada a pH adecuado y estéril, durante un tiempo variable entre 30 minutos y 2 horas.
- 18. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación anterior caracterizada porque dicho pretratamiento (ii) se realiza utilizando una solución compuesta por una formulación mineral MS suplementada con sacarosa en una concentración entre 20 g/l y 80 g/l, y una concentración de ácido naftalénico (ANA) entre 3 g/l y 20 g/l ajustada a pH entre 5 y 6, de acuerdo con las necesidades de cada genotipo a propagar, durante 1 hora.
- 19. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 1 caracterizado porque dicho establecimiento del explanto e incubación para la multiplicación (iii) se realiza durante un periodo de mínimo de 6 semanas incubando los explantos en un medio MS basal, suplementado con las vitaminas de Nitsch y Nistch (1989), i-inositol, tiamina, ancymidol, una combinación de citoquininas, auxinas, ancymidol y sacarosa, en cámara de cultivo con las condiciones adecuadas de luz y temperatura, hasta que las plántulas obtenidas adquieren un tamaño mínimo de entre 10 y 15 cm.
- 20. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación anterior caracterizado porque dicho establecimiento del explanto e incubación para la multiplicación (iii) se realiza en un medio basal MS suplementado con las vitaminas de Nitsch y Nitsch (1989) y agar (entre 5 y 10 g/l), i-inositol (entre 50 y 150 mg/l), tiamina (entre 50 y 150 mg/l), ancymidol (entre 0.3 y 4 mg/l) y una combinación de auxinas y citoquinas, elegida entre cualquiera de las combinaciones ANA más kinetina, ANA más kinetina mas 2iP e incluso ANA o AIA sin citoquininas y suplementado con sacarosa,
- 21. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según cualquiera de las reivindicaciones 19 y 20 caracterizado porque los rangos de concentración de dicha combinación de auxinas y citoquininas se encuentran entre los siguientes: para el AIA entre 0,05 y 1 mg/l, para 2iP entre 0,1 y 1 mg/l, para ANA entre 0,05 y 1 mg/l, para kinetina entre 0,05 y 1 mg/l y para sacarosa entre 30 y 60 g/l.
- 22. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación anterior caracterizado porque las proporciones de dicha combinación de auxinas más citoquininas se realiza utilizando proporciones entre ANA y kinetina según cualquiera de las combinaciones 1:1, 3:5, 3:7, 5:7, 5:10 ó 6:10.
- 23. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22 caracterizado porque dicho establecimiento del explanto e incubación para la multiplicación (iii) se realiza durante un periodo de entre 6-10 semanas, en cámara de cultivo a 25\pm1ºC, una intensidad luminosa de 42 \muE m^{2} s^{-1} y un fotoperiodo de 16 horas de luz 8 h de oscuridad.
- 24. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 1 caracterizado porque dicha aclimatación (iv) se realiza durante un periodo de entre 3 y 5 semanas, colocando las plántulas en macetas con sustrato preparado a base de una mezcla de turba y perlita, con fertilizante de liberación lenta en cantidad adecuada, e incubadas en túneles de aclimatación provistos de un sistema de niebla artificial sobre bancadas con calefacción.
- 25. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación anterior caracterizado porque dicha aclimatación (iv) se realiza utilizando un sustrato con una mezcla de turba y perlita en proporción 7:3, añadiendo unos 20 gránulos por maceta de fertilizante de liberación lenta (tipo Ficote), e introducción de las plántulas en túneles de aclimatación. A continuación las plántulas se someten a periodos sucesivos de disminución de la humedad mediante apertura de la cubierta del túnel, e incrementando los tiempos de apertura paulatinamente a medida que avanza el proceso de aclimatación.
- 26. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según cualquiera de las reivindicaciones 24 y 25 caracterizado porque dicha aclimatación (iv) se realiza aplicando una vez por semana un tratamiento fitosanitario de tipo preventivo con un fungicida sistémico tipo Benomilo a una concentración 50% p/p y riego de plantas con agua corriente.
- 27. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.
- 28. Aplicación del procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación anterior a cualquier especie cultivada o silvestre del genero Asparagus o a cualquier variedad o genotipo de espárrago.
- 29. Espárragos de cualquier variedad o genotipo así como de cualquier especie cultivada o silvestre propagados in vitro mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.
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