CN105340747B - 一种甘草无性快速繁殖方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种甘草无性快速繁殖方法。本发明通过将甘草茎段外植体接种到培养基中培养得到无菌苗，然后将无菌苗切成顶芽外植体、带有1个腋芽的茎段外植体和带有1个腋芽和根的外植体后接种到新的同种培养基中培养得到继代增殖的无菌苗，再将其移栽至栽培基质从而实现甘草无性快速繁殖；所用培养基的配方为KNO3和NH4NO3用量均减半的MS培养基添加0.1mg/L IBA，pH5.8。本发明方法的无菌苗生根诱导率为100％，40天就能出苗，50天后可移栽大田，移栽大田成活率为80％以上；可适用于多个甘草种的多个优良株系的快速繁殖。

Description

一种甘草无性快速繁殖方法
技术领域
本发明属于植物组培领域，具体涉及一种利用组织培养技术无性快速繁殖甘草的方法。
背景技术
甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)是豆科甘草属多年生草本植物，分布于我国北方干旱、半干旱地区的暧温带、寒温带大陆型季风候区，海拔高度250-1400米，年平均气温3-10℃。甘草茎叶为牲畜良好饲料，根有重要经济价值，是中药材中第一位的大宗中药材，也是我国传统的出口创汇大宗药材，同时，甘草还是食品、烟草、化妆品等行业中的重要原材料。为满足生产和市场对甘草的需求，迫切需要开展大面积的人工种植。甘草的实践生产繁殖通常采用种子育苗和根状茎繁殖，但种子萌发率一般只有5-10％(于林清等1999)，采用根状茎切分进行根状茎繁殖，用种量大，影响甘草的产量，且繁殖系数低，长期用根茎繁殖易感染病毒，导致种质退化，严重影响产量和品质。运用植物组织培养技术，将植物茎尖或腋芽在培养基中培养得到脱毒试管苗，在解决品种退化问题，短时间内获得大量的优良无性系，加快重要经济植物的栽培生产中起着极其重要的作用。因此，甘草快速繁殖技术的研发，将是实现工厂化、标准化快速获得大量优质甘草种苗的重要保障。
目前已有对甘草进行无菌苗繁殖的研究：利用种子、嫩茎、根状茎获得无菌苗，以顶芽诱导或腋芽为外植体诱导丛生芽、以诱导体细胞愈伤组织分化为芽或以花药诱导愈伤组织分化为芽再诱导丛生芽的发生等途径繁殖芽，经生根诱导获得无菌苗。以上所有的培养基均为MS培养基(见Murashige T,Skoog F(1962)A revised medium for rapid growthand bioassay with tobacco tissue cultures.Physiol Plant 15:473–497)添加多种激素。采用的激素有：萘乙酸(NAA 0.1～2mg/L)、6-苄氨基嘌呤(6-BA 0.2～4mg/L)、2,4二氯苯氧乙酸(2，4-D 0.5～1mg/L)、吲哚乙酸(IAA 0.1～1mg/L)、吲哚丁酸(IBA 0.1～1mg/L)、6-糠基氨基嘌呤(KT 0.2～2mg/L)。2012年6月27日，蔺海明和柳福智获得授权专利“甘草优质种苗快速繁殖的方法”(专利号为ZL201110024490.5)，该发明将种子接种MS培养基萌发培养无菌苗，后切取无菌苗的茎杆，接入MS+KH2PO410mg/L+NAA 0.5mg/L培养基进行培养获得无菌苗。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单、出苗快，能高效地无性繁殖多个甘草种的甘草无性快速繁殖方法。
本发明对甘草多个品种进行了大田枝条取材培养无菌苗，以腋叶和顶芽为外植体快速繁殖增殖芽，为甘草无性繁殖提供一种操作简单、设备要求低、繁殖快、再生苗成活高、适用于多个甘草品种的无性快速繁殖的方法，可为甘草产业人工种植提供大量优质种苗。
本发明的甘草无性快速繁殖方法，包括以下步骤：
a.无菌苗的培养：取甘草嫩枝并切除叶片，消毒后，将甘草嫩枝切成至少带有1个腋芽的茎段外植体，然后将茎段外植体接种到培养基中，待腋芽生根枝条伸长至含有5～8个腋芽，得到无菌苗；
b.无菌苗的继代增殖：将无菌苗切成顶芽外植体、至少带有1个腋芽的茎段外植体和至少带有1个腋芽和根的外植体，将上述外植体接种到新的培养基中培养，得到继代增殖的无菌苗；
c.无菌苗的移栽：将继代增殖的无菌苗取出，洗掉根部培养基，移栽至栽培基质中培养，得到甘草种苗；
所述的步骤a和b的培养基的配方为：每升培养基含有0.1mg IBA，余量为KNO3和NH4NO3用量均减半的MS培养基，pH5.8。
甘草种苗可以移到大田中培养。
所述的KNO3和NH4NO3用量均减半的MS培养基，是指KNO3和NH4NO3用量相对于常规MS培养基中的KNO3和NH4NO3用量减半，其他相同。
优选，所述的甘草为乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)、光果甘草(Radix Glycyrrhizae Glabrae)或胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Batalin)。
优选，所述的步骤a的消毒是将甘草嫩枝用自来水冲洗10分钟后，放入质量分数为0.1％的多菌灵溶液中浸泡5-10分钟，再用自来水洗涤5次，将嫩枝切成5厘米长茎段，用体积分数为75％酒精浸泡30秒，用无菌水冲洗1遍后，将茎段取出置于质量分数为0.1％的升汞溶液消毒10分钟，再用无菌水冲洗6遍，用无菌纸将茎段水分吸干，得到消毒后的甘草嫩枝。
优选，所述的步骤c的栽培基质是将沙、蛭石和营养土按质量比为1：1：2混合均匀而得。
优选，所述的步骤c的移栽至栽培基质中培养，是将洗掉根部培养基的继代增殖的无菌苗栽入栽培基质中，盖上保鲜膜，在膜上打些小孔，置于22±1℃，光强50～100μmol m– 2s–1，光照12h/天条件下培养，7天后揭去保鲜膜，继续培养3天后，移至玻璃温室培养，得到甘草种苗。
本发明的无菌苗的培养和无菌苗的继代增殖，在培养基上培养时，其培养温度和光照条件为甘草组培的常规培养温度和光照条件，优选为：22±1℃、光强50～100μmol m– 2s–1、光照12h/天。
所述的MS培养基为国际通用的培养基，其成份和配置方法见Murashige T,SkoogF(1962)A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissuecultures.Physiol Plant 15:473–497。
本发明提供了一种甘草无性快速繁殖方法，具有操作简单、出苗快的特点。本发明繁殖所用的外植体均来自于田间甘草嫩枝发育而来的腋芽和顶芽，只用1种培养基，省略一般再生芽需生根诱导后才能移苗所需要的不同培养基和时间，而且无菌苗成活高，无菌苗生根诱导率为100％，40天就能出苗，50天后可移栽大田，移栽大田成活率为80％以上。而且该方法可适用于多个甘草种的多个优良株系的快速繁殖，该技术在甘草可持续发展中具有显著的生态、经济和社会效益意义。
附图说明
图1为培养乌拉尔甘草嫩枝腋芽获得的无菌苗。
图2为无菌苗被切成带有顶芽、腋芽外植体接种新培养基后伸长生长为继代增殖的无菌苗。其中，a为顶芽外植体，b为带有1个腋芽的茎段外植体，c为基部带有1个腋芽和根的外植体；d、e、f分别对应为由a、b、c的外植体伸长生长得到的继代增殖的无菌苗。
图3为带有腋芽的外植体接种40天后生长为继代增殖的无菌苗。
图4为继代增殖的无菌苗移栽生长间生长。
图5为移至玻璃温室生长的乌拉尔甘草。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：乌拉尔甘草的无性快速繁殖
1.无菌苗的培养
从田间选择剪切健康生长良好的乌拉尔甘草嫩枝约15厘米长，切除叶片，用自来水冲洗10分钟后，放入质量分数为0.1％的多菌灵溶液中浸泡5-10分钟，再用自来水洗涤5次。将嫩枝切成5厘米长茎段，用体积分数为75％酒精浸泡30秒，用无菌水冲洗1遍后，用镊子将茎段取出置于质量分数为0.1％的升汞溶液消毒10分钟，再用无菌水冲洗6遍，用无菌纸将茎段水分吸干，得到消毒后的甘草嫩枝，将其切成带有1个腋芽的茎段外植体，逐个接种到培养基中，置于22±1℃、光强50μmol m–2s–1、光照12h/天的条件下培养，培养7天后，可见茎段接触培养基的基部长出根，腋芽生根枝条伸长；40天后，腋芽伸长高约5-8厘米，约有5～8个腋芽(图1)，由此得到无菌苗，生根率为100％。本步骤所述的培养基为MS培养基(其中的KNO3和NH4NO3均减半)+0.1mg/LIBA，其配制方法是按照配制MS培养基的方法配制改良MS培养基，只是KNO3和NH4NO3的用量均减半，由此得到改良MS培养基，然后在1L改良MS培养基中加入0.1mgIBA，混合均匀，调整pH5.8，得到培养基。
2.无菌苗的繁殖
将无菌苗从培养瓶中取出，无菌苗分别被切成三部分：基部带有1个腋芽和根的为一个外植体(图2c)、顶芽为一个外植体(图2a)、中间茎段部分分别切成带有1个腋芽的茎段外植体(图2b)，每株无菌苗一共可以切成约6～9个外植体，分别将其接种到新的培养基(同步骤1)中，置于22±1℃、光强50μmol m–2s–1、光照12h/天的条件下培养生长(图2d，e，f)。以40天为1个继代增殖周期，每1个继代增殖周期由1株苗可增殖形成5～8株苗(图3)。由此得到继代增殖的无菌苗。本步骤所述的培养基为MS培养基(其中的KNO3和NH4NO3均减半)+0.1mg/LIBA，其配制方法是按照配制MS培养基的方法配制改良MS培养基，只是KNO3和NH4NO3的用量均减半，由此得到改良MS培养基，然后在1L改良MS培养基中加入0.1mgIBA，混合均匀，调整pH5.8，得到培养基。
3.无菌苗的移栽
将生长到5厘米左右高的继代增殖的无菌苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由沙：蛭石：营养土按质量比为1：1：2的比例混合均匀而成的栽培基质中，盖上保鲜膜，在膜上打些小孔，置22±1℃，光强50μmol m–2s–1，光照12h/天，7天后揭去保鲜膜，继续培养3天后(图4)，移至玻璃温室(15-30℃)培养(图5)，得到甘草种苗，50天后移栽到大田中，存活率达80％以上。
实施例2：多个甘草种不同品系的无性快速繁殖
采取与实施例1相同的无菌苗的培养、繁殖和移栽方法，在光果甘草(RadixGlycyrrhizaeGlabrae)和胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Batalin)等多个品系也实现了无性快速繁殖，存活率均达80％以上。

Claims (6)

1.一种甘草无性快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.无菌苗的培养：取甘草嫩枝并切除叶片，消毒后，将甘草嫩枝切成至少带有1个腋芽的茎段外植体，然后将茎段外植体接种到培养基中，待腋芽生根枝条伸长至含有5～8个腋芽，得到无菌苗；
b.无菌苗的继代增殖：将无菌苗切成顶芽外植体、至少带有1个腋芽的茎段外植体和至少带有1个腋芽和根的外植体，将上述外植体接种到新的培养基中培养，得到继代增殖的无菌苗；
c.无菌苗的移栽：将继代增殖的无菌苗取出，洗掉根部培养基，移栽至栽培基质中培养，得到甘草种苗；
所述的步骤a和b的培养基的配方为：每升培养基含有0.1mg IBA，余量为KNO3和NH4NO3用量均减半的MS培养基，pH5.8。
2.根据权利要求1所述的甘草无性快速繁殖方法，其特征在于，所述的甘草为乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)、光果甘草(Radix Glycyrrhizae Glabrae)或胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Batalin)。
3.根据权利要求1所述的甘草无性快速繁殖方法，其特征在于，所述的步骤a的消毒是将甘草嫩枝用自来水冲洗10分钟后，放入质量分数为0.1％的多菌灵溶液中浸泡5-10分钟，再用自来水洗涤5次，将嫩枝切成5厘米长茎段，用体积分数为75％酒精浸泡30秒，用无菌水冲洗1遍后，将茎段取出置于质量分数为0.1％的升汞溶液消毒10分钟，再用无菌水冲洗6遍，用无菌纸将茎段水分吸干，得到消毒后的甘草嫩枝。
4.根据权利要求1所述的甘草无性快速繁殖方法，其特征在于，所述的步骤c的栽培基质是将沙、蛭石和营养土按质量比为1：1：2混合均匀而得。
5.根据权利要求1所述的甘草无性快速繁殖方法，其特征在于，所述的步骤c的移栽至栽培基质中培养，是将洗掉根部培养基的继代增殖的无菌苗栽入栽培基质中，盖上保鲜膜，在膜上打些小孔，置于22±1℃，光强50～100μmol m–2s–1，光照12h/天条件下培养，7天后揭去保鲜膜，继续培养3天后，移至玻璃温室培养，得到甘草种苗。
6.根据权利要求1所述的甘草无性快速繁殖方法，其特征在于，所述的步骤a无菌苗的培养和步骤b无菌苗的继代增殖中的在培养基上培养时，其培养温度和光照条件为：22±1℃、光强50～100μmol m–2s–1、光照12h/天。
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